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农业生物技术学报  2008年 16卷 1期  刊出日期:2008-02-01
 
专家论坛
绵羊高繁殖力主效基因的研究及应用
Research and Application of Major Genes for High Prolificacy in Sheep
储明星
2008, 16(1): 0-  | doi:  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF   (0 KB)  ( 252 )
摘要
繁殖性能是绵羊的重要经济性状。本文介绍了绵羊高繁殖力主效基因骨形态发生蛋白受体IB、骨形态发生蛋白15、生长分化因子9及其与绵羊高繁殖性能之间的关系以及高繁殖力主效基因FecB和FecXI的应用。
研究论文
马γ-干扰素单克隆抗体的制备及其特性的鉴定
Preparation and analysis of monoclonal antibodies against equine interferon-gamma
白宇 童铁钢 刘光亮 肖一红 王群 徐树兰 张维军 吴东来
2008, 16(1): 0-  | doi:  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF   (0 KB)  ( 249 )
摘要
摘要:将原核表达的重组马-干扰素成熟蛋白(mEIFN-)免疫BALB/c小鼠,经4次免疫后,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,以昆虫杆状病毒表达系统获得的重组马-干扰素作为检测抗原进行间接ELISA检测,共筛选到15个阳性细胞株。分别经过3轮亚克隆后,最终得到了12株能稳定分泌抗体的单细胞克隆株。利用间接免疫荧光(IFA)实验对12株单克隆抗体进行鉴定,结果证实所获得的12株细胞分泌的抗体均为针对马-干扰素的特异性抗体。单克隆抗体亚型鉴定结果显示,4株为IgG1、2株为IgG2a、3株为IgG2b、3株为IgM,而且所有单克隆抗体的轻链均为链。将此12株单克隆抗体分别与用原核系统分节段表达的重组马-干扰素GST-mEIFN-(1-84)、GST-mEIFN-(80-146)蛋白进行特异性ELISA检测,结果表明有7株单克隆抗体识别GST-mEIFN-(1-84),而另5株单克隆抗体与GST-mEIFN-(80-146)发生反应,说明所获得的12株单克隆抗体至少针对两个或两个以上不同的抗原表位。这将为今后建立马-干扰素检测方法、监测机体免疫状态和研究机体免疫机制奠定了基础。
口蹄疫病毒非结构蛋白3AB基因的可溶性表达与生物活性分析
Expression of Nonstructural Protein Gene 3AB of Foot-and-Mouth Disease virus and Analysis of its Bioactivity
祝秀梅;刘在新
2008, 16(1): 0-  | doi:  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF   (0 KB)  ( 208 )
摘要
通过设计特异性引物扩增得到完整的口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白(NSP)3AB基因,定向克隆到表达载体pET-30a中,获得了重组质粒pET-3AB,并转化大肠埃希氏菌BL21(DE3),重组菌分别在37℃和28℃条件下诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳鉴定,观察到37℃培养条件下目的蛋白形成包涵体,在28℃条件下培养目的蛋白以可溶性的形式表达。Western blotting分析表明,表达的目的蛋白能与FMDV感染牛血清发生特异性反应。以纯化的3AB蛋白作为抗原,采用间接ELISA模式检测了部分FMDV感染动物血清和健康动物血清,证明表达蛋白与FMDV感染血清有很好的反应而与健康动物血清无反应。该项研究为建立以3AB为抗原的FMDV NSP抗体检测ELISA方法奠定了基础。
白桦幼苗株高和地径的遗传效应分析
Genetic Effects of Seed and Seedling traits of Betula in Seedling Height and Seedling Diameterat Ground
李绍臣 杨传平 丁宝建 高福玲 刘桂丰 姜静 姜廷波
2008, 16(1): 0-  | doi:  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF   (0 KB)  ( 217 )
摘要
采用P(P -1)/2 完全双列杂交设计对6 个白桦优良个体生长性状进行一般配合力( GCA) 和特殊配合力(SCA) 分析,结果表明:2个性状同时受加性和非加性效应控制。同一亲本不同性状的一般配合力差异较大,同一性状在不同亲本间的一般配合力差异也比较大,在6个亲本中Q2 是最好的亲本,M2次之。同一性状不同组合和同一组合各性状的SCA 效应值均有较大差异,试验中苗高地径的特殊配合力最高的是8×Q1,苗高地径两个性状的一般配合力均高于特殊配合力,苗高地径的遗传力属于高强度遗传力,可以进行早期选择。
家蝇防御素抗菌肽Des-hf突变体的抑菌活性研究
