摘要：胸膜肺炎放线杆菌（APP）是重要的猪呼吸道病原菌，给世界养猪业造成严重的经济损失。生物被膜在许多细菌的感染与致病过程中起重要作用。我们在筛选APP转座突变体库时，发现hns基因缺失突变可显著增强APP血清1型生物被膜的形成，该基因编码一种DNA结合蛋白（组蛋白样类核结构蛋白）。为了进一步研究H-NS蛋白对APP生物被膜形成的影响，本文以APP血清1型4074株基因组DNA为模板，PCR扩增了408bp的hns基因编码区，克隆到原核表达载体pET-28c中获得重组质粒pET-hns，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达和组氨酸亲和层析柱纯化获得大小约19KDa的重组蛋白rH-NS。将不同浓度的rH-NS添加到hns突变株1-21及其亲本菌株4074的培养基中，用微孔板法测定生物被膜的形成。结果显示，在不添加rH-NS时，4074株不能形成可见的生物被膜，而1-21株形成明显的生物被膜；在添加0.1-0.3μM的rH-NS的情况下，1-21株生物被膜的形成量随着rH-NS浓度的升高而降低，而4074株随着rH-NS浓度的升高而升高；rH-NS添加量超过0.4μM对两个菌株生物被膜形成未见明显影响。结果表明H-NS蛋白负调控APP生物被膜的形成，并呈现一定的剂量效应。

摘 要：1999-2002年本试验室从我国南方健康鸭体内分离到21株H5N1亚型禽流感病毒，对其进行系统地生物学特性和遗传演化分析发现，其中A/Duck/FuJian/01/02(简DKFJ)和A/Duck/Guangxi/53/02(简DKGX) 属于同一基因型, 对鸡都呈高致病性，但对哺乳动物模型Balb/c小鼠的致病性明显不同: DKGX对小鼠呈低致病性（MLD50>106.5），DKGX株反向基因操作系统本试验室已经建立，而DKFJ对小鼠呈高致病性（MLD50<100.5）。为了研究这两株病毒对哺乳动物模型Balb/c小鼠致病性差异的分子机制，本研究构建了对DKFJ的8质粒反向基因操作系统，并通过细胞转染技术成功拯救了该病毒（R-DKFJ）。R-DKFJ在对哺乳动物模型Balb/c小鼠的致病性保持了与亲本野生毒（W-DKFJ, MLD50<100.5）一致的生物学特性，并且对小鼠呈全身感染，即106EID50鼻腔感染小鼠后第三天在脑、脾、肾、肺脏等脏器检测到病毒。DKFJ反向基因操作系统的成功建立为阐明H5N1亚型禽流感病毒对哺乳动物模型Balb/c小鼠的致病机制等方面奠定了基础。

运用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和PCR产物测序技术检测斑点叉尾鮰CC趋化因子基因SCYA113 内含子1的序列长度和多态性。在3个群体的60个个体中，斑点叉尾鮰CC趋化SCYA113 内含子1存在15种单元型和8种长度类型，长度类型分别为A、B、C、D、E、F、G和H型。对这8种序列进行比对分析发现，斑点叉尾鮰SCYA113 内含子1长度为395~443 bp， 8种长度类型中A、G、T、C的平均百分比为30.01%、15.43%、38.37%、16.19%，而且G+C（31.62%）含量明显小于A+T（68.38%）含量，内含子1与外显子1和2的连接处存在真核基因中mRNA剪接的识别信号GT/AG；引起长度变化的主要原因是短串联重复序列（微卫星序列）TTC和TTA引起的；除了微卫星序列以外，共检测到6个突变位点，其中3个转换位点为118（C→T），209（G→A），250（T→C），3个颠换位点为266（T→A），289（G→T），387（G→C），核苷酸多样性指数(π)为0.004，平均核苷酸差异(K)为1.576；在变异水平上，3个群体表现出一定的遗传差异，84群体中检测到8种长度类型和14种基因型，97群体中检测到8种长度类型和10种基因型，04群体中6种长度类型和10种基因型（缺少A、B等位基因）。从3个群体60个个体拥有22种频率较低(0.017~0.150)的基因型可以看出，斑点叉尾鮰的遗传基因资源较为丰富。

