前期通过高通量测序发现,受体互作丝氨酸苏氨酸激酶2 (receptor interacting serine/threonine kinase 2, RIPK2)介导的NOD/RIPK2信号通路在鸡(Gallus gallus)免疫炎症反应过程中显著性富集。为研究RIPK2在鸡巨噬细胞系(chicken macrophage cell line, HD11)中免疫炎症的功能,本研究采用慢病毒(Lentivirus)介导的RNA干扰技术,建立了稳定干扰RIPK2基因表达的HD11。根据鸡RIPK2基因的序列,设计了3个RNA干扰靶点序列和1个阴性对照序列,连接到pLVshRNA-EGFP(2A)Puro干扰载体,瞬时转染HD11。利用qRT-PCR技术检测各靶点对RIPK2的干扰效率,将干扰效率最佳的重组载体进行慢病毒包裹。利用包裹干扰载体的慢病毒感染HD11,采用qRT-PCR及Western blot检测不同实验组中RIPK2及NOD/RIPK2信号通路下游关键基因：核因子-κB激酶复合物抑制剂(component of inhibitor of nuclear factor kappa B kinase complex, IKKα)、因子-κB激酶亚单位β抑制剂(inhibitor of nuclear factor kappa B kinase subunit beta, IKKβ)、核因子κB亚单位1 (nuclear factor kappa B subunit 1, NFκB)和白细胞介素1β (interleukin 1 beta, IL1β)的表达量变化。同时构建了RIPK2过表达载体(pcDNA3.1-RIPK2),并以此载体开展RIPK2基因的拯救实验。构建了3条靶向RIPK2的慢病毒干扰表达载体RIPK2-shRNA1 (小发卡RNA1, short hairpin RNA 1)、RIPK2-shRNA2和RIPK2-shRNA3,其中RIPK2-shRNA1和RIPK2-shRNA3重组质粒对RIPK2基因的干扰效率分别为(77.4±0.61)%和(90.21±0.68)%。将RIPK2-shRNA3重组质粒进行慢病毒包裹,获得病毒滴度为2×10⁸ TU/mL;将RIPK2-shRNA3慢病毒转染HD11,干扰组RIPK2 mRNA和蛋白表达水平较对照组显著性降低(P<0.05),NOD/RIPK2信号通路下游关键基因IKKα、 IKKβ、NFκB和IL1β的表达量发生了显著下调(P<0.05);干扰组转染RIPK2过表达载体(pcDNA3.1-RIPK2)后RIPK2的表达水平能够恢复。本研究成功构建了靶向鸡RIPK2的shRNA慢病毒表达载体,可有效沉默RIPK2基因在HD11中的表达,并且稳定表达RIPK2-shRNA3的HD11可干扰NOD/RIPK2信号转导,为进一步分析RIPK2参与的NOD/RIPK2信号通路的功能研究提供理论依据。

胚胎发育晚期丰富蛋白-2 (late embryogenesis abundant proteins-2, LEA-2)基因家族在植物生长发育和逆境胁迫中起重要作用。为了探究玉米(Zea mays) LEA-2家族蛋白对干旱胁迫的响应,本研究对玉米、高粱(Sorghum bicolor)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的LEA-2进行蛋白序列比对,对ZmLEA-2家族基因进行了基因结构、保守基序的分析,及其在染色体上的位置及玉米种间的共线性分析,同时进行了玉米、高粱和拟南芥中LEA-2基因的共线性分析;依据转录组数据对ZmLEA-2家族基因进行了表达模式分析,并对ZmLEA53的功能进行了初步验证。结果表明：玉米中共鉴定出81个ZmLEA-2基因,在10条染色体上不均匀地分布;系统进化树分析表明,81个ZmLEA-2基因可分为7组,同一组基因间具有相似的基因结构及保守基序个数和排序。表达模式分析显示,81个ZmLEA-2基因呈现不同的表达模式。干旱胁迫下,ZmLEA53、ZmLEA7和ZmLEA64等基因表达量上升,复水后表达量下降,推测这些基因参与了玉米耐旱性调控。ZmLEA53的过表达可以提高酵母(Saccharomyces)菌株在干旱(PEG)、盐和高温胁迫下的生存率。研究结果为探索ZmLEA-2基因家族功能及解析其在干旱胁迫响应中作用途径提供参考。