Study on the Antibacterial Activity of Two Musca domestica Defensin Mutants
李鹏 仇妍虹 张秋伟 郑其升 曹瑞兵 陈德胜
2008, 16(1): 0-  | doi:  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF   (0 KB)  ( 196 )
摘要
采用PCR定点诱变技术,将家蝇防御素抗菌肽成熟肽段的基因(des-hf gene)倒数第九个氨基酸由甘氨酸(G)突变为带正电荷的精氨酸(R),构成第一个突变体des-hf-MU1。采用同样的方法在des-hf 基因的C端加上六个带有正电荷的赖氨酸(K),构成第二个突变体des-hf-MU2。采用毕赤酵母表达系统对上述两个突变体进行表达,抗菌特性表明表达产物对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌活性,根据琼脂孔扩散法检测des-hf-MU1和des-hf-MU2的抑菌效价比des-hf分别提高了2.4倍和8.0倍,且在PH值为5~6时活性最高,热稳定性实验显示des-hf-MU1、des-hf-MU2 100 ℃加热10min 后仍具有抑菌活性,这些充分显示了良好的应用前景。
爬行卫矛再生体系建立及根癌农杆菌介导的遗传转化研究
Establishment of Direct Adventitious Shoot Regeneration System and Genetic Transformation System of Euonymus fortunei var. Radicans Mediated by Agrobacterium tumefaciens
尚爱芹 赵梁军 田颖川
2008, 16(1): 0-  | doi:  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF   (0 KB)  ( 206 )
摘要
以爬行卫矛(Euonymus fortunei var. radicans)无菌苗下胚轴为外植体,在附加不同浓度植物生长调节的MS基础培养基上诱导培养,通过器官直接发生途径获得再生植株。结果表明,0.5mg/L BAP和0.01mg/L NAA组合的诱导效果最佳,其不定芽再生率高达92%,外植体平均不定芽数目为4.2个。将含有雪花莲凝集素基因(Galanthus nivalis agglutinin,GNA)的植物表达载体pBCGm导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404, 通过农杆菌介导法遗传转化爬行卫矛的下胚轴,经PCR和PCR-Southern检测,GNA基因已整合到转化植株的基因组中。遗传转化过程中,外植体不经预培养,菌液浓度OD=0.6,共培养3d,有利于获得最高遗传转化效率。
猪血凝性脑脊髓炎病毒PK细胞膜受体的鉴定
Identification of Hemagglutinating Encephalomyelitis Virus Receptor in PK Cells Membrance
陆慧君 贺文琦 常灵竹 陈克研 李志萍 高丰
2008, 16(1): 0-  | doi:  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF   (0 KB)  ( 242 )
摘要
在毕赤酵母中表达猪血凝性脑脊髓炎病毒(Hemagglutinating Encephalomyelitis Virus, HEV)67N株S蛋白片段,经镍离子亲和层析纯化后,四次免疫家兔,获得兔抗HEV-S蛋白特异性抗体;提取PK细胞膜蛋白,SDS-PAGE电泳后,转印NC膜,以纯化的S1蛋白代替病毒,利用改进的病毒铺覆蛋白结合试验(VOPBA)对PK细胞膜受体进行鉴定,结果发现在大约90kDa处有清晰的蛋白带,推测该蛋白可能是HEV感染PK细胞的结合位点。该结果为深入研究血凝性脑脊髓炎病毒的致病机制奠定理论基础。
应用两种策略克隆猪miRNAs let-7b及 let-7c
Cloning of porcine miRNAs let-7b and let-7c by two approaches
谢胜松 赵书红
2008, 16(1): 0-  | doi:  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF   (0 KB)  ( 212 )
摘要
MicroRNAs(miRNAs)为一类大小约22个核苷酸的非编码小分子RNA,它们能通过与靶mRNA 的3′UTR(非编码区)完全互补导致mRNA降解,或不完全互补结合阻断mRNA翻译。研究表明,miRNAs在动植物的生长发育,免疫调节,病毒感染等过程中发挥了重要作用。本文分别利用构建小RNA的cDNA文库和RNA加尾、引物延伸RT-PCR克隆法从猪骨骼肌中鉴定了miRNAs let-7b和let-7c,并综合比较了这两种方法的优缺点,为推动猪miRNA的克隆鉴定提供了新的策略。
鸡破骨细胞分化因子(chRANKL)的克隆、表达和活性分析
The cloning, expression and bioactivity analysis of chRANKL
王艳 侯加法
2008, 16(1): 0-  | doi:  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF   (0 KB)  ( 310 )