为阐明一氧化氮（NO）对睾丸支持细胞（SC）的影响，并为深入探讨精子发生调节机制奠定基础，本试验通过体外培养的仔猪睾丸支持细胞研究NO对SC中微管结构的影响。试验利用硝普钠（SNP）作为NO的供体，通过细胞活性检测、免疫荧光、酶活检测、免疫印迹等方法检测NO对睾丸支持细胞微丝的影响。结果表明，低浓度NO能维持支持细胞正常的骨架和活力，而高浓度NO能提高SC内p38MAPK的活性，降低抗氧化酶的活性和破坏细胞内微管的结构和分布，甚至细胞的分泌功能。上述证明，SNP通过使睾丸支持细胞NO的水平升高从而降低细胞内抗氧化能力，并通过p38MAPK级联，使细胞中微管发生解聚化，破坏微管的结构，从而降低细胞的分泌功能。

采用AO和Hoechst 33342荧光染色及流式细胞术等方法，检测在体外培养的猪前体脂肪细胞中添加RXRα配体9-cisRA、转染pRXRα-EGFP和RXRα-siRNA后猪前体脂肪凋亡的变化。结果表明，猪前体脂肪细胞发生凋亡的形态学变化，细胞首先体积缩小，细胞浆凝缩，染色质逐渐凝集，细胞核固缩呈均一的致密物，进而断裂，胞膜仍完整，然后胞膜不断出芽、脱落，细胞变成数个大小不等的由膜包裹的凋亡小体；10 nmol/L 9-cisRA和pRXRα-EGFP组与对照组相比，凋亡率被显著降低（P0.05）；10 µmol/L 9-cisRA和RXRα-siRNA组凋亡率则显著高于对照组（P0.05）。结果指出， RXRα具有抑制猪前体脂肪细胞凋亡的作用。

2C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环化磷酸合成酶（2C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synthase，MCS）是异戊烯基焦磷酸合成途径之一——甲基赤藓糖磷酸（methylerythritol phosphate，MEP）途径中的第五个酶，催化2-磷酸-4- (胞苷-5’-二磷酸)- 2-C-甲基-D-赤藓糖醇生成2-C-甲基-D-赤藓糖醇-2-4-环化磷酸。根据植物MCS的同源序列设计引物，通过RT-PCR结合RACE的方法在橡胶树中获得了与其相应的MCS基因，命名为HbMCS1。序列分析表明HbMCS1长965bp，编码241个氨基酸，该氨基酸序列与长春花、拟南芥、水稻、银杏和三尖杉的MCS同源性分别达到70.8%、69.4%、64.9%和63.3%和62.2%。半定量RT-PCR结果显示，伤害诱导胶乳HbMCS1的表达，乙烯对HbMCS1的表达几乎没有影响；HbMCS1的表达具有组织差异性，在愈伤组织中大量表达，在叶片和胶乳中微量表达。HbMCS1的克隆和表达分析为了解MEP途径在橡胶树胶乳中的作用和对天然橡胶生物合成的调控作用打下了基础。

利用RAPD标记对来自青藏高原东南部川西北高原的8个老芒麦自然居群的遗传多样性和群体遗传结构进行了分析和评价。从150个RAPD引物中筛选出25个能扩增出高度重复性条带的引物。这25个引物共扩增出370条可分辨的条带，其中291条(占78.65%) 具有多态性，表明供试居群在物种水平上存在较高水平的变异。同时各居群的多态性位点比率(PP)在46.49%到53.78%之间变化，表明群体水平的变异较低。居群的平均基因多样性(HE)为0.176(变幅为0.159~0.190)，而物种水平的平均基因多样性达0.264。基于Nei’s基因多样性、Shannon指数和贝叶斯方法的群体分化系数分别为32.0%、33.7%和33.5%。AMOVA 分析表明居群内遗传达到总变异的59.9%，而居群间变异仅有40.1%，但二者均达到极显著水平(P < 0.001)。居群间每世代迁入个体数(Nm)达到0.503个。各居群间存在较高的Nei’s遗传一致度。本研究获得的老芒麦的遗传结构不同于已报导的大多数披碱草属物种。另外，基于聚类分析及AMOVA的结果均表明各居群间存在较为明显的地理分化，8个居群分化为采集地的南部和北部2个分支。总之，研究结果表明来自青藏高原东南部的老芒麦居群具有较高水平的遗传变异。在该地区应尽量选择遗传多样性高的老芒麦居群实施就地保护。

