长期以来,我国黄淮及北部地区的普通小麦(Triticum aestivum)种植遭受干旱胁迫严重。小麦根系构型(root system architecture, RSA)相关性状与营养元素和水分的吸收和转运息息相关,对于小麦高产和稳产至关重要。因此,挖掘小麦RSA相关性状遗传位点,并开发可用分子标记对于小麦高产和稳产育种具有重要意义。本研究测定了'豆麦'/'石4185'重组自交系(recombinant inbred lines, RIL)群体中的根尖平均直径(average root diameter, ARD)、根体积(total root volume, TRV)和根干重(root dry weight, RDW) 3个重要RSA相关性状。通过小麦90K SNP芯片对RIL群体和亲本进行了基因分型。利用全基因组连锁分析分别鉴定到2个ARD (QARD.caas-2B和QARD.caas-6A)、2个RDW (QRDW.caas-2A和QRDW.caas-5B)和1个TRV (QTRV.caas-3A)相关遗传位点,分别解释6.25%~7.59%、7.21%~10.30%和7.59%的表型变异。其中,QARD.caas-6A、QRDW.caas-2A和QTRV.caas-3A是新发现位点。QRDW.caas-5B的优异等位基因来自于'豆麦',而QARD.caas-2B、QARD.caas-6A、QRDW.caas-2A和QTRV.caas-3A的有利等位基因来自'石4185'。根据小麦参考基因组序列信息,在目标区段鉴定出5个候选基因,分别与植物激素调节、耐逆反应和信号转导相关。开发并验证了1个竞争性等位基因特异性PCR (kompetitive allele specific PCR, KASP)标记Kasp_2A_RDW (QRDW.caas-2A),该标记与小麦根系干重显著有关,并对115个小麦高代品系进行了基因分型。本研究为优化小麦根系构型,提升小麦耐逆性,选育高产稳产品种提供了新的基因和可用KASP标记。

NAC (NAM, ATAF1/2, CUC2)转录因子是植物特有的一类转录因子超家族,在植物发育生长和逆境胁迫响应方面发挥重要作用。本研究从甘蓝型油菜(Brassica napus)中克隆得到BnaNAC069基因,序列分析和系统发育分析显示,BnaNAC069的氨基端有1个经典的NAC结构域,羧基端包含1个跨膜结构域,是1个典型的膜结合NAC转录因子,与拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的AtNTL13/ANAC069亲缘关系最近。亚细胞定位分析显示,BnaNAC069定位于内质网膜上;表达模式分析表明,高盐(NaCl)、水杨酸(salicylic acid, SA)、过氧化氢(H₂O₂)处理可以显著诱导BnaNAC069的表达。表型分析发现,anac069拟南芥突变体植株对高盐胁迫耐受,过表达BnaNAC069的甘蓝型油菜对干旱和高盐敏感。qRT-PCR结果表明,BnaNAC069抑制脱水诱导(responsive to dehydration)基因BnaRD29B和BnaAREB1 (ABA responsive element binding protein 1)的表达水平,表明BnaNAC069可能通过ABA依赖的途径负调控植物对干旱和盐胁迫的响应。本研究为深入探讨甘蓝型油菜中BnaNAC069基因在调控对干旱和高盐逆境过程中的作用机制提供了基础资料。

二酰基甘油激酶(diacylglycerol kinase, DGK)是脂质信号通路中的关键酶,在植物激素信号传导、生物和非生物胁迫中起着重要作用。本研究参考模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中AtDGKs蛋白序列以及DGK保守结构域信息,分析马铃薯(Solanum tuberosum)中StDGKs基因的序列特点,对此多基因家族进行序列克隆和分析,并对其在干旱和盐胁迫响应以及马铃薯块茎发育中的表达模式进行分析。结果表明,从马铃薯基因组数据库(S. tuberosum group Phureja DM1-3 v6.1)中检索出11个StDGKs,并成功克隆出其中6个基因StDGK1、StDGK2、StDGK5、StDGK6、StDGK7和StDGK8。序列分析结果显示,6个StDGKs基因全长为1 460~2 220 bp,序列比对相似性超过95%。实时荧光定量PCR结果显示,6个StDGKs的表达均受到干旱和盐胁迫诱导,干旱处理下,与对照组相比,StDGK2、StDGK8在12 h、StDGK6在4 h的表达量达到峰值;盐胁迫处理下,StDGK1、StDGK5、StDGK7的表达量在4 h达到峰值,StDGK2、StDGK6在15 min达到峰值。此外,本研究发现,StDGKs可能在马铃薯块茎发育初期发挥重要作用,StDGK1、StDGK8在块茎发育早期至中期的表达量逐渐升高,在块茎膨大后期又缓慢下降。本研究为深入解析StDGK基因家族功能提供基础资料。

