水稻(Oryza sativa)丙二烯氧化物环化酶(allene oxide cyclase, OsAOC)是茉莉酸(jasmonic acid, JA)生物合成途径中的重要酶之一,参与水稻生长发育并应对各种胁迫,但针对OsAOC参与水稻抗稻瘟病与白叶枯病的分子机制研究仍较为有限。本研究发现稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)侵染、外源茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)与水杨酸(salicylic acid, SA)均可诱导野生型'日本晴' ('Nipponbare', NPB) OsAOC的表达。本研究创制OsAOC敲除(OsAOC-KO)及过表达(OsAOC-OE)的水稻株系,研究显示,OsAOC敲除导致水稻生长缺陷甚至死亡,该表型可在喷施MeJA后缓解。OsAOC-OE比NPB更抗稻瘟病菌和白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)的侵染;在几丁质(chitin)和细菌鞭毛蛋白(flg22)诱导下,OsAOC-OE植株活性氧(reactive oxygen species, ROS)的积累显著高于NPB (P<0.05)。接种稻瘟病菌后,过表达植株中JA通路基因(OsAOC, OsJAZ8)和SA通路基因(OsPR1b, OsPAL1)相较于NPB表达上调。亚细胞定位结果显示,OsAOC蛋白定位于叶绿体。通过酵母双杂交(yeast two-hybrid)、谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase, GST)下拉(GST pull-down)和荧光素酶互补(luciferase complementation assay)实验证实,OsAOC与OsOPR3和OsbZIP81蛋白互作。本研究明确了OsAOC在水稻中的定位和蛋白互作,OsAOC参与了水稻的模式触发免疫(pattern-triggered immunity, PTI)反应,并通过JA和SA途径介导水稻抗病反应,正调控水稻对稻瘟病和白叶枯病的抗性。本研究为培育水稻抗病品种提供了基因资源。

剑叶宽影响水稻(Oryza sativa)株型与光合效率,是水稻育种的重要指标之一。本研究在以'Kolayal'和'华占'分别为供体亲本和轮回亲本构建的染色体片段代换系中,发现了剑叶明显窄于双亲的株系,命名为'窄叶华占'。对该株系F₂分离群体进行表型观察,通过图位克隆的方法定位剑叶宽QTL所在片段并对候选基因相对表达量进行了分析。F₂极端表型单株混合测序显示,该剑叶宽QTL位于6号染色体,通过精细定位和关键交换单株比较测序,最终将第6号染色体上控制剑叶宽的位点(quantitative trait locus for flag leaf width on chromosome 6, qFLW6)定位于1.486 kb的区间;Os06g0647200为qFLW6候选基因,该基因有2个选择性剪切,其中Os06g0647200-2在'窄叶华占'中的表达量显著低于'华占'。本研究定位到了一个参与调控水稻剑叶宽的新基因Os06g0647200,为水稻剑叶大小与光合产量改良提供了有利的基因资源。

MicroRNA159 (miR159)是植物中高度保守的miRNA家族,在花药发育和育性维持中发挥关键作用,但其在水稻(Oryza sativa)生殖发育中的复杂调控网络尚不明确。本研究利用CRISPR/Cas9系统构建了水稻OsmiR159家族多位点功能缺失突变体,针对植株营养生长向生殖生长转换障碍、无法开花结实的表型进行研究;转录组学和代谢组学的关联分析发现,OsmiR159功能缺失通过干扰激素信号、能量代谢和细胞壁合成等多个关键生物学过程影响水稻正常发育。KEGG富集分析表明,差异基因与代谢物显著富集于淀粉与蔗糖代谢、苯丙烷生物合成、TCA循环等核心代谢通路,这些通路的协同失调导致植株能量供给失衡、碳骨架分配异常及次生代谢紊乱,最终阻碍水稻从营养生长到生殖生长的转换。本研究通过多组学数据的联合分析,挖掘数据间的关联与相互作用,系统解析了OsmiR159介导的水稻生殖发育调控网络,为作物遗传改良提供了新的理论框架和基因资源。