应用PCR技术从含有人STAT3基因cDNA的质粒pOTB7中扩增STAT3基因片段。将其克隆入真核表达载体pEGFP-C1中，构建重组表达质粒。利用脂质体介导法将重组表达质粒转染原代牛乳腺上皮细胞(Bovine Mammary Epithelial cells)。G418筛选阳性克隆，RT-PCR检测STAT3基因在牛乳腺上皮细胞中的表达情况，并通过流式细胞术(Flow cytometry)检测转染细胞的增殖能力、周期以及DNA含量。结果表明，转染24h后大约16%的细胞被导入含STAT3基因的重组表达质粒。在mRNA水平证实细胞内有STAT3基因的高表达。导入STAT3基因后，细胞增殖能力增强，染色体倍数发生变化,细胞的增殖寿命较对照细胞延长了13代，表明导入STAT3基因后，能延长体外培养的牛乳腺上皮细胞的寿命。

为方便性别鉴定方法在现场应用，利用睾丸特异蛋白基因（TSPY）建立奶牛早期胚胎的非电泳性别鉴定方法。本实验首先设计并合成TSPY雄性特异引物和雌、雄共有引物并利用已知性别的奶牛血液DNA检测了利用TSPY基因鉴定胚胎性别的可能性。结果显示：雄性特异引物和共有引物对在10pg～60pg范围内性别符合率均为100%；采用非电泳的方法检测TSPY基因鉴定了49枚胚胎的性别，同时，用LAMP法对其中的6枚胚胎的性别鉴定结果进行验证，结果二者完全一致；对其中鉴定为雌性的21枚进行移植，结果9头出生的犊牛均为母牛。结果表明，TSPY基因是一个很好的雄性特异标记，非电泳检测TSPY基因对奶牛早期胚胎性别的鉴定结果准确可靠。

本研究从人乳铁蛋白（hLF）cDNA转基因小鼠乳汁中提取重组人乳铁蛋白（rhLF），并用提取的rhLF进行抗菌活性分析。收集了2个基因和2个品系的（PCL25和AP基因）转基因小鼠乳汁，采用凝胶过滤层析法从转基因小鼠乳汗中提取rhLF，提取物通过SDS-PAGE电泳及Western-blotting分析，ELISA检测提取物中rhLF含量；按不同浓度rhLF作琼脂扩散抑制大肠杆菌、沙门氏菌试验。结果表明，通过凝胶过滤层析获得的PCl25和AP转基因小鼠乳汁中的rhLF分子量为78KDa，与天然人乳铁蛋白一致，rhLF对大肠杆菌、沙门氏菌均具有明显的抑菌作用。

以乙肝表面抗原S基因为载体，分别将肌肉生成抑制素N端基因片段和抑制素N端基因片段分别插入S基因C端和第112～113 氨基酸残基密码子之间，构建MSTN-INH融合表达质粒pVAX-SMI。酶切和测序鉴定表明，重组质粒pVAX-SMI构建成功。脂质体法将pVAX-SMI转染HeLa细胞，Western Blot检测表达产物的免疫原性。结果表明，融合目的蛋白成功在HeLa细胞中表达，并具有免疫原性。

分子标记辅助育种是提高育种效率的重要措施，但其在育种实践上的应用，依赖于甘蔗分子遗传多样性尤其是基于靶标基因标记的遗传多样性的研究以及与目标基因连锁标记的开发。糖分是甘蔗育种最重要的性状，蔗糖代谢基因与该性状的表现型密切相关。同时，甘蔗栽培上不时也遭受寒害胁迫。为此，本试验率先在国内应用TRAP标记，以5个蔗糖代谢关键酶基因及1个耐寒性相关基因为靶标基因，通过设计正向锚定引物和9个随机引物，采用其中34个多态性好的引物组合，对33份包括我国主栽品种、新选育品种（系）和新引进的重要种质，进行TRAP标记分析。共产生579个条带，其中多态性条带288条，占49.74%。基于靶标基因的遗传距离幅度为0.26~0.63，UPGMA 聚类分析显示，在GD为0.52水平上，可将33个样本分为4类，其中ROC系列品种靶标基因相异系数小。基于靶标基因TRAP标记的聚类结果，不能完全反映血缘关系的远近，但能揭示基于不同基因型蔗糖代谢关键酶家族基因多态性的差异程度。同时，也发现了一些较特异的种质，为应用分子标记数据指导甘蔗高糖及抗寒杂交育种的亲本选择与组合配置积累了基础资料。此外，本研究结果同样显示了TRAP标记具有稳定性、高效性和易操作性的特点，暗示其在甘蔗分类、重要性状标记等方面，具有很大的应用潜力。研究结果具有重要的理论意义和实践价值。

