植物SH3Ps (SH3 domain-containing proteins)是广泛存在的一类蛋白。该蛋白已被证实参与细胞中的多个进程。在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中,SH3P2的蛋白互作网络较为广泛,在细胞内吞、囊泡转运、结合泛素、细胞分裂和自噬小体的形成中发挥重要作用。但到目前为止,SH3P2在水稻(Oryza sativa)中的相关报道甚少。本研究将水稻OsSH3P2基因转入原生质体中进行瞬时表达,观察到水稻OsSH3P2主要定位在网格蛋白包被囊泡中,部分定位于反式高尔基体网络/核内体中。同时,亚细胞定位结果显示OsSH3P2与囊泡转运复合体成员ELC (protein ELC-like)能发生共定位,利用酵母双杂交(yeast two-hybrid, Y2H)、免疫共沉淀 (co-inmunoprecipitation, Co-IP)和双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation, BiFC)等多种技术进一步证实OsSH3P2与ELC发生相互作用,表明两者存在紧密的联系。随后,通过提取水稻各种组织的RNA进行qRT-PCR分析,结果显示OsSH3P2在水稻生长各个时期的表达相对稳定,其中在茎部表达量最高。PlantCARE在线分析表明OsSH3P2启动子区域有多个光响应调控元件,双荧光素酶报告实验证实该基因表达受光的影响,在黑暗条件下诱导表达。本研究结果揭示了OsSH3P2在水稻中的细胞定位、蛋白互作和表达模式,为后续深入挖掘OsSH3P2生物学功能奠定了理论基础。

HvSWEET4是青稞(Hordeum vulgare var. nudum)中SWEET (sugars will eventually be exported transporters)糖转运蛋白家族的重要成员,参与籽粒发育过程中己糖的转运调控。为阐明青稞HvSWEET4基因转录调控的分子机制,本研究选取籽粒大小差异显著的2个青稞品种'北青3号' (大粒)和'3917' (小粒),扩增其编码框上游约2 000 bp的启动子序列并进行系统分析。结果表明,2个品种HvSWEET4的启动子序列高度保守,仅存在10处SNPs和5处插入/缺失变异(insertions/deletions, InDels),差异位点仅占总碱基数的0.75%。启动子元件分析揭示,HvSWEET4启动子含有参与多种逆境响应、糖代谢、淀粉代谢、花粉、胚乳及糊粉层发育调节的调控元件。启动子活性分析确定其核心功能区域位于-310~-212 bp。进一步分析表明,启动子活性的差异可能与-1 999~-310 bp区域的抑制子效应,以及-212~-1 bp区域SNP位点的变化有关,这些差异可能影响转录因子结合的种类和位点。本研究为深入解析HvSWEET4在籽粒大小调控中的分子机制及其在作物育种中的潜在应用提供了重要的理论依据。

海岛棉(Gossypium barbadense)具有优异的棉纤维,具有较高的经济价值。干旱缺水对海岛棉产量和纤维品质会造成极大的影响。鉴定干旱胁迫相关的基因作为海岛棉分子设计育种技术的候选基因是提高海岛棉抗旱性的策略之一。本研究通过RT-PCR技术克隆到了编码海岛棉组蛋白去甲基化酶的基因GbJMJ25 (JMJ: Jumonji),对其进行生物信息学、表达模式和亚细胞定位分析,并借助病毒诱导基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)技术初步验证GbJMJ25基因在棉花干旱胁迫中的相关功能。生物信息学分析结果表明,GbJMJ25基因编码1 055个氨基酸,含有RING和JmjC 2个保守结构域;其启动子区含有与光响应、生长发育和逆境胁迫响应相关的多个顺式作用元件。表达模式分析结果表明,GbJMJ25基因的表达可响应脱落酸(abscisic acid, ABA)、聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)等处理。亚细胞定位分析结果表明GbJMJ25蛋白定位于细胞核。VIGS技术介导的功能验证结果表明,正常情况下,GbJMJ25沉默棉花植株与对照组pTRV2植株在性状上无明显差异;而在干旱胁迫下,GbJMJ25沉默棉花植株表现出较强的耐受能力,与对照组pTRV2植株相比,具有较高的存活率,初步表明GbJMJ25基因在棉花应对干旱胁迫的响应中发挥着一定作用。本研究结果为分子设计育种提高海岛棉抗旱能力提供候选基因。