绿豆(Vigna radiata)是我国主要的杂粮作物,开花时间对绿豆产量、品质和生育周期具有重要影响。FLOWERING LOCUS T (FT)基因在植物开花途径中扮演着重要的角色,是植物开花调控网络的关键基因。为探讨FT家族同源基因在绿豆光周期开花中的调控作用,本研究从光敏感型绿豆品种'新郑'中克隆获得了VrFT2a (GenBank NO. XM_014651110)基因的全长cDNA序列,并对其基因序列、编码蛋白特征及其在不同组织及不同光周期下24 h内的表达模式进行了分析。结果显示,VrFT2a基因的启动子区域存在9个光响应元件,cDNA全长531 bp,编码176个氨基酸,其中第27~162位氨基酸为高度保守的磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidylethanolamine-binding protein, PEBP)家族结构域;编码蛋白属于非分泌性亲水蛋白且无信号肽,亚细胞定位于细胞膜和细胞核。系统发育分析显示,VrFT2a蛋白与多个物种FT蛋白的氨基酸序列具有较高的一致性,且与GmFT2a、AtFT蛋白具有相似的蛋白结构域及促进植物开花的FT保守氨基酸位点(Tyr85/Gln140)。qRT-PCR结果显示,VrFT2a在绿豆不同组织中均有表达且在三出复叶中表达量最高;VrFT2a表达受到日照长短的影响,在长、短日照下均表现出昼夜节律性,且显著受到短日照的特异性诱导;推测VrFT2a基因可能参与了绿豆光周期开花调控途径。本研究为进一步解析FT家族基因参与绿豆开花调控通路的分子机制提供理论参考。

枯萎病(Fusarium wilt)严重危害海岛棉(Gossypium barbadense)生长发育,目前相关报道中鲜见来自海岛棉自身的抗病基因。前期基于海岛棉接种枯萎病菌(Fusarium oxysporum)后的转录组数据,筛选鉴定出抗性相关的尿苷二磷酸葡萄糖糖基转移酶73C1基因(uridine diphosphate glycosyltransferase 73C1, UGT73C1)。本研究通过对海岛棉基因组进行查找,获得UGT73C1的CDS全长,从高抗枯萎病海岛棉品种'06-146'中克隆出该基因,对其进行生物信息学分析,并利用抗病材料'06-146'和感病材料'新海14'接种枯萎病菌,进行基因表达分析。结果显示,GbUGT73C1基因CDS全长1 486 bp,编码476个氨基酸,编码蛋白为疏水、脂溶性、不稳定蛋白,无跨膜结构,无信号肽,具有GT-B (glycocyltransferase-B)结构,属于糖基转移酶GT-B型超级家族。预测GbUGT73C1蛋白定位在细胞质中,分子系统进化关系预测显示与海岛棉和雷蒙德氏棉(G. raimondii)亲缘关系最近。GbUGT73C1基因在抗病品种'06-146'中迅速表达、且表达水平极显著高于感病品种(P<0.01),表明海岛棉抗枯萎病材料'06-146'是通过更快速、更高量表达GbUGT73C1基因来抵御枯萎病侵染的。该研究为深入研究GbUGT73C1基因响应海岛棉抵御枯萎病作用机制提供参考,为棉花抗病分子育种提供重要基因资源。

