现代栽培玉米(Zea mays)与其野生祖先大刍草(Z. mays ssp. parviglumis)的颖壳差异明显,驯化过程中强烈的人工选择使颖壳长度和硬度均显著变小。颖壳在自然环境下可以有效的防止雨水天气引发的病原菌入侵,并且起到抗虫的作用。本研究鉴定到1个雌穗颖壳伸长的自然变异突变体Eg1 (elongated glume 1)。通过表型观察,发现Eg1突变体的雌穗颖壳长度显著大于野生型,而雄穗颖壳并无明显差异。细胞学分析显示,Eg1的颖壳伸长是由雌穗颖壳的细胞数目增多引起的,而细胞面积与野生型无明显差异。遗传分析表明,Eg1突变体的性状受显性单基因控制。利用图位克隆方法,将EG1基因初步定位在玉米7号染色体约80 kb的区间内,该区间包含8个基因。其中Zm00001eb330490 (ZmERF58)的启动子上游567 bp处插入Harbinger转座子,导致其表达量上升。ZmERF58属于AP2/ERF家族,是典型的核定位转录因子,具有自激活活性。为进一步挖掘EG1基因调控雌穗颖壳发育的遗传途径,对野生型和Eg1突变体的10 cm雌穗颖壳进行转录组测序分析,共筛选出3 264个差异表达基因,其中1 266个基因上调表达,1 998个基因下调表达。GO功能富集分析显示,差异表达基因主要参与DNA转录调控、蛋白质磷酸化和细胞周期等生物学过程;KEGG通路分析表明,差异表达基因显著富集于植物激素信号转导、MAPK信号通路和次级代谢物的生物合成等途径。本研究旨在为EG1基因的后续功能解析提供理论基础。

BT1 (BRITTLE1)调控ADP-葡萄糖(ADP-glucose, ADP-Glc)的单向跨膜转运,在淀粉合成中发挥关键作用,但目前对小麦(Triticum aestivum) BT1基因家族成员及其生物学功能仍缺乏系统研究。本研究在小麦全基因组水平对BT1家族基因进行鉴定、基因表达模式和优异等位基因分析。通过系统进化分析、蛋白结构分析、启动子顺式作用元件预测及qRT-PCR等方法,系统研究了小麦基因组中BT1家族基因的系统发育和表达模式,通过等位基因分析筛选出TaBT1基因家族的优异等位基因。系统进化和结构分析表明,小麦TaBT1蛋白与大麦(Hordeum vulgare) HvBT1蛋白亲缘关系较近。小麦基因组中共鉴定到9个TaBT1基因,其编码的蛋白均含有Mito-carr结构域,且同组成员具有相似的保守结构域,表明该基因家族进化高度保守。TaBT1s基因启动子区域包含多种植物生长发育相关顺式作用元件,且主要在小麦籽粒中高表达,其中胚乳中表达量最高。TaBT1基因家族成员中8个基因存在不同等位基因,其中3个基因的等位基因与籽粒性状显著关联,且TaBT1-1A和TaBT1-1B的优异等位基因在不同的小麦产区表现出明显的地域差异。本研究为TaBT1基因参与调控小麦籽粒发育的生物学功能和优异等位基因育种应用提供了理论依据。

