农业生物技术学报

Construction of Recombinant CVI988 Virus Expressing GFP and Escherichia coli gpt Genes

邱亚峰1;葛菲菲2;曹瑞兵3;周斌3;马志永1**;陈溥言3**

2009, 17(2): 183-188 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

以马立克氏病病毒（MDV）CVI988株基因组为模板，利用PCR技术扩增出约2.7和3.0 kb的基因片段，将上述片段同时插入pUC19中，获得约5.5 kb MDV同源重组臂；以该基因片段的US2区的BglⅡ为插入位点，分别插入基因表达盒CMV-gpt-ployA和CMV-gfp-polyA，构建转移载体pUS-gpt-GFP，将该载体瞬时转染CHO细胞，在荧光显微镜下，可以观察到绿色荧光蛋白的表达；将该转移载体转染已用MDV CVI998株感染的次代CEF细胞，利用MX-HAT培养基筛选重组病毒，并用荧光显微镜挑选表达绿色荧光蛋白的蚀斑，结果获得重组病毒rMDVgptGFP。通过PCR检测和病毒生长测定，证明重组病毒获得纯化。

猪肠道寡肽转运载体1(PepT1)mRNA表达的肠段特异性和发育性变化

Segmental Distribution and Ontogenetic Regulation of Peptide Transporter 1(PepT1) mRNA Expression in Intestine of Pigs

邹仕庚1，2;冯定远1**;黄志毅1;左建军1;职爱民1;董泽敏1;张常明1;叶慧1

2009, 17(2): 229-239 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

研究旨在探讨猪肠道寡肽转运载体（PepT1）mRNA表达的肠段特异性和发育模式，为寡肽营养在养猪生产中的应用提供理论依据。实验分别选取遗传背景相同的1、7、26、30、60、90和150 d蓝塘和长白公猪各5头，测体重后屠宰，取十二指肠、空肠、回肠和结肠组织样品；以18S rRNA为内标基因，用实时荧光定量PCR法（SYBR Green Ⅰ试剂盒）检测PepT1 mRNA在60 d长白猪表达的肠段特异性及其在蓝塘和长白猪肠道的发育模式。结果显示：长白猪肠道PepT1 mRNA的表达丰度十二指肠显著高于空肠和回肠（P <0.05），结肠无PepT1 mRNA的表达；PepT1 mRNA的表达丰度在十二指肠为蓝塘猪7、90 d和长白猪60 d，而在空肠和回肠为蓝塘猪60 d和长白猪90 d时达最高水平（P <0.05）；蓝塘和长白猪肠道PepT1 mRNA的表达在断奶前（28 d断奶）具有不同的发育模式，而在断奶后则具有相似的发育性变化；同一猪种不同肠段PepT1 mRNA的表达模式不同，但空肠和回肠在断奶后具有相似的发育性变化；不同猪种同一肠段PepT1 mRNA的表达蓝塘猪十二指肠在7和90 d、空肠在7和60 d及回肠在30 d时分别显著高于长白猪（P <0.05）。结果说明猪肠道PepT1 mRNA的表达受到发育阶段、品种和肠段的调控。

山羊雌激素受体(ESR)基因部分外显子多态性分析

Polymorphism Analysis on Partial Exons of Estrogen Receptor (ESR) Gene in Goats

冯涛1;赵有璋1, 狄冉2;储明星2**;张英杰1, 3;方丽2

2009, 17(2): 237-242 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

雌激素受体(estrogen receptor，ESR)与雌激素专一性地结合，并通过与雌激素的相互作用来调节生殖机能相关基因的表达，在动物繁殖中起着重要作用。研究采用PCR-SSCP和测序方法分析ESR基因外显子1、4在部分山羊(Capra hircus)品种中的单核苷酸多态性，并研究该基因对山羊繁殖力的影响。结果表明：ESR基因外显子1、4在所检测的济宁青山羊、波尔山羊、安哥拉山羊和内蒙古绒山羊中均不存在多态性；山羊扩增片段核苷酸和氨基酸序列与人、牛、猪、马、绵羊、大鼠、小鼠和鸡8个物种的同源性分别为51.3%～97.3%和64.5%～98.3%；山羊ESR基因氨基酸序列存在2处特有突变，分别是外显子1第81位插入一个脯氨酸(P)和外显子4第4位由天冬氨酸突变为天冬酰胺(D4N)。哺乳动物ESR基因外显子1、4序列保守性强，该区域可能不是影响山羊高繁殖力的功能结构域。