摘要
为探讨RANKL以及OPG/RANKL/RANK通路在笼养蛋鸡骨质疏松发生中的作用,进行鸡破骨细胞分化因RANKL(receptor activator of NF-κB ligand)的克隆、表达并鉴定其活性。以成骨细胞总RNA为模板,利用RT-PCR和SOE-PCR技术体外扩增RANKL 基因,将PCR产物克隆至组氨酸标签的融合蛋白表达载体pET-32a(+),在异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下,实现了chRANKL的有效表达,表达产物纯化后稀释成不同浓度梯度作用成熟破骨细胞观察其生物学活性。结果表明,凝胶电泳显示PCR扩增产物的长度为1200 bp左右,插入片段与Genebank上报道的鸡RANKL序列完全一致。重组表达载体转化BL21后经IPTG诱导获得大小约为64 Kd的重组蛋白,Western印迹表明重组蛋白具有抗原活性;并且纯化后的蛋白能刺激成熟破骨细胞,使骨吸收指数呈剂量依赖性增加,表明具有一定的活性。
皮肤特异表达c-Myc转基因小鼠的建立与分析
Establishment and analysis of transgenic mice with c-Myc gene specially expressed in the skin
李奎 任红艳 张兴举 杨述林 崔文涛 唐中林
2008, 16(1): 0-  | doi:  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF   (0 KB)  ( 204 )
摘要
以CMV-PAAV载体为基础载体,以皮肤特异人K14(人角蛋白14)基因启动子替换原质粒中的CMV启动子后,在其多克隆位点区依次插入鼠c-Myc基因的cDNA序列和gfp基因的编码序列,构建了高效表达c-Myc基因的真核表达载体。通过双原核显微注射技术,将线性化的载体DNA注入到C57BL/6小鼠受精卵的两个原核中,然后将注射后状态良好的胚胎移植到代孕鼠的输卵管中,共移植了256枚受精卵,6只受体怀孕,最终获得44只成年小鼠。通过PCR和Southern blot分析证明2只为阳性转基因小鼠,转基因阳性率为4%。Southern杂交结果分析显示外源片断是以多拷贝串联重复的形式整合到鼠染色体中
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子与生长抑素融合表达质粒(pGM-CSF/SS)的构建及其对小鼠的免疫
Construction and Immunization of Fusion-expression Plasmid Harboring Porcine GM-CSF and Somatostatin
舒邓群 茆达干 杨利国 曹少先 吴志敏
2008, 16(1): 0-  | doi:  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF   (0 KB)  ( 274 )
摘要
从猪真核表达质粒pGM-CSF通过PCR扩增出猪GM-CSF基因的编码序列,将GM-CSF基因亚克隆到生长抑素真核表达质粒pcS/2SS中,构建GM-CSF与生长抑素(SS)的融合表达质粒pGM-CSF/SS,酶切鉴定和DNA测序证实重组的融合表达质粒pGM-CSF/SS构建正确。选择30只小鼠,随机分为三组,其中1组为对照组,2组和3组分别肌肉注射pcS/2SS和pGM-CSF/SS,研究pGM-CSF/SS对小鼠的免疫效果。结果表明:GM-CSF可增强小鼠脾脏淋巴细胞的增殖能力,以pGM-CSF/SS组增殖能力最强,分别比对照组和pcS/2SS提高8.4%(P<0.05)。肌肉注射pcS/2SS和pGM-CSF/SS免疫小鼠均能有效激发免疫系统,产生较强的免疫应答,与对照组相比,生长抑素抗体P/N值都有所提高,且随着免疫时间的延长,呈现不断增高的趋势;pGM-CSF/SS组P/N在试验的各个时期均高于pcS/2SS组。阳性鼠的比例以肌注pGM-CSF/SS为最高,达60%,pcS/2SS肌注组为30%,对照组没有出现阳性鼠;这些结果证明,GM-CSF对生长抑素DNA疫苗有一定的免疫增强作用,为研究GM-CSF基因对生长抑素DNA疫苗的免疫增强作用提供了理论基础。
绵羊骨形态发生蛋白受体IB基因部分3′非翻译区的多态性分析
DNA polymorphism of partial 3′UTR of BMPR-IB gene in sheep
储明星
2008, 16(1): 0-  | doi:  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF   (0 KB)  ( 224 )
摘要
根据绵羊骨形态发生蛋白受体IB(bone morphogenetic protein receptor IB, BMPR-IB)基因部分调控区的mRNA序列设计3对引物,采用PCR-SSCP技术检测BMPR-IB基因部分3′非翻译区序列在4个绵羊品种(小尾寒羊、湖羊、特克塞尔和中国美利奴绵羊)中的单核苷酸多态性。结果发现引物P1扩增片段存在多态性,其余2对引物的扩增片段均不存在多态性。对于引物P1,只在湖羊中发现AA和BB两种基因型,其余3个品种均为AA型。测序表明BB型与AA型相比有2个碱基突变(121T→C和195T→C)。
藏猪氟烷基因PCR-RFLP和序列多态性分析