乳脂率和乳蛋白率是评价奶牛(Bos taurus)乳品质的关键指标。长链脂酰辅酶A合成酶6 (acyl-CoA synthetase long chain family member 6, ACSL6)是脂肪酸代谢的关键酶,被认为是影响奶牛产奶性状的重要候选基因。为探究ACSL6基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)及其与中国荷斯坦牛产奶性状的关联性,本研究以1 152头系谱清晰、生产性能记录完整的中国荷斯坦牛为研究对象,利用PCR扩增与Sanger测序技术,成功鉴定了ACSL6基因的10个SNP位点。随后,采用Sequenom质谱分型技术对候选位点进行SNP分型,并利用一般线性模型将其分型结果与乳脂率、乳蛋白率、乳脂量、乳蛋白量及305 d产奶量等性状进行关联分析。结果显示,所有SNP位点均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05),且在中国荷斯坦牛群体中表现出中度多态性(0.25<PIC<0.5)。关联分析显示,SNP位点g.22501195 C>T对乳脂率具有显著影响(P<0.05),CC和TT基因型具有更高的乳脂率;SNP位点g.22502247 T>C与乳脂率显著相关(P<0.05),CC基因型个体的乳脂率显著高于TC和TT基因型;SNP位点g.22527204 C>T对乳脂率和乳蛋白率均有显著影响(P<0.05),CC基因型个体在上述2项性状上均表现出更高水平。SNP位点g.22532788 A>T显著影响乳蛋白率(P<0.05),AA基因型个体表现出显著更高的乳蛋白率。上述4个位点形成2个单倍型块(Block1和Block2),Block1与乳脂率显著关联(P<0.05);Block2与乳蛋白量达到显著关联水平(P<0.05)。研究结果揭示了ACSL6基因多态性与中国荷斯坦牛产奶性状的潜在关系,提示该基因可作为筛选高产优质乳相关分子标记的重要候选基因。本研究为奶牛分子育种和优质乳性状的遗传改良提供了理论依据。

固醇调节元件结合蛋白(sterol-regulatory element binding proteins, SREBPs)是调节乳脂合成的核心参与者,但其SNPs对奶绵羊(Ovis aries)泌乳性状的影响不明确。本研究选择321只泌乳期元生爱特奶绵羊(Ovis aries)为实验对象,用Sanger测序技术检测SREBP1基因SNPs,用五引物扩增受阻突变体系(penta-primer amplification refractory mutation system, PARMS)技术对其进行分型,用一般线性混合模型(泌乳性状=群体均值+基因型/等位基因+胎次+年龄+随机效应)分析SNPs对绵羊泌乳性状的影响。同时,用qRT-PCR检测泌乳期绵羊的SREBP1基因在乳腺等6个组织中的表达特征。在绵羊SREBP1基因中共鉴定到c.148+4892 G/A、c.148+5262 G/C、c.2439+115 T/C和c.2923 G/A 4个SNPs,其中c.2923 G/A为错义突变,每个SNP位点均检测到3种基因型。相关性分析发现,c.148+4892 G/A位点处GG型个体日平均泌乳量显著高于GA型个体(P<0.05),c.148+5262 G/C位点处GC型个体乳脂率和干物质含量显著高于GG型个体(P<0.05),c.2923 G/A位点处GA型个体干物质含量显著高于AA型个体(P<0.05)。qRT-PCR结果发现,SREBP1基因在乳腺脂肪垫中表达量最高,显著高于乳腺实质和肝脏等组织,而在肾周脂肪中的表达量最低(P<0.05)。本研究筛选得到的3个SNPs位点影响奶绵羊的部分泌乳性状,为奶绵羊泌乳性状的分子选育提供理论参考。