KNOX (KNOTTED1-like homeobox gene)家族作为植物生长发育的核心调控因子家族,其功能异常会导致植物器官畸形等表型,因此解析其调控机制对植物基础研究及作物遗传改良具有重要意义。本研究克隆光皮桦(Betula luminifera) BlKNOX7基因,经生物信息学分析其序列特征,通过qRT-PCR检测该基因在不同组织及应拉木形成中的表达模式,并鉴定过表达BlKNOX7拟南芥(Arabidopsis thaliana)植株的表型。结果表明,BlKNOX7基因(GenBank No. PV577094)由5个外显子和4个内含子组成,其cDNA序列长度为1 095 bp,ORF为891 bp,编码296个氨基酸。进化树分析发现,BlKNOX7与已报道的次生壁发育相关转录因子毛果杨(Populus trichocarpa) KNAT7聚为一类。BlKNOX7基因在茎中的表达量随木质化程度升高而递增,在叶中的表达量最高。在应拉木诱导过程中,BlKNOX7在应拉木中的表达量均显著低于对照。在拟南芥中过表达BlKNOX7导致植株叶片卷曲呈波浪形;经甲苯胺蓝染色的花序茎横切面,着色范围比野生型小且颜色更浅,提示木质素沉积较少。qRT-PCR结果显示,BlKNOX7过表达显著抑制了拟南芥次生壁合成途径关键酶基因苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase, AtPAL)、4-香豆酰辅酶A连接酶(4-coumarate-COA ligase, At4CL)、不规则木质部(irregular xylem, AtIRX)和纤维素合酶(cellulose synthase, AtCesA)等的表达。本研究为进一步探究光皮桦次生壁发育分子机制提供了理论基础。

甾醇类化合物在植物生长发育和抗逆中发挥着重要作用,甾醇甲基转移酶(C24-sterol methyltransferase, SMT)是植物甾醇合成途径中的关键限速酶。耳叶牛皮消(Cynanchum auriculatum)富含甾醇类活性成分,为探究SMT在耳叶牛皮消甾醇合成和非生物胁迫响应中的功能,本研究基于耳叶牛皮消转录组数据进行了SMT基因克隆,开展生物信息学分析,并利用qRT-PCR技术检测基因在非生物胁迫下的表达水平。结果表明,克隆得到ORF为1 041和1 080 bp的2个基因,分别命名为CaSMT1 (GenBank No. PV701631)和CaSMT2 (GenBank No. PV701632)。CaSMT1编码346个氨基酸,蛋白相对分子量为38.65 kD,理论等电点为6.33,为无信号肽的亲水性蛋白。CaSMT2编码359个氨基酸,蛋白相对分子量为40.16 kD,理论等电点为6.42,含跨膜结构域定位于质膜。2个CaSMT蛋白均具有典型的甾醇甲基转移酶C末端结构域,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。进化分析发现,CaSMT1和CaSMT2分属2个分支,且均与白花牛角瓜(Calotropis procera)中相应的SMT亲缘关系最近。qRT-PCR结果显示,2个基因具有明显的组织表达特性,在根和叶中的表达量较高,在茎中的表达量较低。此外,不同组织中甾苷含量表现出与基因表达量较一致的变化趋势。在盐、干旱、高温和低温等非生物胁迫下,CaSMT1的表达量均有显著上调;CaSMT2则表现出不同的胁迫响应模式,在高温和低温胁迫下表达量有显著上调,在干旱胁迫下有下降,对盐胁迫无响应,表明CaSMT参与了耳叶牛皮消对不同类型非生物胁迫的防御应答。本研究为改良药用植物抗性和提高活性成分含量提供了理论参考。