Study on the PCR-RFLP and Sequence Difference of Halothane Gene in Zang Pig
赵中权
2008, 16(1): 0-  | doi:  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF   (0 KB)  ( 234 )
摘要
本文应用PCR方法,体外扩增了94头藏猪的氟烷基因18149~18760位之间612bp的片段(包含完整的外显子17和cDNA C1843→T1843突变位点),采用HhaⅠ内切酶对扩增产物进行了酶切多态性分析,发现94头藏猪个体都呈现氟烷阳性。并对4个藏猪个体的氟烷基因的612bp片段进行序列测定,测定结果与GenBank中Brening公布的序列和帅素容测定的6个中国地方猪种氟烷基因序列的相同区段进行比较分析,结果表明,本文所测藏猪序列共发现2个变异位点,都发生在内含子区段,皆为转换型突变;在内含子16内有1个位点存在转换型杂合子。在4个藏猪个体中未发现cDNA C1843→T1843突变位点。
猪附红细胞体荧光定量PCR检测方法的建立及应用
Establishment and Application of Real-time TaqMan-quantitative PCR Assay for Detection of Mycoplasma suis (Eperythrozoon suis)
闫若潜 赵明军 盛敏 张志凌 张健 刘光辉 吴志明
2008, 16(1): 0-  | doi:  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF   (0 KB)  ( 203 )
摘要
摘要: 根据GenBank已登录的猪附红细胞体(M.suis)推测的功能性蛋白基因ORF2序列设计引物和TaqMan荧光探针,以定量的10倍系列稀释含M.suis部分ORF2基因的T载体重组质粒(pGEX-T/M.suis)为标准品,进行荧光定量PCR扩增并制作了标准曲线,经对荧光定量PCR的反应条件进行优化,建立了M.suis的TaqMan荧光定量PCR检测方法(Taqman FQ-PCR);对所建立的FQ-PCR检测方法进行了敏感性、特异性和重复性实验,并对疑似M.suis感染临床抗凝全血样品进行了检测应用。结果显示:标准曲线的曲线循环阈值与模板浓度有良好的线性关系,相关系数为0.998;所建立的FQ-PCR方法检测灵敏度可达10个拷贝/μL,比对照常规PCR灵敏度高100倍;FQ-PCR方法特异性高,对pGEX-T/M.suis重组质粒扩增呈现阳性反应曲线,而对8个对照细菌、病毒和寄生虫DNA扩增曲线均呈现阴性反应;对不同浓度的pGEX-T/M.suis重组质粒分别重复扩增2次,重复结果良好;用该方法对24份临床疑似M.suis感染样品进行了应用检测,结果有20份样品为阳性,阳性检出率高于常规PCR方法。
供体细胞不同来源和处理方式对牦牛异种克隆胚胎发育的影响
Effects of donors’ sex and different cell treatments on in vitro development of yak-bovine interspecies nuclear transfer embryos
刘颖 朱士恩 李荣 王莉莉 王海萍 丁方荣 李京 李松 戴蕴平
2008, 16(1): 0-  | doi:  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF   (0 KB)  ( 192 )
摘要
本文以黄牛卵母细胞胞质为受体,牦牛耳成纤维细胞为核供体进行体细胞核移植,研究供体细胞性别、细胞周期同期化处理方式及冷冻对牦牛异种克隆胚胎发育的影响。结果显示:雄性供体细胞的牦牛异种克隆囊胚发育率显著高于雌性供体细胞(56.6% vs 39.5%,P﹤0.05),但卵裂率和囊胚细胞数差异不显著;血清饥饿和接触抑制提供的供体细胞对牦牛异种克隆胚胎发育率和胚胎质量的影响没有明显差别;供体细胞冷冻后解冻组的克隆胚胎卵裂率明显低于新鲜消化组(54.5% vs 78.2%,P﹤0.05),但两组之间的囊胚率和囊胚细胞数没有显著差异。说明供体细胞的性别对牦牛异种克隆囊胚发育有影响,而同期化处理和细胞冷冻对牦牛异种克隆囊胚发育影响很少。
丁内酯-I对绵羊卵母细胞体外成熟和受精的影响
Effect of Butyrolactone I on in-vitroMaturation and in-vitro Fertilization of Ovine Oocytes
杨飞鸽 倪和民 郭 勇 刘烈琴 张 宏 刘云海
2008, 16(1): 0-  | doi:  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF   (0 KB)  ( 209 )
摘要
绵羊卵母细胞经丁内酯-I(BL-I)抑制培养,然后转入成熟培养液培养不同时间,进行体外受精并观察胚胎发育情况。结果:解除8h抑制再培养8h组处于MⅡ期卵母细胞比率6.38%显著低于其它组别(P<0.01)。继续培养16h、20h的卵母细胞成熟率与对照组差异不显著,培养24h组卵母细胞成熟率(70.83%)稍高于对照组(66.18%),但差异不显著(P>0.05)。培养16h、20h组囊胚率分别为2.99%、13.64%与对照组24.39%差异显著(P<0.05),培养24h组的囊胚率20.33%与对照组差异不显著(P>0.05)。结论:BL-I对绵羊卵母细胞的成熟抑制作用是可逆的,经BL-I处理后未能提高绵羊卵母细胞体外受精和胚胎的整体发育能力。