C3H转录因子属于锌指蛋白(zinc finger protein, ZFP)家族,在植物应对生物和非生物胁迫中发挥重要作用。为了探究C3H基因在蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)中的潜在功能,本研究从蒺藜苜蓿R108中克隆MtC3H基因(GenBank No. NC_053045.1)全长序列,该基因CDS全长672 bp,编码223个氨基酸。进化树分析显示MtC3H蛋白与鹰嘴豆(Cicer arietinum)和豌豆(Pisum sativum)亲缘关系较近。表达模式分析表明,MtC3H在蒺藜苜蓿茎中的表达量最高,根次之;该基因能够响应外源激素赤霉素(gibberellin, GA)、生长素 (indole acetic acid, IAA)和茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)的诱导,且对MeJA的诱导更敏感。亚细胞定位分析显示,该蛋白定位在细胞核和细胞质。酵母表达分析表明,MtC3H蛋白不具有毒性,存在转录自激活活性。本研究为深入探究MtC3H基因的作用提供了参考。

低温是限制葡萄(Vitis vinifera)产业高质量发展的主要胁迫因子。叶片表皮蜡质与植物抗逆性有重要关联,但其在低温胁迫响应中的生物学功能及合成途径尚不清晰。蜡酯合成酶1 (wax ester synthase 1, WSD1)催化产生表皮蜡质的重要组成成分蜡酯,在表皮蜡质合成过程中具有非常重要的作用。本研究首先以24个不同抗性葡萄种质为材料,分析叶片表皮蜡质与葡萄抗寒性之间的关系。结果发现,抗寒葡萄品种叶片表皮蜡质含量明显高于敏感品种,低温能够促进葡萄叶片表皮蜡质各组分含量升高,其中蜡酯类和烷烃类物质增加明显,且抗寒品种升高幅度大于敏感品种,表明叶片表皮蜡质与葡萄抗寒性之间具有正相关性。以耐寒葡萄品种'左优红'为材料,克隆获得受低温胁迫诱导的VvWSD1(GenBank No. XM_002263373.5),对其进行生物信息学分析和表达特性分析,并以转基因拟南芥为材料研究其与叶片表皮蜡质合成和植株抗寒性的关系。结果显示,VvWSD1 cDNA全长为1 545 bp,编码514个氨基酸;VvWSD1在葡萄茎、叶、芽和果实等组织中均有表达,成熟叶中表达量最高。VvWSD1受低温胁迫诱导,并且抗寒葡萄品种中的表达量显著高于敏感品种。在低温胁迫下,瞬时过表达VvWSD1葡萄叶片表皮蜡质积累明显增多;过表达VvWSD1后转基因拟南芥植株生长明显优于野生型,叶片表皮蜡质积累增加,叶片失水率和叶绿素浸出下降,细胞膜相对透性、丙二醛(malondialdehyde, MDA)和活性氧(reactive oxygen species, ROS) 含量显著低于野生型,植株抗寒性增强,表明VvWSD1介导叶片表皮蜡质积累参与葡萄低温胁迫应答。本研究为阐明叶片表皮蜡质形成及合成酶基因参与植物低温胁迫响应的分子机制奠定了理论基础,对实现葡萄抗寒栽培和种质资源选育具有重要意义。

柑橘黄龙病严重制约柑橘(Citrus spp.)产业的发展,黄龙病菌(Candidatus Liberibacter asiaticus)诱导柑橘韧皮部活性氧迸发导致细胞坏死,过氧化氢酶(catalase, CAT)是清除过氧化氢的关键酶。为明确甜橙(C. sinensis) CsCAT2基因(GenBankNo. XM_006473731)的表达模式,本研究克隆了CsCAT2的启动子,对CsCAT2启动子上顺式作用元件的分布进行分析,并利用截短的方法构建不同长度的CsCAT2启动子突变体,使用不同激素处理分析CsCAT2启动子活性的变化。结果表明,CsCAT2启动子序列中含有15个生物及非生物胁迫、激素信号响应相关的顺式作用元件;CsCAT2启动子全长具有最强的启动活性,截短突变体活性随长度减少而降低;脱落酸、茉莉酸、生长素、赤霉素和水杨酸处理显著提高CsCAT2启动子的活性,而乙烯利处理显著抑制了CsCAT2启动子的活性。本研究为深入解析甜橙过氧化氢酶基因CsCAT2的调控机制提供了数据支撑,丰富了柑橘与黄龙病菌互作过程中活性氧清除代谢的相关理论。