饲料蛋白质水平对刺鲃幼鱼的生长、胴体营养组成及消化酶活性的影响

Effects of Diet Protein Level on the Growth, Body Composition and Digestive
Enzyme Activities of the Barbudes caldwell Juvenile

吕耀平1,2**; 陈建明3;叶金云3; 黄旭雄4;劳沈颖1;沈斌乾3;姚子亮5;郭建林2;叶丽平1

2009, 17(2): 276-281 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

配制蛋白质水平20%~50% 的7种等能半精制实验饲料，饲养平均初始体重为1.26±0.02 g 的7组3重复的刺鲃(Barbudes caldwell)幼鱼8周，研究刺鲃对饲料蛋白的需求量。结果显示,饲料蛋白水平对实验鱼的成活率、脏体比和肝体比等均无显著影响(P >0.05)，而对鱼体终重有显著影响(P <0.05)；鱼体增重和生长比速均随饲料蛋白水平从20%升高到35%而不断提高，但饲料蛋白水平进一步提高，则鱼体增重和生长比速均无显著差异(P >0.05)。饲料蛋白水平30%～50%的5个实验组的饲料效率无显著差异(P>0.05), 但均显著高于饲料蛋白为20%和25%的2个实验组(P <0.05)。蛋白质效率(PER)与饲料蛋白水平(x)呈负相关(PER= 3.006－0.03251x, R =0.9366)。饲料蛋白水平对鱼体的胴体水分、粗蛋白和粗灰分的含量无显著影响(P > 0.05)；胴体脂肪含量随饲料蛋白水平(x)的升高而不断降低(L=8.2169－0.0458x,R =0.8551)。实验鱼肝胰脏蛋白酶活性则在组间无显著差异(P > 0.05)。肠蛋白酶和肝胰脏淀粉酶活性均随着饲料蛋白水平的升高而呈现先逐渐升高，且升高到一定程度后又呈逐渐下降的趋势。肠淀粉酶活性(IAA)与饲料蛋白水平(x)呈负相关关系(IAA = 84.625－0.9147x, R =0.8463,)。以鱼体增重为指标(y)，与饲料蛋白水平(x)拟合折线模型进行回归分析，估算出饲料蛋白质适宜水平为占干饲料的34%。

应用反向斑点杂交技术从转录序列的选择性捕获中筛选副猪嗜血杆菌表达差异基因

Screening Differentially-expressed Genes of Haemophilus parasuis from the Selective Capture of Transcribed Sequences (SCOTS) by Reverse Dot-blot Hybridization

胡军勇;金卉;谢启运;万云;楚杰;刘翠云; 陈焕春; 周锐

2009, 17(2): 189-194 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

通过对靶DNA的种类和浓度、探针浓度、紫外交联时间等反向斑点杂交条件优化，建立了一种从选择性捕获的转录序列（selective capture of transcribed sequences，SCOTS）库中筛选副猪嗜血杆菌在体内、外差异表达的基因的方法。通过反向斑点杂交技术从10个样品中筛选出的6个样品被证明是副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）在体内上调表达或者是特异表达的基因。结果表明：SCOTS技术能够有效地获得一个可能存在差异表达基因的cDNA文库，而反向斑点杂交技术可以有效地从中筛选到差异表达基因。

小反刍兽疫病毒N基因在大肠杆菌中的表达及鉴定

Expression and Identification of Peste des petits ruminants virus N Gene in Escherichia coli

贾凤芹; 李刚**; 李伟; 范晓娟;张坤

2009, 17(2): 195-200 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

参照GenBank中小反刍兽疫病毒((Peste des petits ruminants virus，PPRV)N基因序列（Nigeria/75/1）(1 578 bp)设计了1对添加EcoRⅠ和Not Ⅰ酶切位点的引物，对从奥地利引进的pCI-neo-PPRN质粒进行PCR扩增，克隆至pGM-T载体，并转化大肠杆菌Escherichia. coli TOP10感受态细胞，获得重组质粒pGM-T-PPRN。将重组质粒经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切的产物插入原核表达载体pET-32a（+），构建原核表达质粒pET-PPRN，将其转化进BL21(DE3)感受态细胞中后用IPTG诱导表达，收集菌液进行SDS-PAGE电泳和Western blot分析，结果表明小反刍兽疫病毒N基因在BL21(DE3) 成功表达。所表达融合蛋白的相对分子质量约为80 kD，并能被组氨酸单抗、PPRV标准阳性羊血清及PPRV疫苗免疫羊血清所识别。