双峰驼(Camelus bactrianus)为典型的季节性繁殖动物,在自然条件下,其乏情期通常与环境温度较高的季节重合,此时繁殖功能处于周期性抑制状态。高温环境诱导的热应激可能是驱动其繁殖功能季节性抑制的关键环境因素之一。为了探究在转录组中差异表达的双氧化酶2 (dual oxidase 2, DUOX2)在双峰驼睾丸热应激响应中的作用机制,本研究分别采集发情期与乏情期双峰驼睾丸组织,利用RNA-seq技术筛选差异表达基因,并对差异基因进行功能富集分析。采用qRT-PCR、Western blot、免疫组化(immunohistochemistry, IHC)染色及ELISA等技术,验证DUOX2的表达与定位,并检测氧化应激相关指标与激素水平。体外分离鉴定培养睾丸支持细胞(Sertoli cells, SCs),构建39 ℃与42 ℃热应激模型,采用DUOX2抑制剂二苯基氯化碘盐(diphenyleneiodonium, DPI)干预细胞,通过细胞计数试剂盒-8 (cell counting kit-8, CCK-8)筛选合适的DPI浓度并利用流式细胞术分析细胞凋亡与细胞周期分布。转录组分析共鉴定出291个差异表达mRNA,其中DUOX2在乏情期表达显著上调(P<0.05)。KEGG分析显示,DUOX2富集于氧化应激等相关通路。mRNA转录及蛋白水平验证表明,乏情期睾丸中DUOX2表达水平显著高于发情期(P<0.05)。苏木精-伊红染色(hematoxylin eosin staining, HE)结果显示,乏情期生精小管出现空泡化,生精过程停滞。IHC结果表明,DUOX2蛋白主要分布在生精上皮、SCs及间质细胞。ELISA结果表明,与发情期相比,乏情期氧化指标(H₂O₂和丙二醛(malondialdehyde, MDA))显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)升高,而抗氧化酶(超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和过氧化氢酶(catalase, CAT))与生殖激素(睾酮(testosterone, T)和促黄体生成素(luteinizing hormone, LH))水平极显著降低(P<0.01)。体外细胞实验表明,在热应激条件下,抑制DUOX2活性可显著降低SCs凋亡率,G1期阻滞转变为G2/M期阻滞。乏情期双峰驼睾丸中DUOX2表达上调,可能通过介导氧化应激加剧热应激损伤,进而诱导SCs凋亡与周期阻滞。抑制DUOX2活性可缓解热应激损伤。本研究揭示了DUOX2在热应激致双峰驼睾丸SCs损伤中的关键作用,并为阐明双峰驼季节性繁殖的分子调控机制提供了新的理论依据。

外泌体是细胞外囊泡的一种类型。在卵泡微环境中,外泌体是重要的细胞通讯介质,能够通过所携带的基因对卵泡的生长发育过程进行调控,然而有关卵泡液外泌体中基因的信息尚不明确。因此,本研究旨在揭示卵泡液外泌体基因的多样性信息,解析外泌体在卵泡的生长发育、排卵或闭锁过程中发挥的调控功能,为生猪(Sus scrofa)育种及繁殖研究提供理论依据。本研究发现卵泡液外泌体能够促进猪卵巢的增殖及类固醇激素的分泌,并通过转录组测序在卵泡液外泌体样品鉴定到SNP/InDel突变44 955个,其中多为SNP变异,共有43 752个。其中仅有2 430个纯合型的SNP和InDel突变。对样本SNP的突变类型进行分析,发现SNP转换类型共计2.30×10⁴个,颠换类型2.08×10⁴个,二者之比为1.11。并通过突变位置注释发现,SNP/InDel主要发生在基因间隔区和内含子区域,其次为外显子区和3'-UTR、5'UTR,分布在1 073个基因上。经基因功能及通路富集发现,外显子区域发生突变的基因主要参与到细胞氧化应激、翻译、细胞自噬以及细胞周期调控等通路中。此外,发现了10个与卵泡发育调控相关的基因,如β-肌动蛋白(actin beta, ACTB)、肿瘤蛋白p53 (tumor protein p53, TP53)、组织蛋白酶B (cathepsin B, CTSB)、核纤层蛋白B1 (lamin B1, LMNB1)等。本研究获得的SNP/InDel信息可为后续研究卵泡液外泌体在生猪育种中的应用提供理论帮助。