脂肪细胞定向和分化因子1 (adipocyte determination and differentiation factor 1, ADD1)是一类重要的真核生物转录因子,在调控脂质代谢过程中发挥重要作用,其在绵羊(Ovis aries)尾部脂肪沉积过程中的作用机理尚不明确。本研究以ADD1为候选基因,寻找与绵羊尾部脂肪沉积相关的遗传多态性位点并用于遗传分子标记。选择98只藏羊和264只阿勒泰羊为研究对象,2个品种各30份血液样本,混合后分别构建DNA混池,对ADD1基因所有外显子区域进行扩增,对筛选到的突变位点进行基因分型,利用Haploview 4.2软件进行连锁不平衡分析。结果显示,绵羊ADD1基因第二外显子上存在3个SNP位点,分别是g.73 C>T,g.154 C>T和g.270 C>T,且处于Hardy-Weinberg平衡状态。遗传多态性分析发现,g.154 C>T位点属于中度多态;在g.270 C>T位点上CC和TT基因型在阿勒泰羊和藏羊中差异显著(P<0.05),且CC型是阿勒泰羊的优势基因型,TT型是藏羊的优势基因型;连锁不平衡分析发现,g.154 C>T和g.270 C>T之间存在强连锁,构成3种单倍型,其中单倍型CC的频率最高,是阿勒泰羊的优势单倍型,藏羊的优势单倍型是TC型。因此,ADD1基因g.270 C>T位点TT基因型可作为绵羊瘦尾选育的重要候选分子标记,为绵羊选育工作提供了参考依据。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)具有促进组织修复、激活细胞因子分泌、调节机体免疫、道德伦理约束性低等特点,能为兽医临床上多种复杂病症提供有效治疗手段。目前,MSCs培养常采用含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的培养液,高昂的血清成本限制了MSCs的批量生产与应用。本研究中,密度为70%的MSCs分别用含有0.5%~10% FBS的α-MEM培养基处理,分别在6、12、18、24和48 h收集细胞,进行Giemsa染色、5-乙炔基-2'脱氧尿苷(5 ethynyl-2' deoxyuridine, EDU)染色和细胞迁移实验。结果显示,2% FBS的血清饥饿(serum starvation, SS)处理6 h能促进MSCs的体外迁移能力。对12只糖尿病犬(Canis lupus familiaris)静脉移植1×10⁷ MSCs和SS-MSCs,监测犬的血糖与体重变化,治疗后2周进行血清学与组织学检查。结果显示,SS-MSCs组实现了与正常培养环境相似的治疗效果,包括恢复糖尿病犬的血糖和体重、重塑胰岛、提高肝脏葡萄糖代谢能力。本研究为临床大规模制备药用级MSCs提供了可行的策略,提高了MSCs在临床疾病治疗中的应用价值。

血管紧张素转换酶2 (angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)可作为多种病理生理过程的保护剂和调节剂,以及人冠状病毒的功能性受体,但在鸡(Gallus gallus domesticus)中的研究尚未见报道。本研究以白羽肉鸡为研究对象,首先通过PCR扩增ACE2基因编码区,与原核表达载体pET32a连接,构建鸡ACE2原核表达体系。然后以异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)诱导ACE2蛋白表达并优化诱导条件,确定其表达方式。氯化钾(KCl)染色切胶纯化获得的鸡ACE2重组蛋白,并通过SDS-PAGE和Western blot鉴定表达蛋白的特异性和分子量,管式凝胶等电聚焦(isoelectric focusing polyacrylamide gel electrophoresis, IEF-PAGE)确定其等电点(pI)。以该纯化的ACE2重组蛋白作为抗原免疫大鼠(Rattus norvegicus)制备鸡ACE2多克隆抗体,测定其效价,并对其特异性等进行验证,利用该抗体明确鸡体内ACE2的组织分布和细胞学定位。结果显示,成功构建了鸡pET32a-ACE2原核表达体系,目的蛋白最佳表达条件为1 mmol/L IPTG诱导10 h,以包涵体形式存在;获得了具有良好抗原性和特异性的鸡ACE2重组蛋白,分子量约为105 kD,pI为5.01;成功获得了具有较好特异性的鼠抗鸡源ACE2多克隆抗体,抗体效价为1∶12 800;明确在白羽肉鸡心脏、肝脏、肺脏、肾脏、腺胃、十二指肠、回肠、盲肠、空肠、直肠、睾丸组织中均有ACE2的分布表达,本研究为ACE2在鸡中的进一步研究提供了实验依据和资料。

