叶锈菌(Puccinia triticina, Pt)为专性寄生的病原真菌,侵染小麦(Triticum aestivum)引起的叶锈病是导致小麦减产的主要病害之一。本研究围绕小麦中的类钙调磷酸酶B样蛋白1 (calcineurin B‑like protein 1, CBL1)在小麦与Pt互作过程中的功能和作用机制展开研究,旨在为深入解析两者互作过程中的钙信号通路打下基础。首先分析了小麦与Pt互作的转录组数据库中TaCBL1的表达模式,然后利用qRT-PCR对其表达量进行验证,结合创制的病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)瞬时表达植株、RNA干扰(RNA interference, RNAi)和过表达(overexpression, OE)植株,分析TaCBL1在小麦与Pt互作过程中的功能,进一步通过qRT-PCR检测了TaCBL1基因沉默或过表达对致病相关基因(pathogenesis-related genes, PRs)表达的影响,并利用二氨基联苯胺(diaminobenzidine, DAB)染色观察了TaCBL1沉默或过表达对H₂O₂的影响。结果显示,接种Pt后不亲和组合中TaCBL1的表达水平在6和12 h显著升高(P<0.05),不亲和组合中TaCBL1的表达量显著高于亲和组合(P<0.05);通过VIGS和RNAi技术降低TaCBL1的表达水平,导致Pt发育的吸器母细胞(haustorial mother cells, HMCs)数量与对照组相比有所增加,而在TaCBL1过表达植株中发现Pt的发育受到显著抑制(P<0.05)。本研究明确了TaCBL1在小麦抵抗Pt侵染过程中发挥正向调节作用,为理解钙信号在病原菌侵染过程中的调控机制提供了新的证据,为深入系统地解析TaCBL1正向调控小麦抗锈病的分子机制提供了基础,同时亦丰富了以信号传导途径为核心的抗病育种思路。

挖掘水稻(Oryza sativa)耐盐基因,解析其分子调控机理,培育耐盐新品种是水稻应对盐胁迫最经济有效的途径之一。本研究以水稻品种'9311'和以'9311'为受体所创制的长雄蕊野生稻(O. longistaminata)耐盐导入系IL363为材料,利用RNA-seq对苗期盐胁迫(0.75% NaCl)处理3和5 d的植株进行全基因组转录组分析,结果表明,以未处理为对照,'9311'在盐胁迫3和5 d后检测到的差异表达基因分别有2 090和6 219个,IL363分别有169和2 535个,IL363早期差异表达基因少。GO富集分析结果表明,差异表达基因富集在结合和催化活性、代谢过程和细胞过程等功能类别。KEGG富集分析结果显示,对照组差异表达基因主要富集在MAPK、代谢途径等通路,处理组差异表达基因主要富集在植物激素信号转导、次生代谢物的生物合成等通路。根据全基因组芯片检测结果及注释信息,在筛选的53个可能与材料间耐盐性差异相关的重要功能基因中挑选出15个位于导入染色体区段以及4个与盐胁迫相关的重要功能基因,进行了结构变异分析,发现19个基因中,10个基因存在外显子区变异,9个基因仅在非编码区表现出变异。本研究为进一步解析水稻耐盐机理提供了理论依据,为水稻抗盐育种提供耐盐相关基因。

粒型是水稻(Oryza sativa)产量与品质形成的核心农艺性状,粒厚作为粒型的关键组成部分,直接影响稻谷千粒重及稻米加工品质。微小RNA (microRNAs, miRNAs)作为重要的转录后调控因子,在植物生长发育中扮演关键角色。本研究以粒型调控为切入点,利用CRISPR/Cas9技术成功创制了水稻miR2871a功能缺失突变体。系统的表型分析揭示,该突变体在多种环境下均表现出稻谷与糙米的粒厚、千粒重显著降低(P<0.05),同时伴随精米垩白粒率显著上升(P<0.05)。组织细胞学观察发现,突变体颖果糊粉层发育严重受损,表现为细胞层数减少、厚度变薄及发育进程延迟。多元素含量测定表明,糊粉层结构的缺陷直接导致糙米中锌、锰、钙等关键矿质元素的积累量显著下降(P<0.05)。转录组测序(RNA-seq)分析表明,差异表达基因显著富集于硫胺素代谢等与糊粉层功能密切相关的生物合成通路。本研究揭示了miR2871a在水稻粒厚及糊粉层发育中的关键调控作用,为水稻粒型与营养品质的协同遗传改良提供了新的重要基因资源。