β3肾上腺素能受体(adrenoceptor beta 3, ADRB3)基因编码一种G蛋白耦联的膜表面受体,具有调节脂肪分解和能量消耗等作用。本研究采用PCR产物Sanger测序与飞行质谱(MassARRAY)相结合方法检测湖羊(Ovis aries) ADRB3基因非翻译区(untranslated regions, UTR) SNP位点多态性,并探究其与繁殖性状的关联性。结果显示,在ADRB3基因UTR区发现g.42G>T、g.2377G>T、g.2501T>A和g.2622G>A 4个SNP位点,均存在3种基因型。除g.2622G>A的优势基因型为GA,其余3个位点的优势基因型均为TT;除g.42G>T位点为低度多态(PIC<0.25),其余位点均为中度多态(0.25<PIC<0.5)。χ²检验显示4个SNP位点的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。关联分析显示,g.42G>T位点第1胎产羔数GG型个体>TT型个体>GT型个体,GG型个体第2胎产羔数大于TT和GT型个体(P<0.05),但其第2~3胎产羔间隔GT和TT型个体显著小于GG型个体(P<0.05)。g.2377G>T位点GT型个体第2~3胎产羔间隔显著小于TT型个体(P<0.05)。g.2501T>A位点TT和TA型个体第4胎产羔数显著高于AA型个体(P<0.05)。g.2622G>A位点GA型个体第3胎产羔数显著高于AA型个体(P<0.05)。单倍型分析显示,在4个SNP位点中,检测到5种单倍型和15个双倍型组合,对频率>5%的9个双倍型与繁殖性状的关联分析发现,H5H5 (TTTTTTGG)个体产羔数较高。综上,ADRB3基因可作为湖羊繁殖性状的分子标记候选基因。本研究为加速高繁殖力湖羊育种进程提供参考。

睾丸是雄性动物重要的繁殖器官,能够分泌激素、产生精子。纤维素酶是分解植物细胞壁,增强反刍动物营养吸收能力的关键因子;能量供给水平直接影响睾丸发育,由此推测纤维素酶的添加可能对湖羊(Ovis aries)羔羊的睾丸发育产生影响,为了研究开食料中添加纤维素酶对性成熟前湖羊公羔睾丸发育与精子发生的影响。本研究选择体重相近的10日龄湖羊公羔24只,随机分为2组,每组12只,实验组开食料中添加0.1%纤维素酶,于60和120日龄每组随机屠宰6只,采集睾丸组织用于大体解剖、组织学观察、激素测定、激素分泌相关基因及生殖标记基因的表达量检测。结果表明,在开食料中添加纤维素酶后60与120日龄的湖羊羔羊睾丸指数均极显著高于对照组(P<0.01),曲细精管直径极显著增大(P<0.01),至120日龄时观察到曲细精管管腔,管腔面积显著高于对照组(P<0.05)。60日龄生精上皮厚度极显著高于对照组(P<0.01),至120日龄时差异不显著。60和120日龄实验组羔羊睾丸中雄激素水平均极显著高于对照组(P<0.001),雄激素合成相关基因(类固醇激素合成急性调节蛋白(steroidogenic acute regulatory protein, StAR)与细胞色素P450家族17亚家族A1 (cytochrome P450 family 17 subfamily A member 1, CYP17A1)) mRNA表达水平呈现出相同的趋势;60和120日龄实验组羔羊睾丸生殖细胞标记基因死盒解旋酶4 (DEAD-box helicase 4, DDX4)与类无精症缺失(deleted in azoospermia like, DAZL)基因的蛋白表达量均显著高于对照组(P<0.05),mRNA相对表达水平呈现出相同的趋势。以上结果表明：开食料中添加纤维素酶能够促进性成熟前湖羊公羔的睾丸发育,促进曲精细管发育,提高雄激素分泌水平,进而能够提高生精能力。本研究为幼龄反刍动物开食料中纤维素酶的应用提供了理论依据。

宁乡猪(Sus scrofa domesticus)是我国地理性标志农产品,过大的脂滴导致背膘脂肪过厚是其主要的劣势之一。为探究宁乡猪脂滴大小的调控机制和创制出更具市场竞争力的新型宁乡猪种,本研究以脂滴包被蛋白2 (perilipin-2, PLIN2)敲除型宁乡猪为实验材料,利用透射电镜观察脂滴大小和融合现象,利用qRT-PCR和Western blot验证下游相关基因的表达情况,通过氟硼二吡咯(boron dipyrromethene, BODIPY)和油红O等相关染色方法观察脂滴大小。经过qRT-PCR筛选和Western blot验证,发现诱导细胞死亡的DNA片段化因子-α样效应因子a (cell death-inducing DNA fragmentation factor alpha-like effector A, CIDEa)表达量与脂滴大小呈正相关。本研究构建了CIDEa过表达载体,并将其转染进PLIN2敲除型宁乡猪细胞中,检测了脂滴大小,最后利用相关预测网站预测了PLIN2和CIDEa的结合位点。结果显示,敲除PLIN2后脂滴融合现象显著减少,CIDEa的表达量显著降低。AlphaFold预测显示PLIN2和CIDEa之间存在多个结合位点。结果表明,PLIN2可能通过CIDEa影响脂滴融合调控脂滴大小,本研究为探究脂滴大小调控机制提供了新的理论支持,并为创制出更具市场竞争力的新型宁乡猪种提供理论依据。