玉米赤霉烯酮(zearalnone, ZEN)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivaleno, DON)是谷物饲料污染中最常见的共生霉菌毒素。本研究旨在探讨长期摄入低剂量ZEN和DON污染饲粮对肉鸡(Gallus gallus domesticus)健康的损害及甘草(Glycyrrhiza uralensis)提取物对肉鸡肝脏损伤的保护作用。选用1日龄雄性良凤花鸡315只,随机分为3组,分别饲喂基础饲粮(对照组)、添加5%霉变玉米(Zea mays)饲粮(污染组)和污染组饲粮添加0.1%甘草提取物饲料(甘草组)。实验期为84 d。屠宰实验和肝脏石蜡切片HE染色结果显示,污染组28和56日龄肉鸡肝脏指数显著提高(P<0.05),肝细胞出现水肿、气球样变性及部分凋亡;实时荧光定量PCR检测结果表明,污染组肉鸡肝脏髓样分化因子88 (myeloid differentiation factor 88, MYD88)、白细胞介素12α (interleukin 12α, IL-12α)、核因子-κB1 (nuclear factor κB1, NF-κB1)和FOS原癌基因(FOS protooncogene, c-FOS)等炎症相关基因及肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)和NADPH氧化酶2 (NADPH oxidase 2, NOX2)等细胞凋亡相关基因的表达显著提高(P<0.05),血红素氧合酶1 (heme oxygenase 1, HO-1)的表达显著降低(P<0.05);饲粮添加甘草提取物后,肝脏指数显著回落(P<0.05);肝组织形态正常,炎症和凋亡相关基因表达显著回落(P<0.05)、HO-1表达回升(P<0.05)。ELISA试剂盒检测结果显示,污染组血清促炎细胞因子IL-2、干扰素γ (interferon, IFN-γ)和TNF-α含量显著增高,免疫因子IgA和IgG含量显著降低(P<0.05);添加甘草提取物后,促炎细胞因子水平显著回落(P<0.05),同时免疫因子水平显著回升(P<0.05)。利用生化检测试剂盒对肉鸡血清和肝脏中抗氧化酶进行检测,结果显示,污染组超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)活性显著降低(P<0.05)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量显著提高(P<0.05),同时,肝脏GSH-Px和SOD1基因表达显著降低(P<0.05);添加甘草提取物后,肝脏抗氧化酶活性及其编码基因表达、血清GSH-Px活性显著回升(P<0.05),28日龄血清及56和84日龄肉鸡肝脏MDA含量显著回落(P<0.05)。综上所述,长期摄入低剂量ZEN和DON污染饲粮可损害肉鸡的抗氧化和免疫功能,诱导炎症反应和肝细胞凋亡,饲粮添加甘草提取物可起到有效的缓解作用。本研究为利用药用植物及其提取物防控长期摄入低剂量霉菌毒素对肉鸡生产的危害提供了依据。

青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii)是一类特有的耐低温耐盐碱性高原裂腹鱼类,重金属胁迫是限制其溯河洄游产卵繁育的主要非生物胁迫之一。为探讨Cd²⁺和Zn²⁺胁迫对青海湖裸鲤的急性毒性作用、抗氧化能力及非特异性免疫机能的影响,本研究采用静水生物测定法确定不同浓度Cd²⁺和Zn²⁺胁迫青海湖裸鲤24、48、72和96 h的半致死浓度(lethal concentration for 50%, LC₅₀)及安全浓度(safe concentration, SC);通过酶标仪测定Cd²⁺和Zn²⁺胁迫后其鳃、肾脏和肝脏组织中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)、酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)的活性,并用qPCR检测NF-κB相关免疫基因转化生长因子β激活激酶1 (transforming growth factor β-activatrd kinase 1, TAK1)、IκB抑制因子激酶α (inhibitory nuclear factor kinase-κB α, IKKα)、核因子κB抑制因子α (inhibitor nuclear factor-κB α, IκBα)、核转录因子κB (nuclear transcription factor-κB, NF-κB)、白细胞介素8 (interleukin 8, IL-8)、锌指蛋白A20 (A20)和肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor α, TNF-α)的相对表达量。结果显示,Cd²⁺胁迫青海湖裸鲤幼鱼24、48、72和96 h的LC₅₀分别为1.455、1.022、0.579和0.428 mg/L;Zn²⁺胁迫青海湖裸鲤幼鱼24、48、72和96 h的LC₅₀分别为4.634、2.797、1.843和1.157 mg/L;Cd²⁺和Zn²⁺的SC分别为0.004 3和0.115 7 mg/L,毒性大小为Cd²⁺>Zn²⁺。青海湖裸鲤的肾脏和肝脏中SOD和CAT活性对Cd²⁺和Zn²⁺胁迫有不同程度的响应,但较高浓度Cd²⁺胁迫24 h时鳃组织中SOD和CAT的活性较高;胁迫后的鳃和肾脏中ACP活性显著降低(P<0.05),鳃和肝脏中AKP活性显著降低(P<0.05);在鳃、肾脏和肝脏中TAK1、IκBα、NF-κB和IL-8的表达量显著上调(P<0.05),而IKKα、A20和TNF-α表达量相对较低,尤其在肝脏中表现更为明显。由此可知,Cd²⁺和Zn²⁺胁迫均可诱导青海湖裸鲤产生氧化应激和炎症反应,激活鱼体抗氧化防御系统和非特异性免疫系统,调控免疫机制来应对不良环境。本研究可为深入探讨重金属胁迫下青海湖裸鲤的生理响应分子机制和青海湖裸鲤的人工增殖放流工作提供依据。