磷酸核酮糖激酶(phosphoribulokinase, PRK) 是光合作用卡尔文循环(Calvin cycle)中的关键酶,主要影响碳同化过程。近期研究发现PRK可能参与植物非生物与生物胁迫应答,但其响应胁迫的作用机制尚不明确。本研究通过构建OsPRK过表达转基因水稻(Oryza sativa),结合代谢组学分析和表型鉴定,探究OsPRK在干旱和稻瘟病菌胁迫应答中的调控机制。利用农杆菌(Agrobacterium) 介导的遗传转化与qPCR技术,成功获得OsPRK单拷贝、纯合且表达量显著高于野生型日本晴(Oryza sativa ssp. japonica cv. Nipponbare)的T₂代过表达转基因水稻植株。采用超高效液相色谱-串联质谱技术对转基因与野生型植株三叶一心期叶片进行广泛靶向代谢组分析,共鉴定到2 036种代谢物。通过正交偏最小二乘判别分析筛选获得136种差异代谢物(differentially accumulated metabolites, DAMs) (93种上调, 43种下调),主要富集于异黄酮合成、类黄酮生物合成、苯丙烷生物合成等可能参与胁迫响应的代谢途径。胁迫表型鉴定结果发现,在干旱胁迫下,OsPRK转基因植株叶片萎蔫延迟,复水后存活率较野生型提高约17%;稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)接种实验显示,OsPRK转基因植株病斑数量显著减少,表明其抗性增强。此外,成熟期净光合速率、气孔导度等光合参数未受明显影响,表明过表达OsPRK可在不影响光合效率的前提下增强抗逆性。研究还发现osprk突变体在T₀代炼苗阶段叶绿素含量显著低于野生型和过表达植株,后期逐渐死亡。本研究揭示了OsPRK通过重塑代谢网络调控水稻抗逆性的新机制,为抗逆分子育种提供了理论依据。

类黄酮是植物体内具有生物活性的重要次生代谢物,对果实品质和抗虫抗病有积极意义。查尔酮合酶(chalcone synthase, CHS)是类黄酮途径的第1个关键限速酶,但在红毛丹(Nephelium lappaceum)中未被全面解析。本研究对红毛丹CHS家族进行鉴定,并对其结构特征进行了分析。结果显示,红毛丹基因组中鉴定出5个CHS家族成员,命名为NlCHS1~NlCHS5。NlCHSs均定位于细胞质,除NlCHS1为碱性蛋白外,其余均为酸性亲水蛋白,除NlCHS4外均为不稳定蛋白。系统发育分析显示NlCHS分为2个亚家族,同一亚家族具有相似的保守基序、保守结构域和基因结构;NlCHS所有成员均含有Chal _sti_synt_N和Chal_sti_synt_C结构域,但NlCHS1和NlCHS3有部分保守基序和保守结构域缺失,且基因结构中含有2个内含子(其余成员仅含有1个内含子)。染色体定位分析显示,5个NlCHS基因分别位于Chr5、Chr6、Chr7、Chr9和Chr12上;每个成员启动子区域含有大量光响应元件,NlCHS4启动子区域G-box和MRE元件数量均多于其他成员。在不同品种、不同果实部位和不同发育阶段中的表达分析发现,NlCHS4的表达和红毛丹果皮和假种皮中类黄酮的含量高度相关;推测NlCHS4是参与红毛丹类黄酮合成的关键成员。本研究可为进一步研究红毛丹类黄酮的合成调控提供一定基础。

热激蛋白20 (heat shock protein 20, HSP20)是一类小分子蛋白,在响应温度等非生物胁迫中发挥重要作用。鉴定并分析艾草(Artemisia argyi)中HSP20基因家族成员,有助于揭示艾草响应温度的调控机制。本研究利用生物信息学的方法鉴定出24个AaHSP20基因,并对其理化性质、进化关系、互作蛋白和表达模式等进行分析。结果表明,AaHSP20编码的蛋白氨基酸长度为155~215 aa,分子量为17.60~24.67 kD。大部分蛋白定位在细胞质。蛋白质二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成。24个AaHSP20基因不均匀地分布在10条染色体上。部分AaHSP20基因与拟南芥(Arabidopsis thaliana)和生菜(Lactuca sativa)中的同源基因存在共线性关系。系统进化分析表明,24个AaHSP20蛋白可划分为3类4个亚家族。AaHSP20蛋白均含有保守结构域和保守基序(motif 1和motif 2),且大部分成员基因结构中没有内含子。互作蛋白分析发现AaHSP20可能与其他小分子热激蛋白发生相互作用。qRT-PCR结果表明,5个候选AaHSP20基因在艾草不同组织中表达模式不同。AaHSP20-2、AaHSP20-7、AaHSP20-16和AaHSP20-21对高温与低温都敏感,AaHSP20-20只对高温敏感。本研究为进一步挖掘AaHSP20的功能及艾草抗性育种提供理论基础。