烟台䅟糠鸡(Gallus gallus domesticus)品种内部呈现出显著的表型分化,但是否已形成不同的资源群体尚有待确定。本研究分别采集烟台䅟糠鸡公鸡和飞花、黄麻、黑麻3种羽色的母鸡群体的生产表型和血液样本进行全基因重测序分析,共获得101个个体的全基因组数据,并与济宁市其他3个本土品种的基因组数据进行联合分析,分别在线粒体和全基因组层面,从遗传多样性、遗传结构、遗传关系和连续性纯合片段(runs of homozygosity, ROH)分布特征等多方面对烟台䅟糠鸡不同亚群进行了综合评估。结果显示,烟台䅟糠鸡与其他本地品种遗传差异明显,其品种内尽管存在多种羽色类群,但在生产表型和基因组上均未形成明显亚群,各群体间遗传分化程度低,遗传多样性高、近交系数低,其中公鸡近交系数更低。总之,烟台䅟糠鸡群体保种效果好,可适当加强专门化品系选育和产业化开发。本研究为烟台䅟糠鸡的遗传资源保种、选育和产业化开发利用提供科学依据。

乳酸菌作为益生菌在畜禽养殖中广泛应用,已被证明能改善动物的生长性能、肠道健康和免疫功能。干扰素-γ (IFN-γ)是一种重要的免疫调节因子,在增强机体免疫反应及促进抗病能力方面具有潜力。本研究通过构建表达IFN-γ的重组乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(rL. lactis-IFN-γ),评估其对白羽肉鸡(Gallus gallus domesticus)生长性能、肠道健康及免疫反应的影响,旨在为工程化乳酸菌在肉鸡养殖中的应用提供理论依据。为探究rL. lactis-IFN-γ对白羽肉鸡生长性能的影响,本研究选取'艾维茵'白羽肉鸡20只,随机分成2组,分别向日粮中添加rL. lactis-IFN-γ (rL. lactis-IFN-γ组)和PBS (对照组),连续饲喂35 d。通过测定生长性能指标—料肉比、肠道菌群指标以及免疫功能相关指标的变化,评估rL. lactis-IFN-γ对肉鸡生产性能的影响。结果表明,与对照组相比,rL. lactis-IFN-γ组的白羽肉鸡体重增长显著升高(P<0.05),料肉比显著降低(P<0.05),同时鸡胸肉指数显著增加(P<0.05)。rL. lactis-IFN-γ组肉鸡肠道总长度以及绒隐比显著增加(P<0.05),rL. lactis-IFN-γ组空肠的微生物丰度显著增加(P<0.05)。此外,rL. lactis-IFN-γ组肉鸡血清中IgG和IgA显著升高(P<0.05)。综上,日粮添加rL. lactis-IFN-γ可改善肠道健康,促进营养物质吸收,同时增强肉鸡的免疫功能,从而提高肉鸡生产性能。本研究为重组工程乳酸菌作为新型绿色饲料添加剂在肉鸡养殖中的应用提供理论依据,也为畜禽减抗养殖策略开发提供新思路。