歪头病是黑斑侧褶蛙(Pelophylax nigromaculata)养殖中危害最大的病症之一,该病死亡率高、传染性强,给蛙类养殖造成了巨大损失,且目前对该病无有效防治手段。针对目前黑斑侧褶蛙的养殖现状,急需探明歪头病的致病机理,以减少黑斑侧褶蛙的养殖风险。本研究对12只患歪头病的黑斑侧褶蛙进行病原菌分离,得到1株优势菌HBG0512,取患病和健康黑斑侧褶蛙的脑及肝脏组织进行转录组测序。获得了差异表达基因,对其进行GO和KEGG分析,并采用实时荧光定量PCR验证基因表达水平。研究结果显示,从患病黑斑侧褶蛙分离的HBG0512菌株为米尔伊丽莎白菌(Elizabethkingia miricola);转录组测序发现患病与健康黑斑侧褶蛙的脑与肝脏组织各有212和612个差异基因;GO富集分析发现了肝脏内质网相关基因的异常表达及脑组织促炎因子的积累;KEGG通路分析揭示,导致内质网应激的激活转录因子6 (activating transcription factor 6, ATF6)异常表达,脑部炎症反应则可能是由IgE/FcεRI通路介导发生。患歪头病黑斑侧褶蛙的肝脏及脑部均有炎症反应发生,肝脏内质网感受器ATF6基因显著下调,内质网折叠反应能力下降,未折叠蛋白聚集导致了内质网应激,致使炎症反应发生;脑部主要通过IgE/FcεRI介导的炎症反应,导致血脑屏障通透性破坏,引起细菌性歪头病的发生。本研究通过转录组学揭示了黑斑侧褶蛙歪头病的致病机理,为蛙类及其他两栖爬行动物的疾病防治提供参考。

微囊藻毒素(microcystins, MCs)是水华爆发时蓝藻(Cyanobacteria)产生的一类天然毒素,能够诱发水生动物多种病理损伤,对水产经济动物健康养殖构成了巨大威胁。本研究旨在探讨虾青素(astaxanthin, AX)对微囊藻毒素-LR (MC-LR)胁迫下凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)肝胰腺组织结构变化、抗氧化指标和抗菌肽基因表达的影响。选取平均体重(0.5±0.1) g的凡纳滨对虾1 800尾,随机分为3组(对照组, MC组和MC+AX组),每组3个重复,对照组和MC组投喂基础饲料,MC+AX组投喂AX含量100 mg/kg的饲料,饲喂30 d。第30 d结束后,对照组继续投喂基础饲料,MC组投喂添加MC-LR (100 μg/kg)的饲料,MC+AX组投喂MC-LR (100 μg/kg)+AX (100 mg/kg)的饲料,继续饲喂15 d,在添加MC-LR后0、5、10和15 d时,每个重复随机取10尾虾,采集肝胰腺,观察组织结构变化并测定抗氧化指标和抗菌肽基因表达动态。结果表明,MC组凡纳滨对虾肝胰腺的结构严重受损,肝小管出现萎缩,上皮细胞与基膜分离,肝小管间结缔组织溶解,缝隙变大,星形官腔形状异常,而MC+AX组凡纳滨对虾肝小管排列较整齐,细胞形态较正常,表明AX可以减轻MC-LR对肝胰腺结构的损伤。与对照组相比,MC组超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase enzyme, AKP)、酸性磷酸酶(acid phosphatase enzyme, ACP)、溶菌酶(lysozyme, LZM)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)的活性呈现先升高后降低的趋势,过氧化氢酶(catalase, CAT)和丙二醛(malondialdehyde, MDA)的活性逐渐升高,相比于MC组,MC+AX组SOD、CAT、GSH-Px、AKP、ACP、LZM和LDH的活性显著升高(P<0.05),MDA的含量显著降低(P<0.05)。与对照组相比,MC组Penaeidin 3和抗脂多糖因子(anti-lipopolysaccharride factor, ALF)基因表达量先升高后降低,在第5天均达到最大值,分别是对照组的1.35倍和1.31倍,显著高于对照组(P<0.05),在第10、15天达到最小值。crustin基因表达量呈逐渐下降趋势,在第15天达到最小值,是对照组的0.3倍,显著低于对照组(P<0.05)。与对照组相比,MC+AX组Penaeidin 3、crustin和ALF基因表达量显著升高(P<0.05),分别在第5、10和第5天达到最大值,是对照组的1.93倍、1.46倍和2.9倍。综上,在饲料中添加AX增强了凡纳滨对虾的抗氧化能力,有效缓解了MC-LR毒害作用。本研究为开展健康养殖和相关功能性饲料的研发提供理论基础。