白及(Bletilla striata)萜类化合物是其药用价值的重要物质基础,香叶基香叶基焦磷酸合酶 (geranylgeranyl pyrophosphate synthase, GGPPS)是萜类代谢网络的核心分支酶,但BsGGPPS基因的相关特征尚未明确。本研究以野生紫花大白及为对象,基于白及转录组数据,通过RT-PCR克隆获得BsGGPPS基因的CDS;借助生物信息学技术,解析其编码蛋白的理化特性、功能结构域及进化关联性;通过构建融合表达载体并瞬时转化烟草(Nicotiana tabacum),明确BsGGPPS蛋白的亚细胞分布;结合qRT-PCR技术检测其在白及不同组织中的表达水平。结果表明,克隆得到BsGGPPS基因CDS序列长度为1 083 bp,编码360个氨基酸。生物信息学分析表明,BsGGPPS为无信号肽、非跨膜的弱疏水性不稳定蛋白,含典型天冬氨酸富集催化基序(FARM和SARM),属于异戊二烯基焦磷酸合酶家族的重要分支。亚细胞定位显示,BsGGPPS主要分布于细胞质与质体;系统进化分析表明,BsGGPPS与铁皮石斛(Dendrobium catenatum)及小兰屿蝴蝶兰(Phalaenopsis equestris) GGPPS聚为单系类群。qRT-PCR结果显示,BsGGPPS在白及幼苗的假鳞茎中的表达量显著高于根、茎和叶(P<0.05)。以上结果表明,BsGGPPS可能通过质体与细胞质协同作用参与白及萜类代谢途径,其假鳞茎特异性高表达提示该基因在药用萜类活性成分储存器官中的调控功能,本研究不仅为深入揭示白及萜类代谢调控机制提供理论依据,也为后续通过基因工程手段定向调控白及药用萜类成分合成提供参考。

棉粕作为我国来源广泛的蛋白质饲料,为畜牧业蛋白饲粮缺口的改善提供有效解决途径,在养羊业中,用一定比例棉粕代替豆粕有助于提高经济效益。本研究旨在分析棉粕代替50%和100%豆粕对育肥羔羊(Ovis aries)生长性能及消化生理指标的影响,为羔羊育肥提供无豆粕饲粮技术方案。选取健康且体重相近的2月龄羔羊,分别饲喂0% (Ⅰ组, 对照组)、50% (Ⅱ组)和100% (Ⅲ组)棉粕代替豆粕的饲粮,预饲期10 d,正饲期60 d。正饲期每天统计各组羊的采食量,并在正饲期第0天和第60天晨饲前空腹称重,计算平均日增重及料重比。正饲期第60天晨饲前静脉采血,用于分析血清免疫指标及血清营养代谢指标;直肠采集粪便,内标法测定干物质、粗蛋白质、粗脂肪、中性洗涤纤维及酸性洗涤纤维表观消化率;瘤胃口腔导管法采集瘤胃液用于瘤胃发酵参数以及瘤胃微生物区系分析。结果表明,各组间平均日增重、料重比差异不显著(P>0.05),50%、100%棉粕代替豆粕饲粮对生长性能无显著影响;各组间免疫球蛋白A、免疫球蛋白G、免疫球蛋白M、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6、白细胞介素-4、白细胞介素-10、热休克蛋-70、肌酐、尿素氮、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、血清蛋白等血清免疫和营养代谢指标差异不显著(P>0.05);各组间干物质、粗蛋白质、粗脂肪、中性洗涤纤维及酸性洗涤纤维等主要营养物质表观消化率差异不显著(P>0.05);各组间瘤胃pH、氨态氮、菌体蛋白及挥发性脂肪酸含量等主要发酵参数无显著差异(P>0.05)。在瘤胃微生物门水平上,厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)是各组瘤胃微生物的优势菌门,各组间排名前10位的菌门相对丰度差异不显著(P>0.05)。在属水平上,普雷沃氏菌属(Prevotella)是各组羔羊瘤胃微生物的优势菌属,各组间排名前10位的菌属相对丰度差异不显著(P>0.05)。经济效益分析结果表明,饲喂50%棉粕组和100%棉粕组较100%豆粕组单只羔羊分别增加收益7.08元和8.63元。综上,用50%和100%棉粕代替豆粕对羔羊生长及主要相关消化生理指标均无显著影响,且经济效益显著,表明在羔羊育肥饲粮中用棉粕全部替代豆粕是可行的。本研究为今后肉羊生产中棉粕的合理利用提供了技术指导。