不同添加物对分离昆明系小鼠胚胎干细胞的影响研究
Investigation on Affects of Different Supplements in the Medium on Isolation and Culture of Embryonic Stem Cells from Mouse Embryos of Kunming Species
余树民 严兴荣 王 晗 窦忠英
2008, 16(1): 0-  | doi:  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF   (0 KB)  ( 220 )
摘要
本试验以昆明系小鼠胚胎为材料,以丝裂霉素(10μg/mL)处理的MEF为饲养层,研究了在ESCs培养液中分别添加KSR、FBS、FBS+PD98059 (50 μmol/L)对昆明系小鼠胚胎贴壁、ICM集落形成及ESCs分离培养的影响。结果表明,在添加KSR的ESCs培养液中,胚胎贴壁率显著低于添加FBS的ESCs培养液(P<0.05),但ICM集落形成率和1代ESCs集落出现率差异不显著(P>0.05),2~5代ESCs集落出现率显著高于添加FBS的ESCs培养液(P<0.05),2株ESCs被传到7代;在添加PD98059+FBS的ESCs培养液中,胚胎贴壁率、ICM集落形成率和1~5代ESCs集落出现率均显著低于添加KSR或FBS的ESCs培养液(P<0.05);用0.5 g/L胰酶+0.2g/L EDTA离散消化ICM细胞和ESCs并结合机械分割,1~5代ESCs集落出现率显著高于用2.5 g/L+0.2 g/L EDTA(P<0.05)。结论:在ESCs培养液中添加KSR,较添加FBS或FBS+PD98059更适合用于分离培养昆明系小鼠ESCs,用0.5g/L胰酶+0.2g/L EDTA离散消化ICM细胞和ESCs并结合机械分割优于用2.5 g/L+0.2 g/L EDTA。
小鼠极体重建卵母细胞的体外受精与发育
In Vitro Fertilization and Development of the Mouse oocytes reconstructed by First Polar Bodies
王公金
2008, 16(1): 0-  | doi:  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF   (0 KB)  ( 180 )
摘要
本实验分别以昆明系、ICR系和C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)C14-Y01-FM131Osb系小鼠(即转绿色荧光蛋白基因小鼠,简称荧光标记小鼠)为主要试验动物,探索其卵母细胞第一极体核重组卵母细胞的生殖功能。超数排卵后采集小鼠卵丘卵母细胞复合体(COCs),利用链霉蛋白酶酶解法分离出第一极体(PbI);以形态学和台盼蓝染色相结合的方法对不同温度保存条件下COCs中PbI进行活力鉴定和分级;采用显微操作术将PbI核供体注射到去核卵母细胞中,卵母细胞,进一步观察重建卵母细胞体外受精和体外培养发育能力。结果表明:注射hCG后12~14h回收的PbI活力最佳, 4℃条件下保存48h 后PbI仍保持活性;117枚昆明系和ICR系小鼠重建卵母细胞经体外受精获得13枚2-细胞胚胎, 38枚荧光标记小鼠的卵母细胞中有3枚卵裂成2-细胞胚胎。本研究初步证明小鼠第一极体重建卵母细胞可持续随后受精及其早期发育过程,为发掘和利用其它哺乳动物母本基因资源提供了参考依据。
安妥明对大鼠细胞色素酶P450 3A1的影响
Effect of Cytochrome P450 3A1 by Clofibrate in rats
马玉忠 刘玉芝 仲飞 钟秀会 贾敬亮
2008, 16(1): 0-  | doi:  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF   (0 KB)  ( 205 )
摘要
摘要: 安妥明处理大鼠的原代肝细胞,Western blot法和RT-PCR法检测孕烷受体(PXR)和细胞色素酶P450 3A1(CYP3A1)的表达情况。结果表明:安妥明可显著增强PXR的表达,该诱导作用可被放线菌素D所破坏。安妥明单独应用对CYP3A1无诱导作用,但与16α- 碳腈孕烷醇酮(PCN)联合应用可增强PXR和CYP3A1的表达。安妥明为过氧化物酶体增殖因子之一,它对PXR和CYP3A1的诱导作用为揭示其药物代谢的分子机制提供了帮助。
大熊猫生长激素基因Am-GH的表达载体构建及其表达研究
Construction of recombianant expression vector of Giant Panda (Ailuropoda melanoleuca) growth hormone Gene and Its Expression
朱睦元
2008, 16(1): 0-  | doi:  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF   (0 KB)  ( 205 )
摘要