抗冻蛋白(antifreeze proteins, AFPs)是一类大分子蛋白质,可以与冰晶表面结合,以抑制冰晶的生长。毕赤酵母(Pichia pastoris)是一种可以表达外源蛋白的系统,可利用甲醇作为碳源进行表达获得目的蛋白。为获得高产量的具有活性的抗冻蛋白,选取昆虫雪蚤(Hypogastrura harveyi)抗冻蛋白(HhAFP),通过PCR在目的基因的5'端和3'端添加XhoⅠ、XbaⅠ酶切位点,并且在目的基因3'端添加6×His标签,将目的基因通过转化的方式添加至适用于毕赤酵母表达系统的表达载体pPICZαA中,成功构建重组表达载体pPICZαA-HhAFP。将pPICZαA-HhAFP转入毕赤酵母表达菌株X-33中,于29 ℃培养箱培养,通过博来霉素(zeocin)和甲醇筛选出2株阳性酵母转化子。将这2株酵母菌进行诱导表达,在29 ℃、250 r/min、pH 6.0的条件下,使用含1%甲醇的BMM培养基培养72 h。获得的酵母上清液进行亲和层析纯化和透析浓缩,通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF/TOF)分析,验证该蛋白为重组蛋白HhAFP。将重组蛋白HhAFP加入细胞冻存液检测其抗冻活性,结果表明,HhAFP可以显著提高冻存细胞复苏后的存活率,减少细胞损伤。通过进一步优化HhAFP的表达条件,确定培养温度为28 ℃,甲醇浓度为1.5%,表达培养72 h获得的重组蛋白HhAFP可达527 mg/L。该研究为通过毕赤酵母高产量表达具有活性的抗冻蛋白、实现抗冻蛋白的产业化提供了技术途径。

茶源微生物接种发酵可改善绿茶品质和口感,从而为绿茶加工和处理提供新的思路。本研究利用从茶(Camellia sinensis)鲜叶分离得到的菌株—副黄假单胞菌(Pseudomonas parafulva) T1和汉斯德巴氏酵母菌(Debaryomyces hansenii) T12对绿茶进行纯种液态发酵,采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用技术(ultra high performance liquid chromatography - quadrupole time-of-flight mass spectrometry, UHPLC-QTOF-MS)对发酵前后绿茶样品进行非靶向代谢组学分析,共筛选出118个标志性差异代谢物;T1发酵后含量显著提高的差异代谢物有黄嘌呤、茶碱和3-甲基黄嘌呤,咖啡碱和可可碱显著减少;T12发酵后含量显著提高的差异代谢物有没食子酸、儿茶素、表儿茶素、没食子儿茶素、表没食子儿茶素和茶黄素,表没食子儿茶素没食子酸酯和水解单宁显著减少。通过KEGG数据库进行代谢通路富集分析,结果表明,T1菌发酵绿茶中的代谢通路主要富集于乙醛酸和二羧酸代谢、苯丙氨酸代谢、苯丙素的生物合成和咖啡碱代谢,T12菌发酵绿茶中的代谢通路主要富集于酪氨酸代谢、鞘脂类代谢、丙氨酸、黄酮和黄酮醇生物合成和花青素合成。因此,茶源微生物发酵使晒青绿茶的代谢物组成和含量发生了显著变化。本研究为绿茶发酵加工定向设计和功效评价提供参考依据。