AP2/ERF (APETALA2/ethylene responsive factor)转录因子家族作为植物最大的转录因子家族之一,广泛参与植物的生长发育及逆境胁迫响应。本研究以马铃薯(Solanum tuberosum)品种'大西洋'为材料,克隆获得马铃薯乙烯响应因子89 (ethylene-responsive factor 89, StERF89)基因(GenBank No. XM_006365280),其CDS长为891 bp。生物信息学分析显示,该基因不含内含子,启动子区含有干旱胁迫响应相关的顺式作用元件。组织特异性分析发现,该基因在马铃薯块茎中的表达量最高,其次是叶片。在自然干旱处理条件下,随着干旱胁迫程度的加深,StERF89基因表达水平呈现上升趋势,表明该基因可能参与干旱胁迫响应。进一步分析发现,木质素合成相关基因马铃薯Dirigent蛋白31 (dirigent protein 31, StDIR31)的启动子区含有2个DRE/CRT元件,且该基因在干旱胁迫下的表达趋势与StERF89基因相似。通过酵母单杂交实验、双荧光素酶报告基因实验以及β-葡萄糖醛酸苷酶(β-glucuronidase, GUS)染色实验,进一步证实StERF89能够直接结合StDIR31启动子区并正向调控其表达。本研究为深入探究StERF89转录因子的调控功能提供了重要依据。

β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase, BGLU)是植物激素调控与逆境响应的关键酶类。本研究以辣椒(Capsicum annuum)自交系'17CL30'为实验材料,克隆获得辣椒β-葡萄糖苷酶21基因(C. annuum β-glucosidase 21, CaBGLU21)(GenBank No. PX753275.1),并对其进行生物信息学、表达模式及启动子顺式作用元件分析。结果表明,CaBGLU21编码1个含406个氨基酸的稳定碱性亲水蛋白,具有Glyco_hydro_1保守结构域和多个潜在磷酸化位点。系统进化分析表明,CaBGLU21与番茄(Solanum lycopersicum)、烟草(Nicotiana tabacum)、枸杞(Lycium ferocissimum)等茄科植物BGLU蛋白亲缘关系最近。启动子分析结果显示,CaBGLU21含有光响应、激素响应(MeJA, ABA, SA)及逆境胁迫相关的顺式作用元件。qRT-PCR结果显示,CaBGLU21受ABA、JA、IAA、GA₃、H₂O₂、NaCl、高温和低温等多种处理的显著诱导,在12 h左右表达量达到峰值。研究结果初步表明CaBGLU21可能在辣椒响应激素信号与非生物胁迫中发挥重要作用。本研究为深入解析该基因的功能提供参考,也为辣椒抗逆育种提供了候选基因资源。

MADS-box转录因子家族广泛参与植物果实成熟、细胞壁重塑及质地调控,在果肉硬度维持与软化过程中发挥核心作用,但该家族在西瓜(Citrullus lanatus)果肉硬度调控中的分子机制尚不明确。为探究MADS-box基因对西瓜果肉硬度的调控作用,本研究以硬果肉品系'51'和软果肉品系'1338'西瓜的果肉组织为材料,通过转录组筛选与qRT-PCR验证,获得了与果肉硬度相关的候选基因ClMADS37,并对其进行了基因克隆、生物信息学分析及表达特性鉴定。结果表明,ClMADS37开放阅读框全长1 176 bp,编码391个氨基酸,为酸性稳定亲水蛋白,亚细胞定位于细胞核。表达分析显示,ClMADS37在果肉中的表达量与硬度呈显著正相关(r=0.7558),且在茎中表达量最高,在叶片中最低。启动子区域含多种光响应与激素响应元件。综上所述,ClMADS37可能参与西瓜果肉硬度的正向调控,本研究为西瓜果实质地改良与分子育种提供理论依据与基因资源。