植物反应器生产药品成本低,具有改变传统制药方法的光明前景。本研究 以PCR法克隆的大熊猫生长激素基因Am-GH,构建了原核表达载体pEGX-AmGH和植物表达载体pCAMBIA13011-GH。pEGX-AmGH转化E. coli得到高效表达。pCAMBIA13011-GH通过根癌农杆菌GV3101的介导转化烟草无菌叶片外植体,经过四轮潮霉素(Hygromycin, Hyg)递增筛选,获得抗性植株。其中部分Hyg抗性植株经GUS和PCR检测为阳性。鉴定结果表明Am-GH 已成功整合到烟草基因组中。为进一步探讨大熊猫生长激素基因Am-GH在烟草中的表达奠定了基础。
新铁炮百合遗传转化体系的建立及zm401基因的导入
Establishment of Regeneration System and Transformation of zm401 Gene in Lilium Longiflorum X L. formosanum
李邱华 洪波 仝征 杨英杰 马超 于静娟 高俊平
2008, 16(1): 0-  | doi:  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF   (0 KB)  ( 227 )
摘要
以培育无花粉百合新材料为目的,进行了新铁炮百合遗传转化技术的探索。结果表明,以新铁炮百合无菌苗小鳞片为外植体,在附加1.0 mg/L 6-BA 和1.0 mg/L NAA的MS基础培养基上诱导培养,通过器官直接发生途径获得再生植株,再生率达100%。农杆菌介导的遗传转化中,外植体预培养2 d,侵染5 min,共培养5 d,获得12‰的转化率。以此方法用玉米花药发育相关基因zm401转化受体材料,经PCR和PCR-Southern检测证实,zm401已经成功地整合到转化植株基因组中。该研究结果为获得无花粉百合中间材料奠定了基础。
根癌农杆菌介导的抗除草剂转基因甘薯植株的获得
Production of Transgenic Herbicide-Resistant Sweetpotato by Agrobacterium tumefaciens-mediated Transformation
刘庆昌 臧宁
2008, 16(1): 0-  | doi:  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF   (0 KB)  ( 184 )
摘要
以甘薯品种栗子香的胚性悬浮细胞为受体材料, 用根癌农杆菌介导法,获得了表达bar基因的抗除草剂转基因甘薯植株。农杆菌菌株LBA4404携带含有bar基因的双元载体pCAMBIA3300。共计450个胚性细胞团用于遗传转化。在添加2 mg/L 2,4-D、100 mg/L Carb和0.5 mg/L PPT 的固体MS培养基上选择培养8周后,得到了19个PPT抗性愈伤组织。将这19个抗性愈伤组织转移到添加1 mg/L ABA、100 mg/L Carb和0.5 mg/L PPT 的固体MS 培养基上,其中的10个抗性愈伤组织共再生出103株拟转基因植株。PCR分析表明,其中的69株为转基因植株。Southern blot分析表明,bar基因稳定整合到转基因植株的基因组中。除草剂喷洒试验结果表明,转基因植株具有高度除草剂抗性。
RNA干涉对马铃薯内源酸性转化酶活性的影响
Effects of RNAi on Regulation of Endogenous Acid Invertase Activity in Potato (Solanum tuberosum L.) Tubers
张迟 谢从华 柳俊 宋波涛 刘勋
2008, 16(1): 0-  | doi:  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF   (0 KB)  ( 186 )
摘要
酸性转化酶是植物体内降解蔗糖为还原糖(葡萄糖、果糖)的关键酶,而还原糖在马铃薯(Solanum tuberosum L.)低温贮藏中的快速积累是影响油炸加工品质的重要因素。为了实现对马铃薯块茎低温糖化的品质改良,本研究利用所克隆的酸性转化酶基因构建了RNA干涉载体,并转化马铃薯品种N2。经PCR、Northern鉴定,酸性转化酶基因的干涉片段已经成功导入马铃薯植株中。对干涉转基因株系的试管苗和试管薯的酸性转化酶活性进行测定,结果显示,植株的酸性转化酶的活性平均下降69.8%(Ni-1除外),最大降幅为78%(Ni-4),而试管薯的酶活性最大降幅为68%。与反义RNA的表现较好的转基因株系进行比较,RNA干涉对酶活的调节作用与之相当。研究结果表明,RNA干涉对马铃薯内源酸性转化酶活性的调节作用显著,这种转录表达的调控技术对马铃薯低温糖化改良具有良好的应用前景。
人参EST-SSR标记的建立
Development of EST-SSR Marker in Panax ginseng
杨成君 穆立蔷 李绍臣 刘关君 胡长群 王军
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摘要
从7055条人参EST序列中共搜索出791个SSR。根据引物设计标准,设计了68对EST-SSR引物。在合适的PCR反应体系下,分别以人参品种集安长脖、抚松二马牙的DNA为模板,对设计的EST-SSR引物进行筛选,发现有43对EST-SSR引物能扩增出产物。在9个人参品种、2个西洋参品种和2个刺五加品种中进一步对这些可扩增的引物对进行多态性检测,发现有26对引物显示多态性,占可扩增引物的60.47%,占设计引物总数的38.23%。本研究结果表明,根据人参EST建立EST-SSR标记是一种行而有效的的方法。
植物激活蛋白Ap36在苏云金芽胞杆菌的表达及抗病作用