作为典型的变温动物,鱼类在高温胁迫下会触发内质网应激反应,通过激活真核翻译始动因子2α激酶3 (eukaryotic translation initiation factor 2α kinase 3, EIF2AK3)/C/EBP同源蛋白(C/EBP-homologous protein, CHOP)信号通路介导细胞凋亡和组织损伤。为探究eif2ak3和chop在小黄鱼(Larimichthys polyactis)应对高温胁迫下的响应特征,本研究以小黄鱼为研究对象,克隆了eif2ak3和chop的CDS序列,eif2ak3的CDS长度为3321bp,编码1 106个氨基酸,含有STKc_EIF2AK3_PERK和Luminal_EIF2AK3保守结构域;chop的CDS序列长度为939bp,编码263个氨基酸,含有1个BRLZ保守结构域。系统进化分析表明,小黄鱼eif2ak3和chop均与大黄鱼(L.crocea)的亲缘关系最近。qPCR分析发现,eif2ak3和chop在小黄鱼的各组织中广泛表达,但不同组织表达量存在较大差异。其中,eif2ak3在肝脏中表达量最高,chop在心脏中表达量最高。(32±0.5)℃高温胁迫下,小黄鱼肝脏中eif2ak3和chop表达变化趋势一致,均在达到32℃时表达量最高,随着高温处理时间的延长,基因表达量逐渐下降,说明eif2ak3和chop在高温应激响应的早期即开始发挥重要的调节作用。本研究揭示了eif2ak3及chop响应高温胁迫的表达特征,为深入解析鱼类响应高温胁迫分子机制提供重要数据。

由球炭疽菌(Colletotrichum coccodes)引起的马铃薯炭疽病是马铃薯(Solanum tuberosum)栽培和贮藏中的主要病害之一。本研究以球炭疽菌为病原菌,利用实验室前期保存的2株对球炭疽菌具有良好抑菌效果的内生细菌(QB-2-7和BM-7),通过活体和盆栽防效实验,探究其合成菌群对马铃薯炭疽病的防治效果。结果表明,结合形态学、生理生化及分子生物学鉴定,将菌株QB-2-7和BM-7分别鉴定为萎缩芽胞杆菌(Bacillus atrophaeus)和沙福芽胞杆菌(B. safensis)。安全性评价显示,菌株QB-2-7和BM-7不具有溶血性。合成菌群具有兼容性且最佳复配比例为QB-2-7∶BM-7=7∶3。合成菌群培养液的不同部分中,发酵液的抑菌效果最高,为64.13%。合成菌群预防处理(P)对马铃薯块茎炭疽病的防治效果高于治疗处理(T)和苯醚甲环唑处理(G),达78.5%。合成菌群有效地提高了马铃薯的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化物酶(peroxidase, POD)活性,降低了多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)活性和丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量。合成菌群发酵液具有较强的光照、紫外和高温耐受性,且具有较强的生物膜形成能力。同时,马铃薯盆栽实验表明,合成菌群对马铃薯炭疽病具有良好的防控效果。综上所述,由QB-2-7和BM-7组成的合成菌群对马铃薯炭疽病具有巨大的生防潜力,可以为利用合成菌群研制防治马铃薯炭疽病的微生态制剂提供理论依据和技术支持。