Ⅲ类过氧化物酶(class Ⅲ peroxidase, PRX)在植物逆境响应及免疫调控中具有重要作用。为探究PRX在二烯丙基二硫(diallyl disulfide, DADS)诱导烟草(Nicotiana tabacum)抗青枯病过程中的表达模式与功能,本研究基于前期转录组数据(NCBI登录号: PRJNA1470963),对烟草PRX基因家族进行系统鉴定与分析。结果共鉴定到19个NtPRX基因,不均匀分布于12条染色体上,编码蛋白均含分泌型过氧化物酶结构域,启动子区域富含激素、光响应及逆境相关顺式作用元件。系统进化、保守结构与共线性分析表明,NtPRX基因家族在进化上存在一定的保守性与功能分化趋势。进一步结合DADS处理后接种青枯菌(Ralstonia solanacearum)条件下的烟草根系和叶片转录组数据,并通过qPCR进行验证。结果显示,DADS处理可提前诱导NtPRX4、NtPRX9、NtPRX11、NtPRX13和NtPRX19等基因在根与叶中高水平表达,并显著增强接菌后叶片过氧化物酶(peroxidase, POD)活性。综上,DADS可能通过调控关键NtPRX基因的表达时序,激活烟草对青枯菌的抗氧化与防御反应,从而增强对青枯病的抗性。本研究为DADS诱导植物抗病性的分子机制提供了理论依据。

FT (FLOWERING LOCUS T)基因家族在调控植物花芽分化中具有关键作用,且在多种植物中高度保守。本研究通过生物信息学方法对普通烟草(Nicotiana tabacum)中的FT基因家族进行鉴定与系统分析,包括基因结构、保守基序、染色体定位、顺式作用元件及表达模式等。结果表明,在烟草中共鉴定出11个FT基因家族成员(NtFT),分布于3条染色体上,主要位于低基因密度区域。所有成员均含motif 1和motif 4基序,73%的成员(8/11)具有4个外显子和3个内含子的保守结构。启动子顺式作用元件分析显示,激素反应元件(25.9%)和光响应元件(44.7%)占比较高。组织特异性表达分析表明,多数NtFT基因在叶片中高表达,仅NtFT-09在芽和花中特异性表达。利用qRT-PCR技术检测在不同发育时期各基因的表达量发现,NtFT-01、NtFT-02、NtFT-05和NtFT-06在中心花开放期表达量显著上调(P<0.05),其表达模式与启动子区光周期和激素响应元件的富集高度相关;NtFT-09则呈现早期花芽分化阶段的特异性调控特征。最终筛选出NtFT-01、NtFT-02、NtFT-05和NtFT-06作为驱动生殖生长的核心候选基因,以及NtFT-09作为花芽分化的潜在调控因子。本研究为深入解析烟草开花时间的分子调控机制提供了关键基因资源,并为后续通过基因编辑靶向调控NtFT基因家族成员表达及创制抗早花烟草新种质提供了参考。

花青素合成酶(anthocyanidin synthase, ANS)催化无色原花青素合成有色花青素。为探究不同花色紫薇(Lagerstroemia indica)的LiANS基因的特性,本研究以白色、粉色、紫色和红色紫薇品种为研究材料,克隆了LiANS基因。通过多序列比对、构建进化树、同源建模、原核表达检测融合蛋白LiANS-His₆、 qPCR以及启动子克隆等,分析了不同品种LiANS的特性。结果表明,紫薇LiANS基因的ORF序列长度为1 068 bp,编码 355 个氨基酸。通过序列比对和进化树的分析,在4个品种中总计获得4种LiANS等位基因变异。通过同源建模以及纯化的3种LiANS-His₆ 酶活显示,这些变异不改变酶的活性。qPCR显示,LiANS基因在紫薇枝条的上、中、下3个不同部位的叶片和花发育的5个时期均表达,但表达模式不同;花青素总体在花瓣发育S3期最高,其中,红色花瓣紫薇'红火球'在盛开期和衰退期(S3和S4)均维持较高水平的表达,基因表达量与总花青素含量不完全呈现正相关性;启动子序列分析表明,4个品种存在3种启动子的等位变异,具有不同的G-box元件以及MYB结合位点,白色花品种'绯白' proANS缺失195 bp。本研究为不同花色紫薇分子育种提供了基因资源,为进一步揭示其调控机理提供基础。