猪传染性胃肠炎病毒核衣壳蛋白的表达及在ELISA中的初步应用

Prokaryotic Expression of Nucleoprotein Gene of Transmissible gastroenteritis
virus and Development of ELISA Based on the Expressed Protein

宋振辉1**;郭万柱2; 张鹦俊3

2009, 17(2): 201-205 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

重组质粒PET-N转化大肠杆菌（Escherichia coli） BL21菌株，在1.0 mmol/L IPTG和37℃条件下诱导，外源基因获得高效表达。Western blot检测证明，表达产物具有良好的反应原性。以纯化的蛋白为抗原建立了检测猪传染性胃肠炎抗体的间接ELISA方法，确定抗原最佳包被浓度为15 μg/mL，抗体稀释度1∶40，最适封闭液为5% FBS，血清反应时间为90 min，酶标二抗HRP SPA的工作浓度为1∶5 000，反应时间为60 min，底物在室温显色时间为10 min，待检血清阳性标准定为光密度OD450≥0.35。与 Svanova TGEV/PRCV 抗体诊断试剂盒比较，此方法的特异性、敏感性和符合率分别为93.8%、93.5%和93.5%。

猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（pGM-CSF)基因的克隆与原核表达

Cloning of Porcine Granulocyte-macrophage Colony Stimulating Factor （pGM-CSF） Gene and Its Prokaryotic Expression

杨恒;文心田;曹三杰;黄小波

2009, 17(2): 206-211 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

通过RT-PCR方法，从经ConA刺激的猪外周血淋巴细胞中扩增出猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（pGM-CSF）编码区的cDNA并将其克隆至pMD-19T载体，序列测定表明pGM-CSF基因的长度为435 bp，编码144个氨基酸。通过PCR方法获得缺失其N端17个氨基酸残基信号肽序列的成熟pGM-CSF蛋白基因，将其克隆至原核表达载体pET-32a（+），构建重组表达质粒pET-GM并转入大肠杆菌(Escherichia coli )BL21（DE3）中进行诱导表达。经SDS-PAGE电泳和Western blot分析表明，表达的重组蛋白分子量约31 kD，主要以包涵体形式存在，表达量占菌体总蛋白的30.4% 。采用Ni2+-NTA亲和层析柱对经稀释复性的重组蛋白进行纯化，并采用MTT法以TF-1细胞检测纯化产物的生物学活性。结果表明，重组蛋白可有效刺激TF-1细胞增殖，其活性达到3.43×105 IU/mg。

不同卡介苗(BCG)免疫剂量和接种的小鼠日龄对牛羊结核病的免疫保护和IFN-γ/ IL-4表达的影响

Effects of Doses of Bacillus Calmette-guerin (BCG) and Ages of Inoculated Mice on Immune Protection against Tuberculosis and IFN-γ/IL-4 Expressions

郭慧君;李宝全;柴家前;常维山;刘法孝;李梅;刘永庆; 李宏梅

2009, 17(2): 212-217 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

选用BalB/C乳鼠和成年BalB/C小鼠进行卡介苗（bacillus calmette-guerin, BCG）接种，攻毒后用体外培养法观察脾细胞内病原生长特性以及用enzyme-linked immunospot (ELISPOT)方法检测脾细胞诱导表达γ-干扰素（interferon -γ，IFN-γ）和白细胞介素-4（interleukin -4，IL-4）的变化。结果显示,低剂量（2×103 cfu）BCG对7日龄乳鼠可产生100%的免疫保护,高剂量（4×104 cfu）BCG产生75%的免疫保护；而低剂量（2×103 cfu）BCG对35日龄小鼠产生的免疫保护为67%。低剂量（2×103 cfu）BCG诱导乳鼠产生以IFN-γ为主的Th1类细胞免疫反应明显增强，以IL-4为主的Th2类免疫反应降低；而高剂量（4×104 cfu ）BCG诱导产生的IFN-γ/IL-4均增多。低剂量（2×103 cfu）BCG接种诱导35日龄小鼠产生的IFN-γ/IL-4亦均增多。结果表明，卡介苗BCG对小鼠的保护率与BCG免疫剂量和免疫动物日龄间存在紧密的相关性，这种差异可能与BCG诱导产生的Th1/Th2类细胞免疫反应的变化有关。