芭蕉炭疽菌(Colletotrichum musae)引起的香蕉(Musa acuminata)炭疽病是香蕉采后最主要的病害之一。为了筛选对香蕉炭疽病具有显著防治效果的生防菌株,本研究通过对广西壮族自治区北海市废弃盐场土壤样品的筛选,获得1株对芭蕉炭疽菌抑菌率达75.62%的拮抗菌株Y-2-3,处理后的芭蕉炭疽菌菌丝发生膨大变形并相互缠绕。功能检测结果表明,Y-2-3可产纤维素酶和淀粉酶,具备固氮、产氨(NH₃)及溶磷等促生特性。经16S rRNA基因和促旋酶B亚单位基因(gyrase subunit B, gyrB)测序鉴定,该菌株为贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)。平板对峙实验显示,菌株Y-2-3具有广谱抑菌能力,对多种病原真菌的抑菌率均超过50%。此外,Y-2-3产生的挥发性化合物对芭蕉炭疽菌亦具有明显抑制作用。香蕉采后保鲜实验进一步验证了其生防效果,Y-2-3挥发性物质处理可将香蕉病斑面积控制在40%左右。综上,菌株Y-2-3兼具促生与防病特性,在香蕉炭疽病的生物防治及农业应用方面具有良好潜力。本研究可为香蕉炭疽病的生物防治提供理论依据及优质菌种资源。

诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)兼具自我更新能力和多向分化潜能,且与胚胎干细胞(embryonic stem cell, ESCs)相比具有更少的伦理争议,在医学和农业领域应用前景广阔。然而,外源重编程基因的残留限制了其分化效能以及临床转化。尽管啮齿类动物及人类(Homo sapiens)iPSCs的无外源基因整合技术日趋成熟,在家畜中获得无外源基因整合且多能性状稳定的iPSCs系仍然具有挑战性。本文聚焦无外源基因整合家畜iPSCs的核心生产策略(如无外源基因整合载体递送,新型重编程诱导因子组合以及培养体系等),重点剖析猪(Sus scrofa domesticus)等大动物中成功案例的关键调控机制,进而从农业可持续发展与生物医学应用双维度评述其转化潜力与挑战,为推进基因组安全的家畜iPSCs研究和产业化应用提供参考。

N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine, m⁶A)作为真核生物RNA上最主要的转录后修饰,在多种生理和病理过程中发挥关键调控作用。随着高通量测序与单碱基分辨率检测技术的迅速发展,越来越多的m⁶A修饰相关蛋白及其靶基因在水生动物中被成功鉴定,相应的调控功能与分子机制也逐渐得以阐明。本文系统综述了m⁶A修饰在爬行类、两栖类、鱼类、甲壳类、软体动物及棘皮动物等水生动物中的功能及其作用机制,旨在揭示该修饰在进化过程中的功能保守性与物种特异性,并为水生动物的生长发育、抗逆育种及病害防控提供潜在的分子靶标与生物标志物。

柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)是一种异型发酵乳酸菌,因其能产生多种功能活性物质以及自身出色的发酵絮凝等能力而受到关注。本文总结了国内外目前对于柠檬明串珠菌的研究现状,阐述了其生成的酶类及其关键功能物质胞外多糖、甘露醇和细菌素等的结构与重要功能,以及其菌株本身作为发酵剂、微生物絮凝剂和益生菌等在食品加工和农业生产等领域的应用。本文系统分析了柠檬明串珠菌在生产应用中的现存问题与发展瓶颈,并探讨了其未来的潜在发展方向,以期为该菌株的深度开发与产业化应用提供理论参考。

甘蓝型油菜(Brassica napus)是我国重要的油料作物,具有重要的经济和观赏价值。光敏色素A(phytochrome A, phyA)是植物感知并响应远红光信号的核心受体,在植物生长发育及非生物胁迫调控过程中发挥着重要作用。本研究对甘蓝型油菜phyA (BnphyA)基因家族成员进行生物信息学筛选鉴定,并对各组织器官和不同非生物胁迫条件下BnphyA的表达模式进行了分析。结果发现,甘蓝型油菜中鉴定出15个家族成员,分为3个亚家族,其中第Ⅱ亚家族(BnaA06G0057900ZS, BnaA09G0661700ZS等)与拟南芥(Arabidopsis thaliana) AtphyA (AT1G09570)亲缘关系最近。基因结构与保守基序分析表明,家族成员均含有PHY -GAF-PAS_2-HATPase结构域。顺式作用元件分析发现,BnphyA基因启动子上大量分布光响应、生长发育及胁迫应答相关的元件。染色体定位显示同源基因多分布于染色体两端;组织特异性表达分析发现BnphyA在根和种子中表达水平上调,主要在根部响应冷、热、干旱及渗透等胁迫。亚细胞定位显示,非活性BnphyA蛋白定位于细胞质。异源回补拟南芥突变体phyA-211未能回补其经典表型至正常株系。利用CRISPR/Cas9技术创制了'19YB437'品系的BnphyA基因编辑材料,并获得BnaA06G0057900ZS基因编辑靶点发生碱基替换(TGC→CGC)及缺失等突变的多株突变体。本研究为进一步了解BnphyA基因家族功能提供了理论参考及基础材料。