为了探索一种高效可靠的芸薹属植物核型分析方法，本文以甘蓝和白菜为实验材料，分别提取甘蓝基因组DNA用地高辛标记为探针，提取白菜基因组DNA作为封阻剂，对甘蓝有丝分裂中期染色体进行原位杂交，每对同源染色体上显示出了特定的原位杂交信号，将甘蓝的9对染色体进行了精细的分型。为区分像甘蓝这样的小型染色体提高了一条可行且精确的方法，并为研究甘蓝自交不亲和性信号传导相关基因在染色体上的定位奠定重要基础。

目的: 构建含赤霉酸诱导的富含半胱氨酸蛋白基因(gcgasa)的原核表达载体，并在E.coli BL21(DE3)中表达。材料：手掌参。方法：设计带有EcoR I和Hind III酶切位点的引物，分别对gcgasa基因编码区全长及信号肽缺失的片段进行PCR扩增，将目标片段克隆入原核表达载体pET-32(a)，构建重组质粒。经测序鉴定后，转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达融合蛋白，并采用SDS-PAGE、Western-blotting、电镜超薄切片技术检测外源蛋白的表达及定位情况。对于水溶性蛋白，采用Ni2+-NTA亲和层析及凝胶过滤手段纯化。结果: 含有信号肽的外源基因在大肠杆菌周质空间中以包含体形式存在，而信号肽缺失的片段主要以可溶形式表达，经Ni2+-NTA纯化可获得目的蛋白。结论：首次在原核表达系统中高效表达了水溶性的gcgasa蛋白，为其结构和功能的研究奠定了基础。

利用甜菜夜蛾Spodoptera exigua（Hübner）围食膜多克隆抗体免疫筛选草地螟（Loxostege sticticalis L．）中肠cDNA表达文库，得到编码运载蛋白LstiSLC25的全长cDNA克隆。该cDNA克隆全长1399bp(GenBank登录号EU924506)，开放阅读框长897 bp，编码299个氨基酸，预测分子量和等电点分别为32.1kD和9.46。序列含有三个典型的溶质运转重复结构，具有溶质运载蛋白家族的典型特征。将该基因与pET30载体重组后，经IPTG诱导，蛋白在大肠杆菌中获得了表达。

根据枯草芽孢杆菌内切葡聚糖酶基因序列设计引物，采用PCR扩增到获得去除信号肽后约1.4Kb的内切葡聚糖酶表达片段。以此片段成功构建了pPIC-End载体，并转化至巴斯德毕赤酵母GS115。经过MD、MM平板筛选和酶活性测定，获得了高效表达的转化子GS115-pPIC-EndⅠ、GS115-pPIC-EndⅦ、GS115-pPIC-EndⅧ。在摇瓶培养条件下，对酵母工程菌表达条件进行了优化研究：在pH4-8条件下均能稳定表达，诱导起始OD600=5表达水平最高，甲醇诱导最佳浓度为0.5%-1%，加大培养通气量对表达有显著的促进作用。三种工程菌在优化条件后诱导培养，酶活性可达860.7U、760.3U、786.2U，分别为原始菌株酶活（63.78U）的13.5倍、11.9倍和12.3倍。SDS-PAGE分析表明表达产物分子量约为79.82KDa，热稳定性分析表明该酶在65℃保温30min可保持最高酶活的80%以上。