促性腺激素释放激素受体(GnRHR)基因多态性及其与济宁青山羊高繁殖力关系

Polymorphism of Gonadotropin Releasing Hormaone Receptor (GnRHR) Gene and Its Relationship with Prolificacy of Jining Grey Goat

储明星1**;肖杰文2;狄冉1;李学伟2;方丽1;马月辉1;李奎1

2009, 17(2): 218-223 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

设计8对引物, 应用聚合酶链式反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）技术检测促性腺激素释放激素受体（gonadotropin releasing hormone receptor, GnRHR）基因外显子1、外显子2和外显子3在高繁殖力山羊(Caprar hircus)品种（济宁青山羊）和低繁殖力山羊品种（安哥拉、波尔和内蒙古绒山羊）中的单核苷酸多态性，同时研究该基因对济宁青山羊高繁殖力的影响。结果发现引物P4扩增片段具有多态性，其余7对引物的扩增片段都不存在多态性。对于引物P4扩增片段，在济宁青山羊、波尔山羊和内蒙古绒山羊中均检测到AA、AB和BB基因型，而在安哥拉山羊中只检测到AA和AB基因型，未检测到BB基因型；测序分析发现BB型与AA型相比在外显子1有1个突变（757G→A），但未引起氨基酸改变；济宁青山羊AA、AB和BB基因型频率分别为0.623、0.300和0.077，BB型济宁青山羊平均产羔数比AB型和AA型分别多0.69只（P　<　0.05）和0.82只（P　<　0.05），AA型和AB型济宁青山羊产羔数的最小二乘均值差异不显著（P　>　0.05）。

山羊美臀突变基因（CLPG）的多态性鉴定及其与生产性能的关系

Identification of Polymorphism of the Callipyge　Mutation Gene（CLPG） in
Goats and Its Associations with Production Traits

曹贵玲1;李标1;唐辉1;唐培荣2;王建民1; 姜运良1**

2009, 17(2): 224-228 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

Callipyge绵羊的臀部肌肉明显肥大，呈极性超显性遗传。研究克隆了山羊（Capra hircas）美臀突变基因(CLPG) 250 bp的序列(GenBank登录号：EU753362), 对其多态性及其与山羊生产性能的关系进行了分析。结果表明，所扩增片段与绵羊和猪相应片段的同源性分别为96.04%和88.65%。PCR-SSCP分析表明，在该DNA区段存在多态性。测序结果显示，在对应于绵羊（Ovis aries）的CLPG基因没有发现A→G的突变，但在该位点下游147 bp处检测到一个A→C的颠换，记为SNP216。对波尔山羊(n　=63)、莱芜黑山羊(n　=70)、鲁波杂交山羊(n　=40)、鲁北白山羊(n　=29)和内蒙古阿拉善白绒山羊(n　=115)共5个群体的多态性进行了检测，结果表明：除鲁北白山羊以外，A等位基因均为优势等位基因；波尔山羊、莱芜黑山羊、鲁北白山羊和鲁波杂交山羊群体均处于Hardy-Weinberg平衡状态（P　＞0.05），而内蒙古阿拉善白绒山羊群体显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态（P　＜0.01）；不同基因型的内蒙古阿拉善白绒山羊的初生重、从出生到断奶时的增重及产绒量的最小二乘均值差异不显著（P　＞0.5）。

催乳素(PRL)和生长激素(GH )基因对高邮鸭产蛋性能的遗传效应分析

Genetic Effects of Prolactin (PRL) and Growth Hormone (GH) Genes on Egg Performance in Gaoyou Duck