分支链氨基酸转氨酶1 (branched-chain-amino-acid aminotransferase 1, BCAT1)是分支链氨基酸(branched chain amino acids, BCAAs)分解代谢与转运过程中的关键酶。本研究旨在获得BCAT1基因CDS序列,并初步探究该基因对奶山羊(Capra hircus)乳腺上皮细胞乳蛋白合成的影响。以奶山羊乳腺上皮细胞为材料,克隆BCAT1基因CDS区,对其序列进行生物信息学分析,并构建pcDNA3.1-BCAT1过表达载体,探究BCAT1基因对乳腺上皮细胞乳蛋白合成的影响。结果表明,BCAT1基因CDS区全长为1 161 bp,编码386个氨基酸;BCAT1蛋白分子量为43 173.42 D,理论pI值为5.05,不存在跨膜结构,无信号肽,为携带负电荷的疏水性稳定蛋白;蛋白互作分析表明,BCAT1蛋白与分支链酮酸脱氢酶E1亚基α (branched chain keto acid dehydrogenase E1 subunit alpha, BCKDHA)和BCKDHB等蛋白存在相互作用关系;组织表达谱分析结果表明,BCAT1基因在干奶期乳腺组织表达水平相对较高。乳腺上皮细胞转染过表达BCAT1基因重组载体后,乳蛋白相关基因β-乳球蛋白(beta-lactoglobulin, BLG)(P<0.01)、αS1-酪蛋白(casein alpha S1, CSN1S1)(P<0.05)、β-酪蛋白(casein beta, CSN2)(P<0.05)和κ-酪蛋白(casein kappa, CSN3)(P<0.05)基因的表达均显著升高;说明,BCAT1基因对山羊乳腺上皮细胞中乳蛋白合成具有调控作用。本研究结果为深入研究BCAT1基因在山羊乳蛋白合成的调控机制提供理论依据。

警犬(Canis lupus familiaris)作为高负荷工作的功能犬之一,在日常训练和执行任务中通常需要完成繁重的工作,伴有耐力下降和繁育障碍等问题的发生。本研究采用响应面分析法优化对牛骨肽(bovine bone peptide, BBP)提取工艺,进而探讨BBP对疲劳训练比格犬抗疲劳生殖损伤的影响研究。本研究将比格犬平均分为4组,Normal组(正常饲养, 不做训练),Model组(力竭训练),BBP-L组(力竭训练+5 g/kg BBP),BBP-H组(力竭训练+10 g/kg BBP)。比格犬进行为期4周的BBP补充和下坡跑训练,跑台坡度为20°,速度为30 m/min,每天30 min,每周5 d。在实验进行4周后,进行无负重30 min力竭游泳实验。实验结束时,对实验犬进行采血,并摘除睾丸,检测附睾内精子质量;测量比格犬血清中血糖、尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、乳酸(lactic acid, LA)、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase, LDH)含量;测量睾丸匀浆中丙酮酸激酶(pyruvate kinase, PK)、琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase, SDH)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)含量;检测肝脏与肌肉组织中肌糖原和肝糖原含量;最后对实验犬睾丸组织进行HE和免疫组化染色,分析BBP对睾丸组织形态学和紧密连接蛋白(zonula occludens-1, ZO-1)的影响。结果表明,当蒸煮5 h、酶解pH为10、酶解温度55 ℃、酶解时间6 h时BBP的提取率最高,为(35.12±1.25)%。精子质量与氧化应激指标结果显示,训练犬经力竭训练后总精子数、精子密度、精子活力和SOD含量均极显著降低(P<0.01),MDA含量极显著升高(P<0.001),补充BBP后,相应指标出现逆转。血清生化指标结果显示,训练犬经力竭训练后血糖、肝糖原、肌糖原、SDH和PK指标均显著降低(P<0.01),BUN、LA和LDH指标均显著升高(P<0.01),补充BBP后,血糖、肝糖原、肌糖原、SDH和PK指标均显著升高(P<0.01),BUN、LA和LDH指标均显著下降(P<0.01)。组织病理切片结果显示,训练犬经力竭训练后睾丸组织支持细胞间隙增大,组织细胞疏松,并伴有生精小管畸形现象的发生,ZO-1表达量显著下调(P<0.01),补充BBP后,ZO-1表达量极显著回升(P<0.01)。本研究对于改善警犬在勤务处置与高强度训练中出现的耐力衰减、繁殖机能障碍等问题具有重要应用价值。