AHLs是细菌群体感应中的关键信号分子，参与包括导致作物软腐病的胡萝卜软腐欧文氏菌在内的许多植物病原菌致病因子的表达。AHL内酯酶能降解AHLs使其达不到临界浓度，从而阻断了病原菌的致病过程。将克隆到的AHL内酯酶基因SS10置于CaMV 35S启动子下构建双元载体，通过根癌农杆菌介导转化拟南芥。通过抗性筛选和分离比获得纯合转基因植物种子，进行了PCR及RT-PCR鉴定，证明目的基因在转基因拟南芥中整合并表达。初步抗病性实验表明，部分转基因植株具有显著的抗软腐病能力。

摘要：以中国荷斯坦牛、鲁西黄牛、渤海黑牛为研究对象，利用CRS-PCR、PCR-SSCP及DNA测序技术检测了GlyCAM1基因的遗传多态性。结果表明：本研究首次发现在牛GlyCAM1基因外显子3的第2081（A/C）和内含子3的2417（C/T）位点存在突变，两位点在3个牛群中的等位基因频率A/B分别为0.7525/0.2475、0.6112/0.3888、0.3375/0.6625； 0.9046/0.0954、0.8383/0.1617、0.7875/0.2125；经过χ2适合性检验, 3种牛群在内含子3的突变达到Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05），在外显子3鲁西黄牛和渤海黑牛达到Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05），但中国荷斯坦牛的突变在此位点未达到Hardy-Weinberg平衡状态（P<0.05）。

采用PCR-SSCP技术，对荷斯坦奶牛及荷斯坦公牛冻精杂交改良的黄牛后代(回交二代)共105头奶牛IGFBP-3基因第3外显子进行了多态性研究, 分析了该基因与奶牛生产性状的相关性。结果表明：IGFBP-3基因第3外显子共存在2个等位基因3种基因型，A、B基因频率及AA、AB、BB基因型的频率分别为0.7667 、0.2333和0.6000、0.3333、0.0667。该群体在这一位点上处于Hardy-Weinberg平衡状态，遗传杂合度（He）和多态信息含量(PIC)分别为0.3578和为0.2937。测序结果显示: 与AF305712相比，B等位基因在第8515碱基处发生了G-A的转换，而A等位基因在此处与AF305712序列相同；此外，A、B等位基因在AF305712的第8634碱基处均发生了T-C的无义突变。最小二乘法分析表明：AA基因型305天产奶量、12月龄体重极显著高于AB和BB基因型( P < 0.01)；AA型12月龄体长和体高均极显著高于AB型（p<0.01），而BB型与AB型和AA型差异不显著；不同基因型的胸围、腹围差异不显著。

根据APD抗菌肽数据库报道的牛乳铁蛋白肽LfcinB氨基酸序列，合成编码LfcinB基因的两条互补的寡核苷酸链，退火后在5’端和3’端分别形成BamHI和XhoI位点的粘性末端。合成的LfcinB基因定向克隆到pET-32a原核表达载体，阳性克隆菌用TB培养基进行扩大培养，然后用终浓度1.0 mmol/L的IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE结果显示，LfcinB基因在大肠杆菌中获得了大量表达，表达蛋白以包涵体形式存在，利用TGE透析液对纯化的LfcinB重组蛋白包涵体进行了复性，复性的LfcinB重组蛋白的纯度为96.6%。

目的：分离纯化出鸵鸟异嗜白细胞抗菌肽，并对其部分特性进行研究，为开发新一代高效肽类抗菌药提供依据。方法：使用氯化铵裂解、超声波破碎、醋酸提取、CM-Sepharose F F弱酸性阳离子交换层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）等方法，从鸵鸟异嗜白细胞中分离纯化出了抗菌肽，使用微量琼脂糖弥散法进行了抗菌活性与最小抑菌浓度（MIC）的测定，应用二级质谱（MS/MS）对抗菌肽的分子量进行测定。结果：在鸵鸟异嗜白细胞中存在抗菌肽，其对金黄色葡萄球菌S.aureus 1056MRSA、鸡大肠杆菌E.coli O78和白色念珠菌C.albicans ATCC10231具有较强的抑制作用；抗菌肽具有阳离子性质；热稳定性良好；经RP-HPLC纯化得到峰6、峰16和峰24，峰6对白色念珠菌的MIC为0.065μg/mL，峰16的分子量为4012.472Da，对鸡大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC分别为3.971μg/mL和5.245μg/mL，峰24的分子量为3542.479Da，对鸡大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC分别为26.472μg/mL和21.561μg/mL。结论：本研究得到的抗菌肽与已报道的鸵鸟抗菌肽ostricacins相比显示出更强的抑菌活性，是否为同一物质需要进一步的验证。