李慧芳1**;朱文奇1;宋卫涛1;张汤杰2;徐文娟1;陈宽维1**

2009, 17(2): 263-268 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

分别采用PCR-RFLP和PCR-SSCP方法检测催乳素(PRL)和生长激素(GH)基因的多态性，并分析了PRL和GH基因与高邮鸭产蛋性能的关系。结果表明：①PRL基因内含子1经酶切得出3种基因型AA/AB/BB，等位基因A/B频率分别为0.226/0.774；经测序发现PRL基因内含子1在1 326 bp处发生T→C突变。GH基因外显子4经SSCP分析显示3种基因型CC/CD/DD，等位基因C/D基因频率分别为0.222/0.778；经测序发现GH基因外显子4在3 701 bp处发生C→T突变。②PRL内含子1多态与高邮鸭的30周龄蛋重存在极显著关联(P <0.01)；PRL多态与双黄蛋率显著关联(P <0.05)；GH基因多态与最长连产天数和双黄率间相关性达显著性水平(P <0.05)。

一种简易快速鉴定动物组织总RNA质量的方法

A Facile, Rapid and Effective Method for RNA Quality Determination

谢胜松;李新云;苏立杰;顾婷;赵书红**

2009, 17(2): 282-287 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

通过一系列的对比实验发现，RNA电泳检测效果不仅与凝胶孔径大小和稀释与否相关，而且也与电泳时间长短和RNA上样量的多少有关。建立了一套可方便快捷地鉴定动物组织总RNA质量的方法，即在孔径宽度为7 mm的1.2% 琼脂糖凝胶上，仅需取3~5 μg 总RNA，加6×RNA上样缓冲液混合并用无RNase的灭菌双蒸水稀释到一定体积后上样，电泳15~30 min即可准确地鉴定RNA的质量。经实践证明，该方法实用性强，重复性好，具有良好的推广应用价值。

牛白细胞介素1受体相关激酶2（IRAK2）基因的克隆及生物信息学分析

Cloning of Bovine　Interleukin-1 Receptor-associated Kinase 2(IRAK2) Gene and Its Bio-information Analysis

王兴平2;罗仍卓么2;许尚忠1**;高雪1;李俊雅1;任红艳1;陈金宝1

2009, 17(2): 243-248 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

Toll样受体 (toll-like receptors，TLRs)可识别病原体相关分子模式，通过下游信号转导激活免疫细胞，在天然免疫和适应性免疫应答中起着重要的作用，而白细胞介素1受体相关激酶2(interleukin-1 receptor-associated kinase 2,IRAK2)为TLRs信号转导通路下游重要的分子，起着信号转导与调控作用。为了深入研究牛TLRs信号转导通路对牛病原体所致疾病抗性中的主要作用，采用RT-PCR和RACE方法克隆了牛IRAK2基因的cDNA和进行了基因表达谱分析，并对其基因序列和所编码的蛋白质的结构特征进行了生物信息学分析。结果表明，牛IRAK2基因在乳腺、肝、十二指肠、脂肪、子宫、肾、心、肺、胰和卵巢10个组织中有表达，其序列全长为2 148 bp(GenBank登录号为EU528620)，包括36 bp的5'非翻译区（1~36），1 866 bp的CDS区（37~1 902）和246 bp的3'非翻译区（1 903~2 148），编码622个氨基酸，其分子量为68 628.31 D，等电点为5.3。IRAK2蛋白含有一个DD结构域和一个S_TKc结构域，位于细胞核、细胞质、线粒体和质膜上，通过DD和S_TKc结构域对TLRs的信号转导有着重要的作用。

一个在超饲养朗德鹅肝脏中差异表达基因的分离和鉴定

Identification of a Differentially Expressed Gene in Fatty Liver of Overfeeding Landes

赵阿勇1;何瑞国2**;汤华淳2;周圻1;汪海峰1

2009, 17(2): 256-262 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

为阐明鹅（Anser anser）肥肝形成的机制，使用mRNA差异显示技术研究超饲养和正常饲养条件下朗德鹅肝脏基因表达差异。基因转化生长因子β2(TGFB2)被证实在肥肝中上调（P < 0.01），该基因1 248 bp的cds序列(GenBank 登陆号EF541127)与鸡TGFB2有94%的同源性。序列分析表明，该序列含有一个1 239 bp的开放读码框架（ORF），编码412个氨基酸的蛋白质，该蛋白质序列存在2个保守的功能域：引导序列（TGFb前肽）和功能结构域（TGFβ），并与其它同源蛋白有较高的同源性。应用生物信息学方法对该蛋白质的功能和结构进行了分析。组织表达分析表明，鹅TGFB2在肝、肌胃、脾和卵巢中表达丰富，在子宫、肺和肌肉中中等表达，在肾和腹脂中表达量较低。结果显示，超饲养诱导了鹅肝脏TGFB2基因mRNA表达水平的上调。