芹菜(Apium graveolens)是重要的叶菜类蔬菜,具有很高的营养价值和多种药用功能。采后芹菜贮藏过程中的叶绿素含量是评价芹菜品质的重要指标之一。采后不同贮藏条件对芹菜叶绿素含量的影响及其分子机制尚不清楚。本研究以'四季小香芹'和'六合黄心芹'为实验材料,设置室温(25 ℃)、低温(4 ℃)和室温黑暗(25 ℃) 3个不同的贮藏条件,分别测定0、6、24、30、48和54 h的芹菜叶片叶绿素含量,并通过荧光定量PCR检测叶绿素代谢相关基因(AgMPE, AgPPH, AgPAO, AgCAO, AgNOL和AgHCAR)的表达水平。结果显示,低温条件下叶绿素a和叶绿素b含量的均值最高;除24和30 h以外,叶绿素总积累量均在低温贮藏时最高;室温黑暗条件下总叶绿素含量高于室温条件;AgCAO基因的转录水平随贮藏时间的增加发生显著的变化,且与叶绿素b的积累模式一致。研究结果表明,低温贮藏条件抑制了芹菜叶绿素的降解,能够更好地保持芹菜叶绿素含量,维持芹菜的营养品质和感官品质。本研究为探究采后芹菜叶绿素的积累规律及相关基因的调控模式提供了参考。

钙调蛋白转录因子(calmodulin-binding transcription factor, CAMTA)在植物生长发育、响应生物和非生物逆境胁迫过程中发挥重要调控作用。黄麻(Corchorus capsularis)是一种十分重要的草本韧皮纤维经济作物,为研究黄麻中CAMTA在干旱逆境响应中的作用,本研究以圆果黄麻'黄麻179'为材料,根据黄麻基因组测序的CAMTA基因序列(Cc.02G0003260)设计引物,用RT-PCR技术克隆获得CAMTA基因,命名为CAMTA1 (GenBank No. OK415793)。序列分析表明,CAMTA1基因包含13个外显子,12个内含子,其开放阅读框为3 051 bp,编码1个含1 016个氨基酸的蛋白质,具有CAMTA类蛋白所具有的CG-1结构域、TIG结构域、ANK重复序列以及IQ基序。通过蛋白序列比对发现CAMTA1与锦葵科植物的CAMTA蛋白质同源性较高。qPCR分析表明CAMTA1基因在根、茎、叶和果皮中均有表达,在干旱胁迫诱导后6.0 h时叶片中的CAMTA1基因表达量达到最高。荧光素酶蛋白互补实验表明,CAMTA1能与另一类逆境响应转录因子AP2/ERF相互作用,共同调控植物的生长发育及响应生物与非生物胁迫。研究结果为进一步阐明CAMTA1基因参与植物干旱响应的分子机理提供参考。

纤维素合成酶基因超级家族包括纤维素合成酶(cellulose synthase, CesA)和类纤维素合成酶(cellulose synthase-like, Csl)基因家族,参与纤维素、半纤维素和果胶等多糖的生物合成,在植物细胞壁的形成中起着重要作用。本研究在桃(Prunus persica)基因组中鉴定出36个PpCesA/Csl基因家族成员,分别编码394~1 527个氨基酸,蛋白质平均分子量为44.85~171.80 kD,内含子数量为4~16,包含20个不同的基序。PpCesA/ Csl蛋白的亚细胞定位具有多样性,可在叶绿体、高尔基体、细胞膜、细胞质及线粒体中定位。系统进化分析表明,PpCesA/Csl分为7个亚族(CesA, CslA, CslB, CslC, CslD, CslE和CslG)。所有PpCesA/Csl蛋白都含有7个跨膜结构域,其中27个成员含有纤维素合成酶结构域PF03552,9个成员含有糖基转移酶家族2结构域PF00535;另外,除PpCesA2外其他8个PpCesA亚族成员均含有锌指结构域zf-UDP,除PpCslD1外其他4个CslD亚族成员均含有锌指结构域zf-RING_4。PpCesA/Csl蛋白的主要保守活性位点是天冬氨酸D、D、D残基,其次是QxxRW基序。通过qPCR分析PpCesA6、PpCesA8、PpCslD2、PpCslE7、PpCslG1在不同组织、果实不同发育期和贮藏期的表达特性。结果显示,PpCesA6和PpCslG1在生殖器官花和果实中表达量较高,PpCesA8在果实和新梢中表达量较高,而PpCslD2在果实和根以及PpCslE7在根和花中表达量较高。在果实发育期,PpCesA6、PpCesA8和PpCslD2均在盛花后65 d达到表达峰值;而PpCslE7和PpCslG1分别在盛花后80 d和盛花后35 d出现表达量高峰。在果实贮藏期,PpCslD2和PpCslE7在两品种中均呈现上调表达趋势,而PpCesA8呈下调表达趋势;PpCslG1在'秦王'果实的贮藏前期高表达,而在'沙红'果实贮藏期表达量极低。本研究为桃和蔷薇科其他植物CesA/Csl基因的进一步功能研究提供了基础资料。