高脂血症是一类由脂质代谢紊乱引起的血脂异常疾病,严重影响人体健康。甾醇具有降血脂、抗癌、抗氧化等多种重要生理活性。为提高菌核侧耳(Pleurotus tuber-regium)液态发酵甾醇产量,本研究通过单因素试验与响应面法优化培养基配方,并利用胆酸盐结合能力与人肝癌细胞系(human hepatoblastoma G2, HepG2)高脂细胞实验评价甾醇提取物的降脂活性。结果表明,最佳培养基为果糖52.51 g/L、玉米蛋白3.14 g/L、MgSO₄ 0.14 g/L,在此配方下甾醇产量高达362.25 mg/L,比优化前提高了105.70%。2.0 mg/mL甾醇提取物对胆酸钠、牛磺胆酸钠、甘氨胆酸钠与混合胆酸盐的结合率均显著高于1.0 mg/mL提取物(P<0.05),分别为阳性对照考来烯胺的86.21%、86.05%、89.76%与87.56%。5.0 μg/mL提取物使HepG2高脂细胞的总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇含量分别下降26.95%、71.42%、38.40%;脂质分解与转运基因CPT1、PPARα、ABCG5分别上调437.30%、235.85%、71.79%,脂质合成、吸收基因SREBP2、NPC1L1、ACAT2分别下调36.32%、33.10%、17.53%,胆固醇合成限速HM-CoA酶基因HMGCS1、HMGCR分别下调47.31%、20.80%。综上,菌核侧耳甾醇提取物不仅胆酸盐结合能力较强,能有效干预胆固醇吸收,并通过多靶点显著影响脂代谢相关基因表达,降脂活性较高。本研究可为菌核侧耳降血脂产品的开发提供依据。

油茶(Camellia oleifera)籽油脱臭馏出物富含植物甾醇、维生素E及不饱和脂肪酸等高价值类脂成分,但直接作为饲料添加剂存在分散性差、生物利用率低等瓶颈。在饲用抗生素逐步受限的背景下,通过微生物固态发酵技术对其功能成分进行定向生物转化,已成为开发绿色饲用添加剂的重要途径。为开发替代饲用抗生素的绿色饲料添加剂并实现茶油脱臭馏出物(camellia oil deodorizer distillate, CODD)的高值化利用,本研究以豆粕、麸皮为发酵载体,接种蝉拟青霉(Paecilomyces cicadae)对CODD进行固态发酵,采用非靶向代谢组学结合多元统计分析、KEGG通路富集及拓扑学与网络分析,系统解析CODD发酵前后类脂代谢的差异特征与调控机制。结果显示,发酵组与对照组代谢谱呈现明显分离,类脂差异代谢物的表达模式可归纳为4大功能类群：黄酮类化合物的全面上调(如白杨素增幅超4倍),甾体代谢物的双向调控(抗炎性孕烷类上调而惰性甾酮下调),促炎前列腺素的统一下调以及萜类化合物的显著上调。机制研究揭示,角质、软木脂和蜡的生物合成、类固醇激素生物合成及花生四烯酸代谢构成3条核心类脂代谢通路。FELLA (functional enrichment analysis and visualization using sparse network-based activity diffusion)网络进一步解析了甘油二酯和磷脂酰乙醇胺等核心化合物节点、脂解酶与酰基转移酶为关键酶靶点的跨通路协同调控机制。综上,蝉拟青霉发酵通过将CODD中的惰性植物甾醇预转化为高活性C21甾体、将橙皮素等前体黄酮定向重构为白杨素等抗炎黄酮类化合物,提升了发酵产物的抗炎与抗氧化功能。本研究为CODD的资源化利用及绿色饲料开发提供了理论依据。