生长分化因子11 (growth differentiation factor 11, GDF11)作为转化生长因子β (transforming growth factor β, TGF-β)超家族的一员,主要参与细胞生长、分化和组织再生,同时还在胚胎发育和成体组织的维护中扮演者重要角色。为了探究GDF11在肝脏疾病以及肝脏衰老中所发挥的作用,弥补GDF11在肝脏研究中的动物模型空缺,本研究通过Cre重组酶-loxP位点系统(Cre recombinase-loxP site system, Cre-loxP)条件性基因敲除策略,构建肝脏特异性敲除GDF11的小鼠(Mus musculus)(C57BL/6J)模型,以探究GDF11在肝脏衰老以及整体衰老中的调控机制。首先将携带P1噬菌体交叉位点(locus of X-over P1, LoxP)的GDF11基因编辑小鼠GDF11 (flox/+)与野生型C57BL/6J小鼠杂交,扩繁获得大量GDF11 (flox/+)杂合子小鼠,再将其与肝脏特异性表达Cre重组酶的白蛋白启动子驱动的Cre重组酶(Albumin-Cre recombinase, Alb-Cre)转基因小鼠进行杂交,筛选出GDF11 (flox/+) Alb-cre (+/-)双转基因小鼠;通过组间杂交获得肝脏特异性GDF11敲除小鼠模型。选取3~4周龄的GDF11 (flox/flox) Alb-cre (+/-)、GDF11 (flox/+) Alb-cre (+/-)、GDF11 (flox/flox) Alb-cre (-/-)的小鼠各3只,通过检测目的脏器的基因敲除效率及目的脏器的敲除特异性,结合RNA及蛋白水平的验证分析显示,已成功构建肝脏特异性GDF11基因敲除小鼠模型,且GDF11在心、脾、肺、肾等脏器中的表达未受影响,定量分析表明,各组GDF11基因表达差异明显,且肝脏组织免疫组化及Western blot结果显示,GDF11蛋白水平下降。本研究获得的目的小鼠模型为探索GDF11在肝脏衰老及机体衰老中的生理及病理作用提供了稳定的动物模型。

多房棘球蚴病(alveolar echinococcosis, AE)是由多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis)的幼虫(多房棘球蚴)寄生在人或动物肝脏中所引起的一种严重人兽共患寄生虫病。本研究旨在通过原核表达技术制备多房棘球蚴Em-AGO2 (Argonaute 2)重组蛋白,建立间接酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测方法,初步评价其在多房棘球蚴病(alveolar echinococcosis, AE)早期诊断中的价值。本研究选取Em-AGO2基因N端1~738 bp的片段,构建pET-28a-Em-AGO2 (1~738 bp)截短重组表达载体,将其转化至大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统,经诱导实现高效表达,并通过亲和纯化获得高纯度的Em-AGO2截短重组蛋白。Western blot结果显示,多房棘球蚴感染的小鼠(Mus musculus)血清能够特异性识别Em-AGO2截短重组蛋白,表明该重组蛋白抗原性良好。利用纯化的Em-AGO2截短重组蛋白为包被抗原,通过各步反应条件的优化,最终确定了检测条件：1 μg/mL Em-AGO2截短重组蛋白经0.05 mol/L (pH 9.6)碳酸盐包被缓冲液4 ℃包被过夜;用5%脱脂奶粉37 ℃封闭1 h;待检血清(用封闭液做1∶200倍稀释) 100 μL于37 ℃反应1 h;酶标二抗(用封闭液做1∶10000倍稀释) 100 μL于37 ℃反应1 h;加入底物后避光显色10 min;加入终止液50 μL后测定OD₄₅₀值。基于Em-AGO2截短重组蛋白的间接ELISA检测体系经ROC曲线分析显示,其对多房棘球蚴感染小鼠的诊断特异性和敏感性均达100% (AUC=1.00),且与羊细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus)、羊脑多头蚴(Multiceps multiceps)、羊肝片吸虫(Fasciola hepatica)、羊弓形虫(Toxoplasma gondii)、羊捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)及兔豆状囊尾蚴(Taenia pisiformis)等病原体的阳性血清均无交叉反应。用该方法对多房棘球蚴感染早期小鼠阳性血清检测结果显示,感染7 d时,虫体粗抗原、Em18重组蛋白和Em-AGO2截短重组蛋白的阳性检出率分别为18.75%、75%和71.88%;感染10 d时,阳性检出率分别为34.38%、90.63%和84.38%;感染15 d时,阳性检出率分别为81.25%、100%和100%;感染20 d时,阳性检出率分别为90.63%、100%和100%。本研究基于Em-AGO2截短重组蛋白开发了一种AE的间接ELISA检测方法,该方法在动物多房棘球蚴病早期诊断中展现出显著的潜力,具有重要的应用前景。