核因子Y (nuclear factor Y, NF-Y)是一种广泛存在于真核生物中的转录因子,参与植物的生长发育以及生物和非生物胁迫响应过程。闽楠(Phoebe bournei)是我国南方重要的经济用材树种,水分匮缺严重影响其生长和木材积累,挖掘闽楠抗旱响应因子将为提高其抗旱性提供支持。本研究对闽楠NF-Y (PbNF-Y)基因家族进行全基因组鉴定和生物信息学分析,并利用qPCR技术分析PbNF-Ys的组织表达特异性及干旱胁迫下的表达模式。结果显示,在闽楠全基因组范围内共鉴定出40个PbNF-Y,分为3个亚家族,不均匀分布于11条染色体;PbNF-Ys蛋白分子质量在10 774.45 (PbNF-YB11)~39 576.26 D (PbNF-YA2)之间,均为亲水性蛋白;启动子顺式作用元件分析发现,PbNF-Ys启动子区域存在生长素、赤霉素及茉莉酸甲酯等激素响应元件、光响应元件、生长发育相关响应元件和干旱胁迫相关元件;采用qPCR方法对根、茎和叶片进行组织表达分析,结果显示,PbNF-Ys的表达具有明显的组织特异性。干旱胁迫后表达模式分析发现,17个PbNF-Y在干旱胁迫后表现不同程度的上调表达,16个PbNF-Y表达下调,7个PbNF-Y表达没有显著变化。本研究为闽楠NF-Y基因家族生物学功能和进化的深入研究提供参考依据。

肌肉生长抑制素(myostatin, MSTN)基因是肌肉发育的负调控因子,可调控细胞增殖。为探讨该基因突变在调控肌肉卫星细胞(muscle-derived satellite cells, MDSCs)增殖分化中的作用机制,本研究以分离培养的MSTN基因突变型(MSTN mutant, MT)和野生型(wild type, WT)蒙古牛(Bos taurus) MDSCs为研究对象,对其增殖及分化过程中的细胞周期和基因表达变化进行检测。EdU增殖实验结果显示,MSTN基因突变型肌肉卫星细胞增殖指数(0.78±0.06)显著高于野生型细胞(0.57±0.04),表明MSTN基因突变的细胞增殖加快。当加入诱导液向成肌分化诱导时,MSTN基因突变细胞在诱导1 d后出现分化的肌管,而野生型细胞在诱导2 d后开始分化;利用流式细胞术进一步分析成肌诱导对细胞周期的影响,发现MSTN突变型细胞在诱导1 d后细胞周期开始停滞在G1/S期,野生型细胞在诱导2 d后细胞周期出现停滞,这些结果表明,当细胞被诱导分化时,MSTN突变细胞先于野生型细胞退出细胞周期而进入分化状态。通过qPCR和Western blot对细胞周期相关基因和蛋白的表达进行检测,结果显示,在MSTN基因突变细胞中,CyclinA表达显著上调(19.5倍),而细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子1C (cyclin-dependent kinase inhibitor 1C, CDKN1C)的表达被显著抑制(0.9%),提示CyclinA和 CDKN1C在MSTN基因突变调控肌肉卫星细胞增殖分化的过程中可能具有重要作用。通过JASPAR数据库进行在线预测,发现MSTN信号通路中关键转录因子SMAD2/SMAD3可能与CDKN1C基因的启动子结合;进一步的ChIP-qPCR实验结果显示,SMAD2/SMAD3可与CDKN1C启动子直接结合,并促进CDKN1C基因表达。上述结果提示,MSTN基因突变可能通过下调SMAD2/SMAD3转录因子与CDKN1C启动子的结合,从而抑制CDKN1C基因表达,进而上调CyclinA-CDK2表达,最终促进DNA合成和细胞周期进程。本研究为MSTN基因突变促进肌肉发育发掘了新的作用机制,为制备肌肉发达的基因编辑动物提供了参考依据。