干细胞具备自我复制与多向分化能力,在再生医学等领域意义重大。双峰驼(Camelus bactrianus)作为适应极端环境的独特物种,其诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)蕴含特殊分化调控机制。本研究围绕双峰驼诱导多能干细胞(bactrian camel induced pluripotent stem cells, bciPSCs),先筛选其成骨诱导分化的最佳培养方案,再以该方案所得成骨细胞(osteoblast, OB)为对象,探索构建炎症模型的最佳药物及浓度。首先通过qRT-PCR、免疫荧光、核型分析等确定实验室所保存bciPSCs的多能性和分化能力;然后通过直接和间接两种诱导方式及两种不同培养基对bciPSCs进行诱导分化,将所获OB通过qRT-PCR、免疫荧光、蛋白印迹等实验确定成骨分化效果,并比较所获得OB纯度,确定最佳诱导方式;选取成骨诱导效率最佳方式获得的细胞构建炎症模型,使用脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)和白细胞介素-1β (interleukin-1β, IL-1β)对OB进行处理,通过CCK-8、qRT-PCR、蛋白印迹筛选出最佳药物及浓度。结果显示,实验室保存bciPSCs中多能性基因的表达与双峰驼成纤维细胞(bactrian camel embryonic fibroblasts, CEF)相比极显著上调(P<0.01),细胞在传代过程中未发生形态及多能性的改变,表明其具有分化为3个胚层细胞的能力,可用于后续研究;通过直接和间接两种诱导方式对bciPSCs进行定向诱导分化,成骨标志基因骨钙素(bone gamma-carboxyglutamate protein, BGLAP)、Ⅰ型胶原蛋白α2链(collagen type Ⅰ α2, COL1A2)、Runt相关转录因子2 (runt-related transcription factor 2, Runx2)、分泌型磷蛋白1 (secreted phosphoprotein 1, SPP1)表达水平显著上调(P<0.05),骨桥蛋白(osteopontin, OPN)和Runx2蛋白水平同样显著上调(P<0.05),免疫荧光和成骨特异性染色均呈阳性表达,通过组间比较,选择成骨特性更为明显的一组细胞进行后续研究;LPS和IL-1β处理细胞24 h后细胞活力明显下降(P<0.01),其中肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素-6 (Interleukin-6, IL6)和IL-1β的表达水平显著升高(P<0.05),其中70 ng/mL的IL-1β对炎症因子的上调更为明显,可作为构建炎症模型的条件。本研究为骨关节炎疾病发病机制及药物筛选的研究提供生物材料和参考数据。

恒河猴蛋白(rhesus proteins, Rh)是氨转运蛋白基因家族的成员,对动物氨的排泄具有重要作用。缢蛏(Sinonovacula constricta)作为围塘混养模式中的主要经济贝类,典型的埋栖行为导致其面临严峻的高氨氮环境。本研究通过生物信息学方法对缢蛏Rh基因家族进行全基因组水平的鉴定,分析其在氨氮胁迫下的表达模式,并研究了其基因功能及与氨氮耐受性的相关性。结果显示,在缢蛏全基因组水平上共鉴定出2个Rh基因家族成员(Sco-Rhbg-1和Sco-Rhbg-2),二者之间同源性为57.96%。组织表达结果显示,Sco-Rhs在鳃中特异性高表达(P<0.01),在氨氮胁迫后,2个Sco-Rhs基因的表达模式存在一定差异。随着胁迫时间的增加,Sco-Rhbg-2基因表达量先下调后升高,最后趋近于初始水平,而Sco-Rhbg-1基因呈下调趋势,且具有更强烈的响应。异源酵母互补实验结果显示,Sco-Rhbg-1蛋白是一个有功能的氨转运蛋白,并且其转运NH₄⁺的能力不受外界pH的影响。同时在Sco-Rhbg-1基因CDS区中鉴定出15个与缢蛏氨氮耐受性相关的SNPs位点。本研究表明,Sco-Rhbg-1基因在氨氮胁迫中具有重要的调节作用,可为后续深入探究Sco-Rhs在高氨氮适应中的分子调控及分子标记辅助育种提供重要的理论基础。