小金海棠MxYSL1基因的克隆与表达分析

Cloning of MxYSL1 Gene in Malus xiaojinensis and Its Expression Analysis

刘丽丽;许雪峰;孔瑾;王忆;李天忠;韩振海**

2009, 17(2): 288-293 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

小金海棠属于铁高效基因型。为了研究小金海棠的抗缺铁分子机理，根据苹果的EST库得到一个791 bp的YSL(yellow stripe 1-like protein)基因片段序列，设计特异引物，在苹果铁高效基因型小金海棠（Malus xiaojinenesis）中克隆到此基因片段。3'-RACE得到YSL基因的3'端序列，拼接后得到1 114 bp的3'端基因序列。预测该基因片段编码一个含7个跨膜区的蛋白多肽，与拟南芥AtYSL1同源性达74%，命名为MxYSL1。RT-PCR及Northern blot分析表明，该基因在小金海棠各个检测部位都有表达。在根、茎与成熟叶中，该基因在低铁(EDTA-NaFe,4 μmol/L)时减弱表达，在过量铁(EDTA-NaFe,320 μmol/L)供应时增强表达。MxYSL1基因在新叶中的表达趋势与以上器官中的表达趋势正好相反。

六个候选基因多态性与母猪繁殖性状关联分析

Genetic Polymorphism of Six Genetic Loci and Their Correlation with Reproductive Traits

颜华;王立贤**;王立刚;李勇

2009, 17(2): 249-255 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

在同一个大白猪猪群中采用PCR-RFLP法进行了雌激素受体（ESR）基因、催乳素受体（PRLR）基因、卵泡促激素β亚基（FSHβ）基因、核受体辅激活蛋白1（NCOA1）基因、催乳素（PRL）基因、备解素（OPN）基因等6个与繁殖性能相关的基因多态性检测并对不同基因型的总产仔数、产活仔数及出生窝重进行了相关分析。结果表明：大白猪群体ESR、PRLR、FSHβ 和 OPN 基因的优势基因是B等位基因； NCOA1 和PRL 基因的优势基因是A等位基因。对初产母猪，NCOA1基因AB基因型个体总产仔数（TNB）、产活仔数（NBA）和出生窝重（BLW）分别比AA基因型个体少1.12 头、1.08 头和1.71 kg，差异显著（P　<　0.05）；PRL基因AA型个体TNB、NBA和BLW分别比AC基因型个体多3 头、3.23 头和5.13 kg，BC基因型个体TNB、NBA和BLW分别比AC基因型个体多3.37 头、3.84头和4.75 kg。对经产母猪，PRLR基因各基因型个体之间在TNB和BLW上存在显著差异（P　<　0.05），杂合型个体比纯合型个体TNB和BLW分别少1.0～1.5头和1.0～1.4 kg；PRL基因AA和BC基因型个体分别比AC基因型个体BLW重1.08和1.05 kg（P　<　0.05）；OPN基因BB基因型个体比AA基因型个体TNB多2.13 头（P　<　0.05）。在对合并基因型结果分析中发现，ESR和PRLR基因的A等位基因对TNB表现出正效应，OPN基因的B等位基因对TNB、NBA和BLW都表现出正效应。

电融合化学激活前培养时间对绵羊重构胚发育的影响

Effects of Culturing Time before Electrical Fusion and Chemical Activation on Constructed Sheep Embryos