维生素D₃ (vitamin D₃, VD₃)具有多种生物学功能,除调节钙、磷吸收及利用外,对机体代谢和健康也具有重要作用。本研究将210只1日龄雄性芦花肉鸡(Gallus gallus)随机分为对照组(基础饲粮)和VD₃组(基础饲粮+3750 IU/kg VD₃),每组7个重复,实验期84 d,分析芦花肉鸡的生长性能、免疫器官相对重量、血清和脂肪组织免疫因子及抗氧化等指标的变化,探讨饲粮添加VD₃对肉鸡生长、免疫和抗氧化功能的影响。结果表明,饲粮添加VD₃显著提高1~84日龄肉鸡体增重(P<0.05),显著提高28、56和84日龄血清25-羟基维生素D₃ (25-hydroxyvitamin D₃, 25(OH)D₃)水平(P<0.05),上调脂肪组织VD受体(vitamin D receptor, VDR)、25-羟基化酶(cytochrome P450 family 2 subfamily R member 1, CYP2R1)、1α-羟基化酶(cytochrome P450 family 27 subfamily C member 1, CYP27C1)、24-羟基化酶(cytochrome P450 family 24 subfamily A member, CYP24A1)及VD结合蛋白(vitamin D binding protein, VDBP) mRNA表达水平。添加VD₃显著降低各日龄肉鸡血清丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量,提高56日龄超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)和过氧化氢酶(catalase, CAT)的活性及84日龄GSH-Px和CAT的活性(P<0.05);显著上调56和84日龄肉鸡脂肪组织抗氧化相关基因：核因子红细胞2相关因子2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)、血红素氧合酶-1 (heme oxygenase-1, HO-1)、NADPH醌氧化还原酶1 (NADPH quinone oxidoreductase1, NQO1)、GSH-Px和SOD mRNA的表达水平(P<0.05)。VD₃显著提高56和84日龄肉鸡胸腺和法氏囊器官指数,以及各日龄血清免疫球蛋白A (immunoglobulin, IgA)、IgG、白细胞介素-2 (interleukin, IL-2)和干扰素-γ (interferon-γ, IFN-γ)水平(P<0.05);显著提高各日龄肉鸡脂肪组织IgA、IgG、IL-10及56和84日龄IgM水平,下调脂肪组织肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)、核因子-κB (nuclear factor kappa-B, NF-κB)、Toll样受体4 (toll-like receptor-4, TLR-4)和IL-1β mRNA表达水平,而上调IL-10 mRNA表达水平(P<0.05)。综上表明,饲粮添加3 750 IU/kg VD₃可促进芦花肉鸡VD₃代谢,增强机体及脂肪组织抗氧化和免疫功能,有益于肉鸡的健康和生长。本研究为深入了解VD₃的营养生理功能、优化其在肉鸡生产中的利用提供了依据。

由尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种(Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4, Foc TR4)诱发的香蕉枯萎病(Banana Fusarium Wilt),已对全球香蕉(Musa nana)种植产业构成重大隐患。为实现香蕉枯萎病绿色防控,筛选具有诱导系统抗性功能的生防菌株,本研究通过多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)、过氧化物酶(peroxidase, POD)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)等防御酶活性变化筛选诱导抗性菌株,结合形态学特征、生理生化特征及16S rRNA系统发育树鉴定目标菌株,并优化该菌株的最适培养条件;进一步通过平板对峙法及菌悬液孢子共培养法研究目标菌株对菌丝生长及孢子萌发的影响;再通过灌根接种该菌株,探究其对香蕉系统抗性的诱导作用;最后通过盆栽实验验证生防菌株对香蕉枯萎病的防治效果。结果表明,筛选得到1株可诱导香蕉产生系统抗性的生防菌株GXMZ-G3,经鉴定为芽胞杆菌Bacillus sp.,该菌株对Foc TR4的抑菌率为62.63%,孢子萌发抑制率为85.66%,受抑制的Foc TR4菌丝出现扭曲、打结、断裂等现象。灌根接种GXMZ-G3菌悬液后,可诱导香蕉叶片中的PPO、POD、SOD活性提高,诱导后的香蕉叶片中H₂O₂和胼胝质出现一定程度的沉积,且接种12 h时叶片茉莉酸(jasmonic acid, JA)含量最高达0.48 ng/mL,较CK组增加了20.00%;盆栽防治实验结果表明,菌株GXMZ-G3对香蕉枯萎病的防治效果可达89.48%。综上,生防菌株GXMZ-G3能直接抑制Foc TR4菌丝生长及孢子萌发,并诱导香蕉产生系统抗性。本研究为香蕉枯萎病生物防治提供了优良菌株资源。