细胞色素P450c17 (cytochrome P450c17, CYP17A1)及细胞色素P450芳香化酶(cytochrome P450arom, CYP19A1)对卵泡发育、排卵、主要生殖激素分泌及合成均有重要作用,并影响动物的繁殖性能。本研究以健康黔北麻羊(Capra hircus)为研究对象,利用qPCR检测CYP17A1、CYP19A1基因的组织表达,以PCR直接测序法筛选SNP突变位点,通过建立一般线性模型分析SNPs对黔北麻羊不同胎次产羔数的影响;分析了CYP17A1、CYP19A1基因在各组织中的表达规律及SNPs与产羔数之间的关联性。结果显示,CYP17A1基因在单、多羔个体卵巢均表达最高,且极显著高于垂体、下丘脑、子宫、输卵管(P<0.01);CYP19A1基因在多羔卵巢及子宫表达较高,且均极显著高于对应单羔组织(P<0.01)。CYP17A1基因编码区共检测出7个SNPs,g.59G>C、g.128G>A、g.129A>G、g.164T>C均位于第1外显子,g.2045G>A位于第2外显子,g.4387G>A和g.4456C>T位于第6外显子;关联性分析表明,CYP17A1基因SNPs与黔北麻羊产羔数均不相关。CYP19A1基因编码区第9外显子检测出一个变异位点g.48818C>A,其AA基因型的产羔数显著高于CA基因型(P<0.05),与CC基因型产羔数差异不显著。结果表明,黔北麻羊CYP17A1、CYP19A1基因在多羔个体卵巢组织中均表达最高(P<0.01);CYP17A1基因SNPs与黔北麻羊产羔数之间不相关,CYP19A1基因g.48818C>A位点AA基因型150只羊中仅存在4只,因样本量少,还需验证。本研究为进一步探究CYP17A1、CYP19A1基因变异与动物繁殖繁育之间的关系提供了基础数据。

肌醇1, 4, 5-三磷酸受体2型(inositol 1,4,5-triphosphate receptor type 2, IP3R2)是位于内质网的细胞内Ca²⁺释放通道,通过调控Ca²⁺释放而影响蛋壳品质。为阐明IP3R2蛋白结构域对鸭(Anas platyrhyncha domestica)子宫内膜上皮细胞Ca²⁺分泌的调控效应及其对钙转运相关基因的影响,本研究以蛋鸭品种三穗鸭为研究对象,构建IP3R2蛋白结构域的表达载体pCDNA3.1-IP3R2,转染至鸭子宫内膜上皮细胞,以Flag标签ELISA检测试剂盒确定IP3R2蛋白结构域的表达量;以Fluo-3/AM钙离子荧光标记检测胞内Ca²⁺含量;以qPCR检测不同结构域过表达量及离子转运相关基因的mRNA水平。结果显示,MIR、RYDR_ITPR(1)、RYDR_ITPR(2)、RIH_assoc和Ion_trans结构域过表达均引起鸭子宫内膜上皮细胞内Ca²⁺浓度下降;RYDR_ITPR(1)和IP3R2-Ion_trans的表达量与胞内Ca²⁺浓度显著负相关(P<0.05);RYDR_ITPR(2)、RIH_assoc和5个结构域共转染的表达量与胞内Ca²⁺浓度极显著负相关(P<0.01);RYDR_ITPR(2)结构域表达量与RYR2、KCNJ15和CA2基因表达量呈显著正相关(P<0.05);MIR结构域过表达量与IP3R1、CALB1和CA2的基因表达量呈现显著正相关(P<0.05),2个RYDR_ITPR结构域过表达量均与KCNJ15和RYR2基因表达量呈显著正相关(P<0.05);RIH_assoc结构域过表达量与IP3R2和ORAI1基因表达量呈显著正相关(P<0.05);Ion_trans结构域过表达量与CALB1、SLC8A1 和CA2基因表达量呈显著正相关(P<0.05);5个结构域共转染后的表达量与CFTR基因表达量呈显著正相关、与TRPV6呈显著负相关(P<0.05)。上述结果提示,5个IP3R2蛋白结构域的过表达可能引起鸭子宫内膜上皮细胞内Ca²⁺向胞外释放,对细胞中20个离子转运基因表达水平的调控效应存在差异。本研究可为分子遗传标记选择和鸭蛋壳品质提高提供参考依据。