谭晓颖;贾文文;高志敏;杨春荣;马晓玲;窦忠英**

2009, 17(2): 269-275 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

采用绵羊（Bos gaurus）体细胞带下注入体外成熟的卵母细胞构建重构胚，比较了不同的融合和化学激活前培养时间对重构胚融合和发育的影响。融合前培养 1h，比较不同的激活前培养时间，发现各组重构胚卵裂率、桑椹胚率和囊胚率均无显著差异（P>0.05），但激活前培养2h胚胎完整率(95.81%)高于对照（74.64%），差异显著（P<0.05）；激活前培养2 h，比较不同的融合前培养时间，发现两组融合率，激活胚胎完整率和囊胚率无显著差异（P>0.05），但融合前培养1h的卵裂率（76.88%）和桑椹胚率（40.63%）显著高于直接融合（64.48%和21.50%）（P<0.05）。利用G1和G2培养早期克隆胚胎，将发育至桑椹胚囊胚的胚胎移植到41只受体绵羊，仅1只妊娠但于第104天流产。用5对绵羊微卫星DNA多态性引物对该克隆流产胎儿皮肤成纤维细胞、供体细胞、受体绵羊及一只普通对照母绵羊皮肤成纤维细胞进行微卫星DNA分析，结果表明5对微卫星DNA引物扩增各组细胞DNA, 扩增产物经过10%琼脂糖凝胶电泳和银染后，条带均有明显的多态性。条带分析显示，克隆流产胎儿的微卫星DNA指纹与供体细胞完全相同，而不同于其受体母亲和对照绵羊。证明该流产羔羊基因来源于供体细胞，为体细胞克隆绵羊。

华东葡萄白河-35-1株系抗霜霉病基因cDNA文库构建及EST分析

Construction of cDNA Library and Analysis of Expressed Sequence Tags of
Chinese Wild Vitis pseudoreticulata Clone Baihe-35-1 Resistance to Downy Mildew

王沛雅;王跃进**;张建文;朱自果;张朝红

2009, 17(2): 294-300 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

以中国原产抗霜霉病葡萄野生种华东葡萄（Vitis pseudoreticulata）白河-35-1为材料，用SMARTTM技术构建葡萄霜霉菌（Plasmopara viticola）诱导的葡萄叶片cDNA文库。经检测，原始文库滴度0.92×106 pfu/mL，重组率97%，插入片段500～
2 200 bp，扩增文库滴度为5×109 pfu/mL。随机挑取克隆5'端测序，获得254条有效EST序列（GenBank登录号：FG269201~FG269449和FG396006~FG396010）。经BlastX分析，有56.3% ESTs与GenBank中功能已知基因有较高同源性，14.6%ESTs与功能尚未确定的假设蛋白或未知蛋白同源性很高，20.9%ESTs在GenBank中无匹配的同源产物。

大豆MYB 转录因子GmMYBZ2 的鉴定、突变分析及原核表达

Characterization and Mutation of Soybean MYB Transcription
Factor GmMYBZ2 and Its Prokaryotic Expression

杜海1,2;刘蕾1,2;唐晓凤1,2;赵艳丽2;高杰2;吴燕民2; 黄玉碧1**;唐益雄2**

2009, 17(2): 301-306 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

大豆（Glycine max）GmMYBZ2基因是典型的植物R2R3-MYB转录因子家族成员之一。通过DNAMAN和酵母(Saccharomyces cerevisiae)单杂交系统分别对其蛋白结构和转录活性进行了分析鉴定，并在大肠杆菌(Escherichia coli )中进行了原核表达。GmMYBZ2除含有典型的R2R3-MYB转录因子的结构特征外，在C端含有1个少有的保守氨基酸基序PDLNLELTIS及一个隐藏的锌指结构。基因组序列分析表明，在263～395 bp位含1个132 bp的内含子。为明确GmMYBZ2 C端保守氨基酸基序及锌指结构对目的蛋白转录活性的影响，分别进行了PCR介导的序列删除突变。酵母单杂交系统分析显示，内含子、保守基序及锌指结构对目的蛋白的转录活性均有抑制作用；原核表达显示，目的蛋白能在补充有稀有密码子的大肠杆菌中成功表达。

黄瓜抗西瓜花叶病毒性状的序列特征性扩增区域(SCAR)标记

Sequence-characterized Amplified Region(SCAR) Markers Linked to Watermelon mosaic virus Resistant Gene in Cucumber