动物生物反应器是一种利用转基因动物的特定器官(如乳腺, 血液, 膀胱等)作为生物合成“工厂”,生产高附加值生物活性物质的前沿技术。随着生物医药产业对重组蛋白需求的持续增长,传统的微生物表达系统和细胞培养技术因在翻译后修饰能力方面的局限性或生产成本过高,逐渐显现发展瓶颈。相比之下,动物生物反应器具备生产成本低、表达产量高以及能够实现复杂翻译后修饰等优势,已成为突破上述技术瓶颈的重要途径。本文以多基因协同表达、CRISPR/Cas9精准基因编辑、非侵入性产物采集、伦理安全一体化为前沿技术融合视角,系统综述了乳腺、家蚕(Bombyx mori)丝腺、禽类蛋体及膀胱等主要动物生物反应器的技术原理与应用进展;比较分析了不同表达标签的选择策略;针对当前存在的转基因效率偏低、动物伦理争议以及安全性评估体系不完善等挑战,提出了基于CRISPR/Cas9基因编辑技术优化和非侵入性产物采集方法的改进路径,并展望了该技术在多基因协同表达调控及生物医药规模化生产中的未来发展方向,为重组药用蛋白动物生物反应器的基础研究、体系优化及产业化开发提供理论参考。

基因芯片是利用DNA双链互补配对或DNA-RNA互补杂交检测特定DNA序列的高通量技术,可高效完成检测分型和支撑个体遗传评估与选育。目前主流商用育种芯片以SNPs标记为核心,标记位点在基因组上均匀分布,又称SNP芯片,已广泛应用于猪(Sus scrofa domesticus)重要经济性状遗传解析、基因组选择、分子标记辅助育种、品种鉴定及种质资源保护等领域,在肉质、生长、繁殖和抗病抗逆育种方面取得了显著进展,推动猪育种由传统表型选择向精准化、规模化和高效化转变。与此同时,结构变异(structural variations, SVs)等新型遗传标记的引入,有助于弥补常规SNP芯片在复杂基因组区域和大尺度变异检测方面的不足,为解析复杂性状提供了新的技术路径。本文综述了基因芯片的技术原理、类型划分与国产化发展进程,系统阐述其在猪肉质改良、生长性能提升、繁殖效率优化及抗逆抗病育种中的应用成效与关键进展,分析了当前应用瓶颈,并展望了其通过多技术整合赋能猪种业自主可控、产业高质量发展的前景,为我国基因芯片在猪育种领域的创新研发与产业化落地提供理论参考与实践指引。

癌症是严重威胁人类和动物健康的重大疾病,其治疗方案仍在不断探索之中。抗肿瘤纳米疫苗是继单克隆抗体、免疫检查点抑制剂和过继细胞疗法之后的一种新兴免疫疗法。该疗法以纳米材料为载体,将抗原、佐剂等功能组分组装成纳米级疫苗制剂,通过模拟病原体特征,有效激发机体免疫系统对肿瘤细胞的免疫监视与清除功能。本文从纳米疫苗材料、肿瘤抗原、佐剂及联合治疗增效四个方面系统综述抗肿瘤纳米疫苗的研究进展,并在此基础上重点梳理畜禽肿瘤纳米疫苗的现有研究与应用现状,旨在为动物肿瘤防控及农业动物肿瘤免疫治疗提供理论参考。