应用实时荧光定量RT-PCR方法评价了大肠杆菌表达的重组马白细胞介素-18（rEIL-18）蛋白在商品化的重组人IL-12（rhIL-12）协同作用下刺激马外周血单核细胞（PBMCs）产生EIFN-gamma的情况。在rhIL-12的协同作用下，rEIL-18在体外刺激马PBMCs产生EIFN-gamma的效应是阴性对照的20倍之多，并且在一定rhIL-12浓度的条件下，rEIL-18在体外诱导马PBMCs产生EIFN-gamma的能力是呈一定的剂量依赖性。此外，评价了制备的9株抗rEIL-18单克隆抗体中和rEIL-18的生物学活性的能力，证实其中1株可中和rEIL-18的生物学活性，并且呈一定的剂量依赖性。结果表明：首次获得原核表达的具有生物活性的rEIL-18，其活性可被1株抗rEIL-18单克隆抗体中和。

应用噬菌体表面展示技术，从生长抑素免疫的小鼠脾脏中提取总RNA，用RT-PCR技术反转录成cDNA，通过PCR扩增出抗体重链可变区VH基因和轻链可变区VL基因，再用编码(G1y4Ser)3的Linker在体外将VH和VL连接成单链抗体(ScFv)基因，克降到噬菌粒载体pCANTAB5E中，电转化至感受态的大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体M13K07超感染，形成噬菌体单链抗体库，有效库容为9.3×107。为利用亲和富集筛选技术，获得具有与SS结合活性的完整重组噬菌粒克隆奠定了基础。

本研究在应激敏感品种皮特兰猪和抗应激品种二花脸猪为亲本建立的F2资源群体中选取52头140-150日龄、体重为65±5 kg的猪。2 h运输应激试验后静脉注射巴比妥钠麻醉屠宰取样。在已知的应激性状QTL座位区域内选择了22个微卫星标记，对各微卫星标记与运输应激后的pH45min、pH24h、嫩度、系水力、蒸煮损失以及肉色评分（l*, a*, b*）6项肉质指标进行了相关性分析。结果表明：各位点等位基因数为3～8个，杂合度为0.4155～0.7432，多态信息含量为0.3651～0.8150。方差分析显示：S0101对肉色a*有极显著影响(P<0.01)；SW1023对系水力有显著影响(P<0.05)；SW1808对系水力有极显著影响(P<0.01)，对肉色l*、a*有显著影响(P<0.05)；S0112和S0092对pH45min有显著影响(P<0.05)。研究结果表明在应激QTL座位内选取的这5个微卫星标记对运输后的猪肉品质存在显著影响。

应用抗二氟沙星单克隆抗体（DIFmAb）杂交瘤细胞株建立直接竞争ELISA分析方法，研制出DIF残留快速检测试剂盒（DIF-Kit）并对其性能进行了测定。特异性试验结果表明与达氟沙星的交叉反应率为0.32％，与其它氟喹诺酮类药物和磺胺类药物无交叉反应，该方法对DIF的检测限可达到0.1µg/L,半数抑制浓度IC50为2.2µg/L，线性范围0.1～128µg/L， 平均批内和批间变异系数小于<15%。对牛奶、鸡肉分别添加0.4、2.0、10.0、50.0µg/LDIF标准品，平均回收率分别为89.3%和83.9%。DIF-Kit性能稳定，在4℃可保存6个月。DIF-Kit准确度高、重复性好、特异性强，适用于DIF残留快速检测的推广应用。