结肠癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一,临床上亟需开发安全有效的治疗性疫苗,以诱导机体产生特异性抗肿瘤免疫应答。Wilms瘤抗原1 (Wilms tumor 1, WT1)在多种实体瘤中高表达,而在正常组织中表达受限,是理想的肿瘤相关抗原。本研究以减毒单增李斯特菌双突变株(Listeria-based live attenuated double substitution, LADS)为载体构建WT1重组疫苗LADS-WT1,并建立稳定表达WT1蛋白的小鼠(Mus musculus)结肠癌细胞系CT26-WT1,用于评估LADS-WT1的特异性抗肿瘤治疗效果。体外生长分析显示,重组菌株LADS-WT1在脑心浸液肉汤培养基(brain heart infusion, BHI)中的增殖动力学与亲本LADS菌株基本一致,表明外源抗原的插入未显著影响其体外生长能力。此外,溶血实验结果表明,LADS-WT1在液体培养中溶血活性明显降低,提示其毒力相关蛋白李斯特溶血素O (listeriolysin O, LLO)的功能受到抑制,安全性进一步提升。将LADS-WT1疫苗通过尾静脉分别注射至CT26和CT26-WT1荷瘤BALB/c小鼠体内,动态监测肿瘤生长和免疫应答变化。结果显示,在使用LADS-WT1疫苗全程治疗20 d后,与CT26荷瘤小鼠相比,CT26-WT1荷瘤小鼠的肿瘤增长速率更为缓慢,且肿瘤体积显著低于前者,说明LADS-WT1疫苗能抑制表达WT1的结肠癌肿瘤细胞的增殖。流式细胞术分析显示,经LADS-WT1疫苗免疫后,CT26-WT1荷瘤小鼠脾脏中CD4⁺ T细胞和CD8⁺ T细胞比例升高,表明该疫苗可有效激活机体细胞免疫应答。综上所述,LADS-WT1疫苗通过细胞免疫应答发挥抗结肠癌作用,为表达WT1的其他肿瘤提供治疗策略。

猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus, PDCoV)是一种肠道冠状病毒,可引起新生仔猪(Sus scrofa)急性水样腹泻、呕吐及脱水,感染后肠绒毛萎缩、隐窝增生,破坏肠道屏障功能,导致高致死率并造成严重经济损失。Occludin作为紧密连接关键蛋白,参与维持上皮屏障及信号转导。本研究以猪睾丸(swine testicular, ST)细胞为模型,使用Western blot及qRT-PCR检测PDCoV感染对Occludin表达水平的影响。结果显示,随着PDCoV感染时间的增加,宿主细胞中Occludin基因及其蛋白水平均显著下调(P<0.01),提示PDCoV感染与Occludin表达下调存在相关性。为进一步明确Occludin在病毒复制中的功能,通过过表达和短发夹RNA (short hairpin RNA, shRNA)干扰技术分别上调和敲低Occludin的表达。结果显示,Occludin基因过表达能够极显著促进PDCoV感染(P<0.0001),而敲低Occludin基因则极显著抑制PDCoV感染(P<0.0001),表明Occludin是与PDCoV复制相关的关键宿主因子。使用网格蛋白抑制剂Pitstop 2及巨胞饮抑制剂5-(N-乙基-N-异丙基)阿米洛利(ethyliso propylamiloride, EIPA)进行干预。结果表明,两者均可显著减弱Occludin过表达对PDCoV感染的促进作用。本研究阐明了Occludin通过网格蛋白和巨胞饮途径正调控PDCoV入侵的过程,为深入解析PDCoV的致病机制及制定靶向宿主因子的防控新策略提供了重要理论依据。