小麦(Triticum aestvum)纹枯病作为一种常见的土传真菌病害,已成为制约小麦产量的重要因素。本研究以禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)为研究对象,以聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)介导的遗传转化体系,获得带有GFP标记的能够稳定遗传的转化子;将该转化子侵染小麦,通过徒手切片观察,明确了禾谷丝核菌在小麦中的定殖规律。研究发现,通过PEG介导将携带GFP的质粒转入原生质体,并在含有100 mg/mL潮霉素的PDA培养基中进行筛选,获得了阳性转化子。经PCR检测及荧光观察,表明携带GFP的质粒已成功转入禾谷丝核菌中。经过连续传代培养,阳性转化子能够稳定表达,且其致病性与野生型一致。在小麦接种转化子后第4天,可在小麦根部木质部观察到明显荧光,第7天在小麦胚芽鞘韧皮部也可观察到明显荧光。本研究成功获得了带有GFP标记且具有良好遗传稳定性的禾谷丝核菌,并初步阐明了禾谷丝核菌在小麦中的定殖规律,为后续深入研究禾谷丝核菌的致病机制及利用微生物菌剂防治纹枯病提供了理论依据。

豇豆(Vigna unguiculata)根腐病主要是由茄病镰孢菌(Fusarium solani)引起的一种严重的真菌性土传病害,该病害在豇豆苗期易发生,在海南地区较为严重且难以防控。目前尚无效果良好的微生物菌剂。本研究在豇豆根际土壤中分离得到了1株对茄病镰孢菌具有显著抑制效果的菌株ZF520。通过形态学观察、生理生化特征测定及多基因系统发育树分析,鉴定其为贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)。经抑菌谱分析,菌株ZF520对6种病原真菌(尖孢镰孢菌(F. oxysporum), 西瓜壳二孢(Ascochyta citrullina), 立枯丝核菌(Rhizoctonia solani), 茄病镰孢菌(F. solani), 多主棒孢菌(Corynespora cassiicola), 灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea))具有显著拮抗作用。盆栽实验结果表明,接种ZF520发酵液后根腐病发病的病情指数显著降低,防效可达71.82%。制备ZF520种衣剂对豇豆种子进行包衣,在不影响出苗率的前提下,对豇豆根腐病的防效可达76.67%,优于对照23%吡虫·咯·苯甲悬浮种衣剂的防效。使用ZF520发酵菌液制备的微生物种衣剂有效活菌数为1.5×10⁹ CFU/mL,包衣处理的菌株在豇豆根部可维持约2.3×10⁵ CFU/g的定殖量水平,初步显示出在苗期阶段可能通过拮抗作用降低病原菌侵染风险的潜力。综上所述,本研究所分离菌株ZF520对豇豆根腐病具有良好的生防潜力和应用前景。