粘细菌(myxobacteria)是一类具有独特地位的高级原核生物,其代谢产物丰富、多样。致病疫霉(Phytophthora infestans)是马铃薯(Solanum tuberosum)晚疫病的病原菌,每年造成我国马铃薯产业损失10%~30%,粘细菌具有显著的拮抗致病疫霉活性,因此从粘细菌代谢产物中筛选具有拮抗致病疫霉的活性物质具有重要研究价值。本研究从鄂尔多斯地区的土壤样品中分离粘细菌,并检测分离菌株的拮抗致病疫霉活性,通过形态学及分子生物学方法对菌株进行鉴定,并通过正交实验设计探究菌株产抗致病疫霉活性物质的最适发酵条件以及添加大孔树脂吸附对粘细菌代谢产物活性的影响。结果表明,分离到的菌株E10具有高抗致病疫霉活性,抑菌圈直径为26 mm,菌落呈现出圆形扩展、边缘波浪状,子实体为黄色或橙红色,呈山脊状突起,有珊瑚状分枝,该菌株为弱小珊瑚球菌(Corallococcus exiguus),MD1培养基为菌株最适发酵培养基,32 ℃、NaCl浓度为0、发酵11 d为菌株最适发酵条件,添加大孔树脂可以有效吸附发酵液中抗致病疫霉活性物质并增加活性产物的合成从而增加其抑菌能力。该研究对抗马铃薯晚疫病及生物农药的研发具有重要的意义。

籽用西葫芦(Cucurbita pepo)是新疆主要的经济作物之一,病毒危害可导致其产量和品质严重下降,明确病原是进一步防治的基础。本研究从新疆石河子市采集表现花叶症状的籽用西葫芦叶片样品,在电子显微镜下观察到750×11 nm呈弯曲线状的马铃薯Y病毒属(Potyvirus)病毒粒子。提取病毒的双链RNA (double-stranded RNA, dsRNA),采用随机引物对病毒进行RT-PCR,得到弥散条带XHL2-1、XHL2-2和XHL56,在NCBI数据库中Blast搜索比对发现,XHL2-1和XHL56与小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus, ZYMV)对应区段的序列相似性分别为92.22%~98.69%和96.21%~99.64%;XHL2-2与西瓜花叶病毒(Water melon mosaic virus, WMV)对应区段的序列相似性在89.38%~98.45%;表明籽用西葫芦花叶病可能是由ZYMV和WMV侵染所致。进一步设计合成ZYMV和WMV的特异性引物,对15个供试样品进行RT-PCR,回收编号为SH2、SH12和SH13的ZYMV特异性扩增片段进行测序分析,结果表明,扩增片段之间的序列相似性超过99.29%,与GenBank中收录的ZYMV的序列相似性为96.09%~99.56%;编号为SH1、SH9和SH11的WMV特异性扩增片段之间的序列相似性超过94.30%,与GenBank中收录的WMV的序列相似性为94.74%~100%;进一步证明新疆籽用西葫芦花叶病是由ZYMV和WMV的复合侵染所致。系统进化树分析表明,侵染新疆籽用西葫芦的ZYMV与来源于东欧、印度等区域的分离物处于同一分支,WMV与来源于中国、法国等区域的WMV分离物亲缘关系较近。本研究明确了ZYMV和WMV的复合侵染是导致新疆籽用西葫芦花叶病害的主要病原,为进一步防治该病害提供理论依据。

实时荧光定量PCR (real-time fluorescence quantitative PCR, qPCR)是研究基因转录水平调控的常用方法,但其准确性依赖于合适的内参基因对数据进行归一化处理。为筛选出冷、旱胁迫及脱落酸(abscisic acid, ABA)、氟啶酮(fluridone, FLU)(ABA抑制剂)处理下藜麦(Chenopodium quinoa)中稳定表达的内参基因,本研究采用GeNorm、Normfinder、BestKeeper、ΔCt法和RefFinder等5种统计工具对9个候选内参基因进行评估。结果表明,冷、旱胁迫下的最佳内参基因为三磷酸鸟苷酶3 (GTPase 3, GTP638)和26S蛋白酶体(26S proteasome, PRN483);ABA和氟啶酮处理下的最佳内参基因为PRN483和二肽基羧肽酶(dipeptidyl carboxypeptidase, DCP894);冷、旱胁迫及ABA、氟啶酮处理下的最佳内参基因为泛素结合酶E2 (ubiquitin-conjugating enzyme E2, UBC822)和PRN483;管家基因肌动蛋白(β-actin, ACT878)在冷、旱胁迫及ABA、氟啶酮处理下的稳定性最差。利用9-顺式-环氧胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase, NCED185)和氧化还原酶(oxidoreductase, OXI802)基因表达模式验证候选内参基因的可靠性,结果显示,以UBC822或PRN483为内参基因时,NCED185和OXI802具有相似的表达模式,均表现出对冷、旱胁迫及ABA、氟啶酮处理的响应;以ACT878为内参基因时,NCED185和OXI802没有表现出对不同处理的响应。本研究为藜麦基因表达分析提供了适合的内参基因,为开展相关分子机制研究提供了技术支持。