Activator protein AP36 was expressed in Bacillus thuringiensis and its disease resistance
周臣飞 彭东海 邱德文 阮丽芳 陈守文 喻子牛 孙明
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摘要
以含有植物激活蛋白(Activator protein)基因ap36的质粒pMYE为摸板,设计一对特异引物,通过PCR反应扩增出激活蛋白基因开放读码框序列,使用XbaI和SphI双切PCR产物,插入到用这两酶双切的pBMB982-304质粒slh motif的下游,构建重组表达质粒pBMB0588,转化苏云金芽胞杆菌无质粒突变株BMB171。结果表明,目标蛋白以融合蛋白的形式成功表达。为探讨表达植物激活蛋白的重组菌是否能够诱导植物获得抗性,用重组菌在28℃培养24小时发酵液原液处理番茄幼苗和土豆片。结果显示,发酵液处理90min后,番茄叶片过氧化物酶(POD)和脯氨酸含量较对照分别提高了57.14%和131.59%;4d后苯丙氨酸解氨酶(PAL)含量较对照也有所提高;经重组菌发酵液处理的马铃薯片,对马铃薯软腐病表现出很强的抗病性。
重组水稻几丁质酶的发酵生产、纯化及酶学性质的研究
Study on the Production, Purification and Characteristics of the recombinant Chitinase from Rice
阎瑞香 吴仲 候建华 丁东风 李明刚
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摘要
用7L发酵罐对酵母工程菌株NB01进行了重组几丁质酶的诱导表达,通过提高通气量和调整搅拌转速,使溶氧维持在30%以上,NB01可在发酵84 h内达到产酶高峰,酶活最高可达48.0795 U/mL。利用中空纤维超滤膜对发酵液浓缩、提纯,再经过Sephadex G-100柱层析后得到单一组分的重组几丁质酶,酶纯度提高了 7.9961倍。研究结果还表明,该酶具有良好的热稳定性和耐酸性;在4℃条件下具有较好的贮藏稳定性。
抗菌肽模式肽PGYa的分子设计、克隆及在毕赤酵母中的分泌表达
The Molecular Design, Cloning of Model Antimicrobial Peptide PGYa and its Secreted Expression in Pichia pastoris
张建峰 蒋宗勇 唐兆新 王贵平 余永鹏 魏文康
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摘要
在α-螺旋抗菌肽序列比较和两亲性分析的基础上,提取序列模板,计算机辅助(螺旋轮法)设计出新型抗菌肽模式肽PGYa(Peptide以Gly开头,以Tyr-NH2结尾),然后选用毕赤酵母偏爱密码子,设计合成了PGYa基因(rPCR法)。所合成的基因全长为94bp,并在其N端引入kex2裂解位点,以保证表达抗菌肽具有天然N端。基因克隆入pPICZα-A质粒,构建分泌型酵母表达载体pPICZα-A-PGYa。在AOX1 (醇氧化酶)启动子调控下,PGYa蛋白获得分泌表达,其表达量达到132 mg/L。初步抑菌(E.coli DH5α)活性显示:PGYa有较好的抗菌活性。
蒙脱石载菌的条件优化及其影响因素研究
Optimization of Probiotics-loaded Montmorillonite and Its Influencing Factors Research
王彦波
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摘要
以天然硅酸盐蒙脱石为材料,附载了具有生物修复功能的复合益生菌并优化了构建条件。此外,研究了蒙脱石载菌的影响因素。结果表明,当蒙脱石重量为0.5g时,载菌量达到较恒定的状态,且随着益生菌浓度和体积的增大而增加。蒙脱石对益生菌的吸附能力随着pH值的升高而逐渐降低,不同离子强度条件下,呈现相同趋势。不同温度条件下,蒙脱石对益生菌的吸附率呈现出先升高后降低的趋势,当温度为30℃时吸附率最高为89.74%。这表明益生菌的吸附不仅依赖于生物体的生物化学属性和表面属性,也受到环境温度等条件的影响。
青枯菌II型分泌系统编码基因的克隆
Cloning of Gene Encoding Type II Secretory System of Ralstonia solanacearum
冯洁
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摘要
植物青枯菌II型分泌系统与致病蛋白的分泌密切相关。编码青枯菌II型分泌系统的gsp基因簇由12个基因组成,我们通过设计适合高GC%含量基因扩增的PCR反应体系,成功克隆了编码青枯菌II型分泌系统的全部12个gsp基因。分别将gsp基因连接到酵母双杂交系统的诱饵及捕获载体上,构建了gsp基因诱饵库和捕获库。经序列测定证明12个gsp基因读框正确,保障了其在酵母系统中的表达,为GSP蛋白之间的互作研究奠定了基础
我国主要棉花栽培群体的遗传多样性分析
Genetic Diversity Analysis on the Main Chinese Cultivated Varieties of 6 Cotton Populations with ISSR Markers
姜伟 朱宏波 何觉民