木质纤维素是农业废弃物秸秆中的主要成分之一,其复杂的结构限制了纤维素的降解效率,导致秸秆资源化利用率偏低。为了农业废弃物的高效利用,本研究从吉林省延边朝鲜族自治州的土壤、酒糟和野外大型真菌样品中筛选出17株能够在秸秆粉培养基上生长的真菌,并通过愈创木酚培养基初筛和漆酶活性测定复筛,最终筛选出1株高效产漆酶的真菌—硬毛粗盖孔菌(Coriolopsis trogii) LFB-F1。通过全基因组测序和生物信息学分析,揭示了该菌株的基因组特征及其木质素降解相关基因的分布。结果表明,LFB-F1基因组总长度为38.8 Mb,GC含量为54.93%,包含7 497个编码基因,其中134个为碳水化合物活性酶(carbohydrate-active enzymes, CAZymes),包括1个漆酶基因和5个木质素过氧化物酶基因。生物学特性分析表明,LFB-F1在30 ℃和pH 5.5条件下表现出最佳生长状态,并具有较强的生物量积累能力。对LFB-F1的漆酶酶学性质研究表明,LFB-F1所产漆酶的最适pH为4.5,最适温度为45 ℃,且在35 ℃下表现出良好的温度稳定性。金属离子对漆酶活性的影响研究表明,Cu²⁺和Fe²⁺对酶活性影响较小,而Mn²⁺表现出强烈的抑制作用。此外,漆酶在4 ℃下储存90 d后仍保持92.5%的活性,显示出优异的储存稳定性。综上所述,本研究筛选获得的硬毛粗盖孔菌LFB-F1具有木质素降解潜力。本研究筛选的高效降解木质素的真菌,可为农业废弃物资源化和高值化利用提供理论和技术支持。

DCL (Dicer-like protein)蛋白是RNA干扰(RNA interference, RNAi)途径中的关键酶,负责将双链RNA (double-strand RNA, dsRNA)或前体miRNA (pre-miRNA)加工成小干扰RNA (siRNA)或成熟miRNA,进而引导mRNA降解或基因表达抑制。水稻(Oryza sativa)基因组编码8个DCL蛋白(OsDCL),在底物选择性、小RNA (small RNA, sRNA)产物长度及生物学功能等方面呈现明显分化。本综述总结了OsDCL在不同类型sRNA加工过程中的功能分化及机制、在生长发育和重要农艺性状调控中的功能特化、自身活性调控机制,分析了OsDCL介导的RNA沉默途径在水稻杂种优势形成中的潜在作用,探讨了OsDCL在育种及品种改良方面的应用价值。深入研究OsDCL,将有助于全面理解RNA沉默途径在水稻乃至禾本科作物中的作用,并为揭示杂种优势形成机制、创制优良农艺性状新种质提供理论基础和技术支撑。

花粉管通道遗传转化技术作为一种常用的遗传转化方法,具有操作简便、不依赖于基因型,并可直接获得转基因种子等优势。尽管存在外界环境、植物自然花期和有限开花次数等限制因素的影响,但花粉管通道遗传转化技术对多数植物,尤其是基因型依赖型物种仍较为适用。本文综述了该方法的产生、分类及特点,讨论了影响其遗传转化效率的主要因素和转化机理研究进展,并与农杆菌介导的转化法作比较讨论,最后阐述了花粉管通道法的应用现状、存在的问题及应用前景展望,为建立或优化一种快速、高效的植物花粉管通道遗传转化技术提供理论参考。

林麝(Moschus berezovskii)作为国家一级保护动物,其雄性分泌的麝香具有重要的药用价值,而S100A8蛋白作为钙结合蛋白家族成员,在炎症反应中发挥着重要的作用。因此针对林麝人工养殖中的健康监测需求,建立S100A8双抗体夹心ELISA检测方法,实现对林麝血清样本中S100A8的检测。本研究构建pET28a-B2M原核表达载体以获取S100A8重组蛋白,通过多点注射新西兰大白兔(Oryctolagus cuniculus)获得兔源多克隆抗体;通过杂交瘤技术,制备鼠源S100A8单克隆抗体,并将其作为捕获抗体;将辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP）标记的兔源S100A8多克隆抗体作为检测抗体,建立林麝S100A8双抗体夹心ELISA定量检测方法,对抗体浓度或稀释比、最适包被条件和孵育条件等进行优化,并采用建立的ELISA方法对31个林麝血清样本进行特异性检测。结果表明,Ni²⁺柱亲和层析获得重组蛋白的浓度为5 mg/mL,纯度为85%以上;间接ELISA表明,小鼠和HRP-兔抗S100A8抗体效价均高于1∶50 000。当捕获抗体浓度为4 μg/mL而检测抗体稀释比例为1∶2 000时,为最佳捕获抗体包被浓度和检测抗体工作浓度。本研究所建立的双抗体夹心ELISA方法最低灵敏度为15.625 ng/mL;可特异区分有炎症样本和正常样本。本研究成功建立双抗体夹心ELISA检测方法,实现对血清样品中S100A8蛋白的定量检测,有望应用于全面评估林麝的健康状况,并为疾病的早期诊断和治疗提供支持。