在植物病原真菌中,CWI-MAPK (cell wall integrity - mitogen-activated protein kinase)级联途径主要参与调控病菌细胞壁完整性、细胞周期以及致病性等,Swi4是该级联途径下游关键转录因子。在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中,转录因子ScSwi4作为一种调控表达元件参与细胞壁的生物合成及细胞周期调控,但其同源基因在丝状病原真菌中的功能鲜见报道。玉米大斑病(northern leaf blight of corn)由大斑刚毛座腔菌(Setosphaeria turcica)引起,本研究克隆获得玉米大斑病菌StSwi4基因,对其序列及编码蛋白质进行特征分析,发现其DNA全长为2 247 bp,cDNA全长为2 037 bp,含有3个外显子和2个内含子,编码678个氨基酸;StSwi4蛋白包含1个KilA-N保守结构域和2个ANK保守结构域。对该蛋白的系统进化关系分析发现,玉米大斑病菌与梨黑斑链格孢菌(Alternaria gaisen)、烟草赤星病菌(A. alternate)、番茄匐柄霉菌(Stemphylium solani)的进化关系较近。利用IPTG诱导StSwi4-His融合蛋白表达,利用镍柱亲和层析技术获得其纯化蛋白,SDS-PAGE和Western blot结果表明,该融合蛋白可以在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达。利用qPCR技术分析StSwi4基因在病菌不同发育时期的表达模式,发现该基因在分生孢子时期的表达水平最高。本研究明确了转录因子基因StSwi4的结构特征及表达模式,为深入揭示其在病菌致病过程中的分子机制提供基础资料。

化肥过量施用导致土壤环境恶化,严重影响作物生产。高碳基肥在改善农田土壤生态环境方面起到重要作用,对土壤肥力和微生物多样性影响较大。本研究通过田间试验,针对植烟土壤设置5个处理,NF (不施肥)、GCK (常规施肥纯氮为111 kg/hm²)、G3 (高碳基肥料450 kg/hm²+99.9 kg/hm²纯氮)(减氮10%)、G5 (高碳基肥料750 kg/hm²+88.8 kg/hm²纯氮)(减氮20%)、G7 (高碳基肥料1 050 kg/hm²+77.7 kg/hm² 纯氮)(减氮30%)。采用高通量测序技术对土壤细菌多样性进行分析和土壤化学成分测定,明确高碳基肥减氮施用对土壤肥力和细菌多样性的影响。结果显示,1)高碳基肥减氮施用能够提高土壤pH、碱解氮、速效磷和 速效钾的含量。移栽后90 d,G7处理的土壤pH、碱解氮、速效磷和速效钾分别提高了23.49%、8.78%、20.28%和27.81%。2)高碳基肥减氮施用对细菌多样性影响较大。在门水平上,G7处理提高了变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度,在移栽后30和60 d分别比对照提高了9.93%和2.28%。G3处理在移栽后60 d提高了拟杆菌门(Bacteroidetes)相对丰度,与对照相比提高了93.42%。高碳基肥减氮施用降低了酸杆菌门(Acidobacteria)相对丰度,其中G7处理在移栽后30 d降幅最大,相较于对照降低了35.39%。属水平上,G7处理在移栽后30和60 d提高了鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)和假节杆菌属(Pseudarthrobacter)的相对丰度,在移栽后60 d降低了产黄杆菌属(Rhodanobacter)的相对丰度。整体来看,G7 处理对细菌多样性影响较大。3)冗余分析(redundancy analysis, RDA)表明,土壤pH、速效钾、速效磷和碱解氮均与变形菌门、拟杆菌门、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)呈正相关关系。施用1 050 kg/hm²高碳基肥+77.7 kg/hm²纯氮(减氮30%)对土壤肥力改善效果最优,对土壤细菌多样性影响较大。本研究为进一步探究高碳基肥减氮施用改良土壤及其对土壤微生物多样性的影响提供了科学线索。