为研究产气荚膜梭菌在淡水鱼中的分布及毒素型，随机采取同一水库的鲤鱼、鲢鱼、鲫鱼、鲶鱼、黄鳝等淡水鱼样品420尾，细菌学方法分离肠内容物中的产气荚膜梭菌，PCR方法检测分离菌株的毒素基因确定毒素型，PCR扩增片段克隆后进行核苷酸序列分析并且与Genebank相应基因进行同源性比较。结果：自75份肠内容物样品中分离出产气荚膜梭菌；58株为C型（α、β毒素基因），13株为A型（α毒素基因），4株为B型（α、β、ε毒素基因）；三型菌株均能扩增出特异性2条带；检出基因与Genebank相应基因的同源性为98.15－99.29%。在淡水鱼检出产气荚膜梭菌的α、β、ε、β2毒素基因，在B型产气荚膜梭菌中扩增出2毒素基因均属首次，本研究对水体环境的污染及人类的食品安全有一定的指导意义。

根据青枯菌(Ralstonia solanacearum)与群体猝灭相关aac基因序列设计PCR引物，扩增获得了aac基因，并将基因克隆到pGEM-T- easy载体中。将庆大霉素基因插入aac基因内部，使其突变，将含有庆大霉素基因的aac突变基因亚克隆进入自杀质粒pDS132中，构建成aac基因重组自杀质粒pDS-aac’-Gm。将自杀质粒电转化至青枯菌GMI 1000菌株中，通过体内同源重组，置换其野生型的aac基因。通过三步筛选法和PCR扩增鉴定，筛选获得了具有庆大霉素抗性的青枯菌aac基因突变株(GMI 1000-m)。接种番茄结果显示，青枯菌aac突变株的致病性较野生型GMI 1000明显下降。证明aac基因在青枯菌致病过程中具有重要作用。

采用荧光定量RT-PCR法测定H-FABP基因在体重100kg左右的莱芜猪和杜洛克猪背最长肌中的表达差异，分析了H-FABP基因表达差异与肉质性状的关系，结果表明：莱芜猪的背最长肌H-FABP基因mRMA的表达水平比杜洛克猪高38.60％，认为可能与莱芜猪肌内脂肪含量极显著高于杜洛克猪有关（P<0.01）；H-FABP基因的背最长肌mRNA的表达水平与肌内脂肪、pH值成正相关，与肌纤维直径成负相关，与大理石纹和肉色的相关关系两品种不一致。其中莱芜猪和杜洛克猪H-FABP基因mRNA表达量与肌内脂肪相关系数最高，分别为0.363和0.943。对H-FABP基因的研究不仅有助于肌内脂肪的提高，而且可提高肌肉pH值、降低肌纤维直径，全面改善肌肉的肉质性状

利用双向电泳分离棉铃虫中肠Cry1Ac受体蛋白，对于进一步明确棉铃虫受体的种类、发现新受体、寻找可能与抗性有关的受体非常重要。根据第一向等电聚焦的方式不同，可将双向电泳分为两种系统：ISO-DALT(isoelectric focus-dalton weight)和IPG-DALT（immobilized pH gradient-dalton weight）。确定最适合的双向电泳方法，可以为进一步研究受体蛋白奠定基础。本研究比较了ISO-DALT和IPG-DALT两种双向电泳系统结合western blotting技术分离棉铃虫中肠Cry1Ac受体蛋白的效果。结果表明，这两种系统都可以用于棉铃虫Cry1Ac受体的分离，ISO-DALT对受体分离效果比IPG-DALT更好，ISO-DALT比较经济但对后续的质谱工作不利，IPG-DALT较昂贵但有利于进行后续试验。

用PCR扩增猪圆环病毒II型广东分离株的衣壳蛋白羧基端基因，将PCR产物连接到重组型质粒pR上，转化DH5α细胞并筛选阳性克隆；重组质粒经PCR鉴定并测序后，转化E2菌，将重组E2菌与缺陷型噬菌体T4-Z1同源重组后，得到重组噬菌体，SDS-PAGE和Westernbloting分析，表明衣壳蛋白基因在噬菌体表面正确展示，表达的融合蛋白的分子量约为25Ku。

摘要: 用体细胞核移植方法生产的克隆猪诞生至今已经8年，虽然同胚胎细胞核移植相比，体细胞核移植技术难度大，成功率低（1~2%），但近年来用体细胞核移植技术克隆猪有了较深入的研究，在体细胞核移植基本机理和关键技术上取得了一定的进展。本文结合本实验室近年来的相关研究工作，综述了用核移植方法生产体细胞克隆猪的技术关键和难点及应用情况，并对提高猪体细胞核移植效率的策略进行了分析。