中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV)于2012年首次被发现,主要感染单峰骆驼 (Camelus dromedarius)和人类(Homo sapiens)。纳米抗体因其独特的优势受到关注。本研究针对MERS-CoV纳米抗体开展分子设计、工程酵母表达和制备,以及生物活性检测等研究。首先,基于前期筛选得到的Nb1和Nb2纳米抗体,通过扩增纳米抗体基因,构建单价Nb1、Nb2及双特异性Nb3真核表达载体,筛选毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞高表达菌株。结合纳米抗体理化特性,采用亲和、离子交换及分子筛层析探索纯化工艺,制备无标签的单价及双特异性抗体。利用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)和生物膜干涉技术(biolayer interferometry, BLI)评估纳米抗体与抗原结合能力,并通过假病毒中和试验验证生物活性。最终获得了单价Nb1、Nb2及双特异性Nb3高纯度无标签纳米抗体,Nb3与抗原结合活性最优,最大半数有效浓度(effcient concentrations of half-maximal, EC₅₀)为8.419 nmol/L。利用Huh-7细胞检测发现Nb2的中和活性最高,最大半数抑制浓度(inhibitory concentrations of half-maximal, IC₅₀)为1.126 nmol/L。本研究成功制备了靶向MERS-CoV的3种纳米抗体,为纳米抗体的优化及酵母制备提供了参考,为MERS-CoV治疗性药物的开发提供了技术基础。

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸道综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的母猪(Sus scrofa)繁殖障碍和仔猪呼吸系统疾病为主的一类急性传染病,长期严重危害我国生猪养殖业。当前我国采取以净化为主的防控方针,因此PRRSV抗体监测与野毒感染防控成为净化关键,亟待建立一种新型、快速、灵敏、低成本且全自动的PRRSV抗体检测方法。本研究基于化学发光免疫分析技术(chemiluminescence immunoassay, CLIA),通过构建重组表达质粒pET-28a-N-SUMO,原核表达重组核衣壳(nucleocapsid, N)蛋白,以Western blot验证其反应原性。以纯化的重组N蛋白为抗原,建立间接的化学发光抗体检测方法,并对方法的特异性、灵敏度、重复性进行评估。同时,利用该方法与PRRSV商品化抗体检测间接ELISA试剂盒对收集的田间样本平行检测,以进行符合率评价。结果显示,建立的PRRSV N蛋白间接CLIA方法,待检血清OD₄₃₅发光值≥13 438为阳性,与常见猪病毒抗体阳性血清无交叉反应,重复变异系数均小于7.19%,检测下限是常规ELISA商品化试剂盒的4倍,用间接CLIA法对四川和辽宁部分地区193份血清进行检测,与商品化试剂盒检测结果的Kappa值为0.924。结果表明,该方法具有较高的特异性、敏感性和重复性,检测时长约为35 min。本研究成功建立了基于PRRSV N重组蛋白的抗体检测间接CLIA方法,其灵敏度高,重复性好,可用于猪血清中PRRSV抗体的快速检测。本研究为为PRRSV免疫监测和疫情防控、净化提供了技术支撑。

当前基因编辑产品检测多依赖于基因组测序分析和PCR等方法,这些方法耗时长、成本高,且需要大型仪器设备。为建立一种快速、灵敏、可视化并适用于基因编辑作物检测的方法,本研究根据水稻(Oryza sativa)蔗糖转运蛋白14 (sugar will eventually be exported transporter 14, SWEET14)基因编辑材料设计特异性引物及单链向导RNA (single guide RNA, sgRNA),采用重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification, RPA)与CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas (CRISPR-associated protein) 12b技术并结合侧流层析试纸条(lateral flow strips, LFS)检测基因编辑水稻。结果表明,RPA-CRISPR/Cas12b系统结合LFS方法在最多33 min内便可使检测结果通过试纸条可视化呈现,检测灵敏度为100 fg/μL。本研究开发的RPA-CRISPR/Cas12b-LFS检测方法操作简便、快速,不需要大型仪器设备,可为实验条件有限的现场快速检测提供技术支撑。