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摘要
摘 要:利用ISSR分子标记对我国44个棉花栽培品种(拟似为6个群体)进行遗传多样性分析。筛选出的11个引物在所有品种中共扩增出90条带,其中70条为多态性条带,多态性条带百分率(PPB)达76.1%,Popgene32软件分析结果表明,新疆种群的遗传多样性水平最高(PPL=91.43%,H=0.3769,I=0.5464),其次是中棉种群、河南种群,而河北、山东、山西3个种群的遗传多样性水平相差较小,6个棉花种群在其总的遗传变异中有82.42%的存在于群体内,群体间的遗传变异仅占总变异的17.58%,群体分化系数Gst=0.1759,群体间总的基因流的估算值Nm=2.34。由聚类分析可知,山西、山东、河北种群的亲缘关系最近,先聚合在一起,然后依次与河南、中棉所种群聚类,最后与亲缘关系最远的新疆种群聚合。
生物技术动态
ABA在生物胁迫应答中的调控作用
The Regulatory Role of ABA in plant Response to Biotic Stresses
黄荣峰 周金鑫
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摘要
植物激素ABA不仅调控非生物胁迫应答,而且在应对各种生物胁迫中发挥重要的调控作用。ABA负调控植物对生物胁迫的抗性主要是通过与水杨酸、茉莉素和乙烯信号传导途径的互作以及影响这些信号途径中的信号组分来实现的。文章综述了ABA信号转导途径及其在生物胁迫应答过程中的调控作用。
动物转基因方法技术研究新进展
n update on the development of techniques for making transgenic animals
施振旦 李万利
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摘要
动物转基因的关键限制因素是制备效率和精确性。本文介绍了近年发展的提高转基因效率的非定点整合转基因方法如睾丸转基因法、卵巢转基因法、RNA干扰;提高转基因精确性的定点整合转基因的胚胎干细胞、体细胞和原始生殖细胞基因打靶法;调控外源基因表达的时空表达和可控表达转基因策略。对这些新颖转基因方法的优缺点进行了讨论,并探讨如何利用这些方法进行转基因动物的制备。
研究简报
一种改进的Western blot法检测小鼠肺表面活性蛋白B
Improved Western Blot Detect Surfactant Protein B in Mice
高淑敏 温晓辉 杨荣荣 邸科前 李相运
2008, 16(1): 0-  | doi:  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF   (0 KB)  ( 279 )
摘要
烟草扭脉病毒部分基因组特征及其分类地位分析
Analysis of Partial Genome Structure of Tobacco Vein Distorting Virus and It’s Classification
李凡 兰平秀 程建勇 蔡红 陈海如
2008, 16(1): 0-  | doi:  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF   (0 KB)  ( 196 )
摘要
通过RT-PCR从烟草丛顶病发病烟株总RNA中获得烟草扭脉病毒(Tobacco vein distorting virus,TVDV)基因组部分序列。序列分析显示该片段全长1655bp,共包含TVDV的部分RdRp基因、完整的CP基因和完整的MP基因。其中RdRp基因与CP基因的间隔区(IR)长201nts,符合马铃薯卷叶病毒属病毒的归属依据;对RdRp、CP、MP基因以及IR序列的对比分析,显示了TVDV与黄症病毒科马铃薯卷叶病毒属病毒的较高同源性。根据三个ORF编码的氨基酸序列构建的分子同源树的分析,也都显示了TVDV与黄症病毒科马铃薯卷叶病毒属病毒的同源性最高,进一步证实了TVDV应该是黄症病毒科马铃薯卷叶病毒属的确定成员。
小麦种子过氧化物酶的纯化及其部分酶学性质研究
Purification and characterization of peroxidase from wheat seed
罗龙海
2008, 16(1): 0-  | doi:  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF   (0 KB)  ( 248 )
摘要
小麦全面粉水抽提液经醋酸酸沉淀,上清再经硫酸铵35%-75%分组沉淀,沉淀溶于pH5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液,经FPLC-SOURCE 30S 阳离子交换层析,FPLC-Superdex G-75凝胶过滤层析,纯化了小麦种子过氧化物酶(Wheat Seed Peroxidase),纯化酶的比活力为3912U/mg。在SDS-PAGE上显示出一条蛋白带,其分子量约为37 KD。光谱分析显示,在399nm处有一典型的Soret带,在495nm和636nm处有特征吸收,酶反应的最适pH在5.0左右,最适双氧水浓度为13mM/L,最适温度在40℃左右,有较好的耐热能力。
 
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