猪(Sus scrofa)塞内卡病毒A (Senecavirus A, SVA)是小RNA病毒科塞内卡病毒属的唯一成员,能够引起猪的水疱病和新生仔猪死亡,威胁着全球养猪业的发展。为了建立一种基于逆转录-重组酶聚合酶等温扩增(reverse transcription-recombinase polymerase amplification, RT-RAA)和CRISPR/Cas12a技术检测SVA的可视化方法。本研究根据SVA基因组保守序列,设计3对RT-RAA引物、向导RNA靶向序列(CRISPR RNA, crRNAs)以及单链DNA探针(single-stranded DNA, ssDNA)。通过正交试验优化crRNA与来源于毛螺科细菌Cas12a核酸酶(LbCas12a)的最佳反应浓度。同时,评价RT-RAA-CRISPR/Cas12a方法的敏感性、特异性和重复性,并对已知背景的110份临床样本进行模拟检测。结果显示,crRNA与LbCas12a的最佳反应浓度为100和200 nmol/L。以RNA标准品(SD-RNA)为模板,RT-RAA-CRISPR/Cas12a方法灵敏性可达到15.1 copies/μL。所建立的RT-RAA-CRISPR/Cas12a方法特异性高,不与猪瘟病毒(Clssical swine fever virus, CSFV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2, PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)以及口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)发生交叉反应。重复性试验显示,批内变异系数(CV)小于5%,批间CV小于10%,表明该方法具有良好的重复性。临床样本检测与qPCR检测结果相当,符合率为100%。综上所述,本研究成功建立了一种特异性强、灵敏性高、重复性好的可视化RT-RAA-CRISPR/Cas12a检测方法,可用于SVA的早期有效监测和流行病学调查。

鲤浮肿病毒(Carp edema virus, CEV)是近年来流行的一种DNA病毒,严重危害着锦鲤(Cyprinus carpio haematopterus)和鲤(Cyprinus carpio)养殖的健康发展。本研究以鲤浮肿病毒的P4a基因组序列设计特异性引物,克隆P4a基因序列全长,再通过原核表达系统构建重组表达质粒pET-32a-P4a,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)诱导表达后获得P4a重组蛋白,经SDS-PAGE鉴定、纯化、复性后所得His标签融合蛋白免疫新西兰大白兔(Oryctolagus cuniculus)制备多克隆抗体,并对该抗体进行二喹啉甲酸(bicinchoninic acid assay, BCA)法浓度检测和Western blot鉴定。结果表明,本研究成功构建pET-32a-P4a原核表达载体,经NCBI Blast比对分析,载体序列与P4a蛋白理论序列同源性为99%;BCA法检测该抗体浓度为2.05 mg/mL;SDS-PAGE和Western blot鉴定显示,该抗体免疫原性良好。综上,本研究成功制备CEV P4a蛋白多克隆抗体,为CEV的免疫学检测、疫苗研发等提供了数据支持。