转基因玉米(Zea mays)在我国的商业化进程显著加速,传统核酸提取与检测方法因流程复杂、耗时长等局限性难以满足田间快速筛查的迫切需求。为开发一种高效、精准的现场检测技术,提升监管效率,本研究通过系统分析5种裂解方法在常规PCR、实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR, qPCR)和重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)体系中的适配性,并探究高温孵育对DNA提取的影响,筛选最优核酸提取方案。结果表明,碱裂解法具有多体系兼容性,其中快提剂1效果最优;高温处理虽可使核酸得率显著提高,但同时会引发叶绿素等荧光物质的释放,对后续检测造成严重干扰。基于此,本研究开发集成石英砂机械裂解、滤膜粗过滤和恒温扩增技术的一体化便携式检测装置,建立了25 min全流程检测方案,检测效率较传统方法提升6倍。实际验证显示,该系统对转基因玉米DBN9936转化体和瑞丰125转化体的检测特异性均达到100%,可有效区分非转基因作物及其他品系。本研究筛选出兼容多种检测方法的快提剂1,并创新性地开发了“样本进-结果出”的现场快速检测系统,为转基因作物监管提供了快速(<30 min)、多平台兼容的高效解决方案。

血管紧张素转换酶2 (angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)在肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)中发挥负性调控作用,同时亦是严重急性呼吸综合征冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus, SARS-CoV)等多种冠状病毒侵入宿主细胞的关键功能性受体。为探寻鸡(Gallus gallus domesticus) ACE2蛋白与鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus, IBV)等禽冠状病毒的关系,本研究采用RT-PCR获得了鸡ACE2基因的完整编码区序列,并通过同源重组方式将其克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体。经菌液PCR、限制性酶切及核苷酸测序验证后,采用脂质体转染法将该重组质粒导入中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)细胞,随后利用遗传霉素(geneticin, G418)进行压力筛选并结合单克隆培养,最终获得了能够稳定表达鸡ACE2蛋白的细胞株;通过RT-PCR、Western blot及免疫荧光染色,检测ACE2在CHO细胞中的表达;同时采用双抗体夹心法定量分析重组ACE2蛋白的酶催化活性。结果显示,本研究在体外成功构建了重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-ACE2;单酶切后可见约7 872 bp的片段,测序结果与预期序列完全一致。该重组载体有效转染至CHO细胞后,RT-PCR检测证实了目的基因在转录水平的高丰度表达;免疫荧光结果显示,重组蛋白在细胞膜上呈均匀分布,且转染效率良好;Western blot结果进一步证实了重组蛋白在CHO细胞中的高效表达,其表观分子量约为105 kD。经G418筛选及单克隆化,共获得4株稳定表达株,分别命名为pcDNA3.1(+)-ACE2-A/B/C/D。双抗体夹心法测得的ACE2蛋白酶活性值为601.77 U/L,表明酶活性较高。本研究成功构建了鸡ACE2的真核表达体系,并获得了可稳定产生重组ACE2蛋白的细胞株,为后续深入探究鸡ACE2蛋白与冠状病毒互作及其相关生物学功能研究奠定基础。

非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起的高致死性烈性传染病,对全球养猪业造成毁灭性损失,目前尚无安全有效的商品化疫苗,解析病毒关键蛋白功能是疫苗研发与抗病毒策略设计的核心前提。传统ASFV蛋白功能研究高度依赖特异性抗体,存在抗体制备周期长、流程繁杂等局限。C129R是ASFV核心区域编码的结构蛋白,其在病毒颗粒中的精确定位、动态分布及宿主互作机制尚未明确。为研究C129R在病毒感染与致病中的功能,本研究构建非洲猪瘟病毒结构蛋白C129R的羧基端3×Flag-Strep双标签重组毒株,利用同源重组技术,将编码3×Flag-Strep双标签及GFP筛选标记的基因序列插入ASFV CN/GS/2018毒株C129R基因羧基端,通过克隆筛选纯化获得融合重组病毒ASFV-C129R-3×Flag-Strep。Western blot检测证实重组病毒正确表达携带双标签的C129R融合蛋白;qPCR显示,标签插入未显著影响C129R及其上下游基因M448R和C84L的转录水平;一步生长曲线、血细胞吸附试验及透射电镜观察表明,重组病毒与亲本毒株的体外复制动力学、形态结构及病毒装配均无显著差异。本研究成功构建了生物学特性稳定的C129R双标签重组ASFV,为后续解析C129R在病毒颗粒中的精确定位、结构特征及其与宿主蛋白相互作用机制提供参考。