MYC (myelocytomatosis)转录因子(transcription factors, TFs)是茉莉酸(jasmonic acid, JA)信号转导通路的核心调控因子,参与植物的生长发育、次生代谢物的合成、逆境应答、植物激素信号转导及其通路之间的相互作用。本文针对植物MYC转录因子,从序列特征、结构特点、功能特性及其在生物和非生物胁迫中的作用机制等方面进行研究进展综述。本文为进一步深入探讨MYC转录因子的功能作用和调控模式积累基础资料。

近年来,中药光慈菇的应用趋热,市场需求旺盛,但伪品混杂现象严重,研发基于DNA检测技术的鉴别试剂盒对于该药材具有重要的现实意义。本研究基于本课题组前期对光慈菇及其混、伪品构建的系统发育树及在对内转录间隔区(internal transcribed spacers, ITS)序列分析的基础上设计光慈菇特异性PCR引物,优化特异性检测试剂使用和反应条件,根据诊断试剂盒评价标准研制光慈菇检测试剂盒。对试剂盒的特异性、检测限、重复性、保存期以及稳定性进行了评价。根据检测结果,该试剂盒具有良好的特异性(检测限为0.03 μg/μL)和极好的稳定性,且保存时间长。本研究开发的道地中药材光慈菇的特异性鉴别试剂盒可对光慈菇准确、快速、灵敏地鉴别,具有广阔的应用前景。

甘蔗(Saccharum officinarum)是我国最重要的糖料作物,甘蔗梢腐病(Pokkah boeng)对我国蔗糖产业高质量发展带来严重威胁。本研究基于甘蔗梢腐病主要病原菌拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)和层出镰孢(Fusarium proliferatum)的核糖体DNA内转录间隔区(nuclear ribosomal DNA internal transcribed spacer, rDNA-ITS)序列分别设计了特异性引物,并对采自云南省不同蔗区不同主栽品种上的117份典型甘蔗梢腐病样品进行了PCR分子检测,明确了该区域这2种甘蔗梢腐病主要病原菌的发生情况。结果表明,引物Fp-F3/Fp-R3可从拟轮枝镰孢菌及其侵染甘蔗中扩增出400 bp的特异性片段,而其他甘蔗病害病原菌均未扩增出此片段,该引物最低能检测到的拟轮枝镰孢菌DNA浓度为30 pg/µL;引物Fp-F4/Fp-R4可从层出镰孢菌及其侵染甘蔗中扩增出362 bp的特异性片段,而其他甘蔗病害病原菌均未扩增出此片段,该引物最低能检测到的层出镰孢菌DNA浓度为300 pg/µL。117份样品中有112份样品检出拟轮枝镰孢菌,阳性检出率为95.7%;有103份样品检出层出镰孢菌,阳性检出率为88%;有103份样品为拟轮枝镰孢菌和层出镰孢菌复合侵染,复合侵染率为88%;另有5份样品均未检测出这2种病原菌,可能为其他种引起的甘蔗梢腐病。分别选取不同蔗区不同主栽甘蔗品种上的23个拟轮枝镰孢菌和19个层出镰孢菌的PCR扩增产物进行测序,结果显示,拟轮枝镰孢菌和层出镰孢菌扩增产物序列分别与拟轮枝镰孢菌(GenBank No. KU508286)和层出镰孢菌(GenBank No. MK252904)序列相似性高达99.45%~100%和99.26%~100%。挑取部分序列构建系统发育树,系统发育分析显示测序序列分属于拟轮枝镰孢菌组和层出镰孢菌组。结果表明,本研究建立的检测体系能够准确、快速的检测拟轮枝镰孢菌和层出镰孢菌,云南不同蔗区不同主栽品种轮枝镰孢菌和层出镰孢菌检出率均较高,为云南甘蔗梢腐病重要病原,且复合侵染现象较普遍,其中普洱、临沧、红河和玉溪蔗区拟轮枝镰孢菌为优势种,但层出镰孢菌检出率也较高,且存在其他种。本研究为甘蔗梢腐病病害早期诊断和及时防控提供技术支撑和实践依据。