N⁶-甲基腺苷(N⁶-methyladenosine, m⁶A)作为真核生物mRNA中最普遍的转录后修饰,广泛参与基因表达调控。甲基转移酶样3 (methyltransferase-like 3, METTL3)是m⁶A修饰的核心催化酶,通过介导m⁶A修饰调控基因表达,进而显著影响畜禽的生长发育、脂肪代谢、免疫反应及抗病性等关键生理过程。本文对METTL3基因的分子结构、功能及其在畜禽肌肉发育、脂肪代谢、胚胎发育、免疫性能及抗病性能调控方面的最新进展进行综述,为畜禽遗传改良提供理论支持和潜在的分子干预靶点,为推动畜禽生产效益的持续提升提供参考。

蝴蝶兰(Phalaenopsis spp.)遗传背景复杂、体外再生困难,传统稳定遗传转化效率低,制约其基因功能研究与分子育种。病毒载体介导的瞬时转化技术为解决该问题提供了有效途径。本研究以'紫水晶'蝴蝶兰为材料,比较建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus, CymMV)、烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus, TRV)和甘蓝卷叶病毒(Cabbage leaf curl virus, CaLCuV) 3种载体介导的蝴蝶兰瞬时遗传转化效率。通过农杆菌(Agrobacterium tumefacien)注射法将携带八氢番茄红素脱氢酶基因(phytoene desaturase, PDS)的重组载体导入叶片,以其沉默所引发的光漂白表型及基因表达量分析评估3个载体沉默效率,结果表明,3种载体的表现存在显著差异,其中pCymMV的转化效率最高,接种后4周即在注射叶出现褪色,7周后新叶白化,且PePDS表达量呈近乎线性的下降趋势。综上,pCymMV是介导蝴蝶兰瞬时转化的最适载体。本研究为蝴蝶兰基因功能分析及分子育种提供了高效的技术支撑。

小反刍兽疫(Peste des petits ruminants, PPR)是一种病毒源性急性烈性动物传染病,该病接触传染性极强,山羊(Capra hircus)和绵羊(‌Ovis aries‌)等小反刍动物最易感。为制备小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus, PPRV)的核衣壳(nucleocapsid, N)蛋白多克隆抗体,为PPRV致病机制和疫病防控研究提供生物学材料,本研究基于PPRV强/弱毒株N基因序列,利用SEMA和IEDB在线生物信息学分析软件,筛选并分析优势抗原表位。通过重叠PCR分别扩增强弱毒株N基因的优势抗原区域并将其进行串联。将串联的N基因优势抗原表位基因通过BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点克隆至pET-28a载体,构建原核表达质粒pET28a-PPRV-2N。将测序正确的原核表达质粒转化至大肠杆菌(Escherichia coli) Rosetta感受态细胞中进行诱导表达并优化条件。纯化的靶蛋白与佐剂乳化后免疫BALB/c小鼠(Mus musculus),制备多克隆抗体,并对该抗体的反应性进行鉴定。经PCR克隆获取的串联2N基因片段长约1 607 bp,和预期大小一致。构建的重组表达菌经IPTG诱导后可成功表达目的蛋白,该蛋白主要以包涵体形式存在,分子质量大小约为60 kD,且在30 ℃,IPTG浓度为1 mmol/L,诱导14 h时的表达量最佳。目的蛋白经变性、复性和纯化后免疫BALB/c小鼠,3次免疫后采集血液并分离血清,最终获得多克隆抗体。该多克隆抗体与PPRV蛋白免疫印迹抗体效价达1∶10 000。ELISA结果表明,纯化的2N蛋白与阳性血清具有良好的反应活性。本研究成功获得表达产物2N重组蛋白,制备的小鼠多克隆抗体针对N蛋白及病毒均表现出良好免疫反应性,可为PPRV致病机理的后续深入探究提供理论和技术支撑。