家禽基因编辑广泛应用于家禽生产实践,如提高家禽生产性能、抗病育种与载体疫苗研发、改善动物福利、改善禽蛋消费的安全性、在禽蛋中生产药用蛋白等。目前,家禽基因编辑仍然依赖传统的体外或体内原始生殖细胞(primordial germ cells, PGC)途径,编辑效率低下。体外直接对精子进行基因编辑,即精子转染辅助的基因编辑(sperm transfection assisted gene editing, STAGE),有望提高基因编辑效率,而电穿孔是安全、经济和简便的精子转染方法。本研究在不同电穿孔条件下,将Cy-3标记的DNA导入广西麻鸡(Gallus gallus)精子细胞,使用计算机辅助精液分析系统(computer assisted sperm analysis system, CASA)评估精子动力学参数,通过荧光显微镜和流式细胞术评估精子细胞膜和顶体完整性、线粒体膜电位和外源DNA吸纳效率,筛选最佳电穿孔条件。结果显示,在优化的电穿孔条件(100 V, 5 ms, 5次脉冲)下,精子细胞对外源DNA吸纳效率达57.1%,与受精能力相关的精子前进运动性、顶体完整性和线粒体膜电位无明显变化,只有精子总运动性和细胞膜完整性显著下降(P<0.05),对精子损伤最小。本研究为电穿孔介导的STAGE在家禽基因编辑中的应用提供理论依据。

选择合适的内参基因是qRT-PCR的关键步骤,但关于荷叶离褶伞(Lyophyllum decastes)内参基因的筛选研究还尚未见报道。本研究以荷叶离褶伞的不同后熟时间(45, 55和65 d)、子实体不同发育时期(原基, 幼菇, 子实体)和不同菌盖形态(正常, 畸形)为实验材料,选择在食用菌研究中6个常用的基因：细胞色素c氧化酶亚基1 (cytochrome c oxidase subunit 1, Cox1)、ATP酶(ATPase)、葡萄糖-6-磷酸异构酶(glucose-6-phosphate isomerase, PGI)、蛋白磷酸酶2A (protein phosphatase 2A, PP2A)、DNA指导的RNA聚合酶亚基2 (DNA-directed RNA polymerase subunit 2, Rpb2)和泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzyme, UBC),以及4个鲜有报道的基因：含TCP1伴侣蛋白亚基-2 (chaperonin containing TCP1, subunit 2, CCT2)、细胞色素b560亚基(cytochrome b560 subunit, Cyb)、羟基类固醇17-β-脱氢酶3 (17 beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 3, HSD17B3)和铜/锌超氧化物歧化酶(copper/zinc superoxide dismutase, SODC)作为候选内参基因,并借助ΔCt、geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder五种算法程序评估10个候选内参基因的表达稳定性,并以β-1, 3葡聚糖酶为目的基因验证本研究筛选的内参基因。结果表明,HSD17B3在不同后熟时间和不同发育时期表达最稳定,Rpb2在不同菌盖形态中表达最稳定,而PP2A在不同后熟时间和不同菌盖形态中均最不稳定,在不同发育时期中,PGI的表达稳定性最差。本研究评估了荷叶离褶伞内参基因的稳定性,为荷叶离褶伞不同时期以及不同菌盖形态的研究提供参考。

浙贝母(Fritillaria thunbergii)为百合科贝母属植物,鳞茎为药用部位,具有清热散结之功效。叶斑病是浙贝母的主要真菌性病害之一,间座壳菌属真菌Diaporthe eres为其病原真菌。目前,植保人员和种植户主要通过经典的症状观察法判断浙贝母叶斑病的发生,无法在其发病初期实现快速准确诊断。本研究旨在制备针对D. eres的单克隆抗体(单抗)及免疫学检测试剂盒,为田间叶斑病的快速准确鉴定提供技术支撑。首先,以D. eres菌丝蛋白提取液免疫Bal b/c小鼠(Mus musculus),然后采用杂交瘤技术得到1种针对D. eres的单抗及其杂交瘤细胞株PoF7。间接ELISA法和Western blot分析表明,该单抗对D. eres具有高度特异性,检测灵敏度为11 ng/mL,效价≥2.56×10⁴,抗体类型为IgM,结合蛋白分子量为107 kD。基于PoF7的ELISA试剂盒的检测灵敏度为44 ng/mL,具有良好的重复性和特异性。该试剂盒使用操作简便,田间浙贝母病株只要经过简单的研磨,即可取汁液进行检测,适用于田间样品的大规模检测。