口蹄疫(Foot-and-mouth disease, FMD)是危害养猪(Sus scrofa domesticus)业最重要的传染病之一,疫苗免疫是防控口蹄疫的重要手段之一。由于口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)容易发生变异,致使候选疫苗株和流行毒株间的抗原不匹配,从而影响疫苗免疫效力和疫病预防效果。本研究根据结构蛋白VP1 (viral structural protein 1)基因序列和功能,以猪口蹄疫病毒O型毒株(O/MYA98/BY/2010株)灭活抗原为模板,扩增结构蛋白VP1基因,并与pSFV1载体连接构建重组质粒pSFV1-VP1。重组质粒经线性化、体外转录等方法处理获得的mRNA,转染BHK-21细胞并验证表达效果,然后与制备的脂质体纳米颗粒混合免疫豚鼠(Cavia porcellus),进行免疫应答水平和攻毒保护效果检测。结果表明,mRNA转染乳仓鼠肾(baby hamster syrian kidney-21, BHK-21)细胞24 h后,采用免疫荧光法(immunofluorescence assay, IFA)和Western blot法均证实VP1得到表达;mRNA疫苗免疫豚鼠后血清中特异性抗体、中和抗体、γ干扰素(γ interferon, IFN-γ)和白介素4 (interleukin 4, IL-4)均显著高于阴性对照组。试制的mRNA疫苗免疫豚鼠可以对50倍50%豚鼠感染量(50% guinea pig infectious dose, GPID₅₀)的O/MYA98/BY/2010株攻击提供4/4保护。以上结果表明,试制的mRNA疫苗可以诱导较强的体液免疫与细胞免疫应答,免疫原性良好。本研究为研制口蹄疫紧急预防接种疫苗提供了新途径。

猪附红细胞体病是由猪支原体(Mycoplasma suis)、微小支原体(M. parvum)和浙江分离到的待定新种嗜血支原体(Candidatus M. haemosuis, CMh)引起猪(Sus Scorfa)传染性贫血、黄疸和母猪流产等症状的疾病。3种病原在我国猪群中的流行和传播情况不明,为鉴别诊断3种猪源嗜血支原体和了解该类病原在我国猪群中的流行特点,本研究建立了1种基于甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)基因的三重TaqMan探针荧光定量PCR (qPCR)鉴别检测方法。根据已知的3种猪源嗜血支原体GAPDH基因序列,利用Beacon Designer 4.0软件分别设计特异性引物和探针。通过分别优化Mg²⁺浓度、热启动酶浓度、引物和探针浓度等反应条件,建立了三重TaqMan探针qPCR方法,并验证了该法的特异性、敏感性和重复性。结果表明,建立的三重TaqMan探针qPCR方法标准曲线相关系数R²在0.999 2~0.999 6之间,扩增效率在99.9%~103.2%之间;该法对其他常见猪病无扩增信号,具有良好的特异性;该法对3种猪源嗜血支原体的最低检测限均为1 copy/μL;组内和组间变异系数在0.31%~1.75%之间,表明重复性好。应用该法对浙江省148份猪抗凝血样品检测并与二重PCR符合比较,结果显示三重Taqman探针qPCR检测M. suis、M. parvum和CMh的阳性率分别为50% (74/148)、48.6% (72/148)和64.9% (96/148),3种病原的混合感染率为29.7% (44/148);二重PCR方法检测M. suis/M. parvum和CMh阳性率分别为29.1% (43/148)和15.5% (23/148),二重PCR阳性样品三重qPCR检测均阳性。本研究建立的方法可用于临床上M. suis、M .parvum和CMh的鉴别诊断,为猪源嗜血支原体病的流行病学调查和防控提供技术支撑。