张海英;张洁;毛爱军;张峰;许勇;王永健**

2009, 17(2): 312-316 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

以抗西瓜花叶病毒 (Watermelon mosaic virus, WMV)的黄瓜（Cucumis sativus）品种秋棚和感该病毒的欧洲八号为亲本，构建了120个F6重组自交系群体。根据苗期抗病接种鉴定结果进行遗传分析，发现黄瓜抗WMV的基因是由隐性单基因控制。利用集团分离分析法和相关分子标记技术，获得的特异片段E-ACT/M-CTT-427与WMV的抗性基因连锁，连锁距离为8 cM。双亲差异片段测序结果显示感病亲本目标片段存在6个T碱基的缺失。根据测序结果设计了1对与目的基因遗传距离为8 cM的序列特征性扩增区域(SCAR)引物，该引物可用于黄瓜抗WMV病毒的分子标记辅助育种。

以羽毛、人发为枯草芽胞杆菌KD-N2液体发酵碳、氮源生产角蛋白酶模型的建立

Establishmeut of Dynamic Models for Keratinase of Bacillus subtilis KD-N2 by Batch Fermentation using Feather andHuman Hair as Carbon and Nitrogen Substrate

蔡成岗1;郑晓冬2*

2009, 17(2): 328-333 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

以枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)KD-N2为发酵菌种，分别以羽毛、人发为碳、氮源，研究了5 L发酵罐内角蛋白酶的发酵动力学。根据Logistic方程和Luedeking-Piret方程建立了菌体生长和产物生成动力学模型。根据实验数据确定了模型参数，以羽毛为唯一碳、氮源发酵过程中菌体生长动力学模型为dX/dt =0.1013(1－X/0.3742)X，角蛋白酶生成动力学模型为dP/dt =276.69dX/dt －3.6X，以人发为碳、氮源底物发酵过程中菌体生长动力学模型为dX/dt =0.0728(1－X/0.197)X，角蛋白酶生成动力学模型为dP/dt =422.34dX/dt + 5.187X。

利用差减链式反应构建白菜基因组代表性文库

Construction of Brassica campestris Representative Library Using Differential Subtractive Chain

武剑1;冯艳丽1;和江明2;王晓武1**

2009, 17(2): 307-311 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

构建多态性比例高的基因组代表性文库是提高芯片和测序基础上的标记技术效率的关键。通过差减链式(differential subtractive chain, DSC) 反应，去除同一物种内的不同栽培种群间不具多态性的片段，能够提高基因组代表性文库中多态性片段的比例。研究利用白菜类作物（Brassica campestris） 8个栽培种群的材料构建tester DNA样品，利用水菜(B.campestris ssp. nipposinica) DNA作为driver样品。这两个DNA样品经EcoRⅠ/Mse Ⅰ酶切，酶切产物连接不同的接头。3遍DSC反应后，将反应产物连接到pDONR201载体中，构建基因组复杂性降低文库。分2批随机取其中20个单克隆和95个单克隆，分别进行Southern斑点杂交，结果分别显示9个和98个多态性片段，其比例分别为45%和61%，较之前关于多态性芯片技术的相关研究中15%～17%的多态性克隆比例大大提高。

棉花胚珠蛋白三氯乙酸丙酮法与酚抽提法的比较分析

Evaluations of Trichloroacetic Acid-acetone Method and Phenol Method for Protein Extraction from Cotton Ovule

赖童飞;董薇;贾银华;杜雄明**

2009, 17(2): 317-322 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

以亚洲棉（Gossypium arboreum）DPL971及DPL972初生壁合成期的胚珠为材料，通过蛋白质产率、纯度测定以及凝胶电泳图谱对三氯乙酸丙酮沉淀法和酚抽提法进行了比较分析，结果表明：1.两种方法均能获得大量的可溶性蛋白，但是酚抽提法获得的蛋白产率高、质量好、种类多；2.两种方法提取的蛋白种类有所不同，但酚抽提法在酸性区域以及对高分子量和低分子量蛋白的提取有更好的表现；3.酚抽提法可以更加有效地清除干扰物质，获得高质量的凝胶图谱，适合棉胚珠组织蛋白的提取。实验为棉纤维发育期蛋白质组学的研究提供了参考，同时对包含多种干扰物质的其它非模式植物蛋白提取也具有一定的借鉴意义。

重组甘蔗1-氨基环丙烷-1-羧基(ACC)氧化酶的纯化及其特性

Purification and Characterization of the Recombinant 1-aminocyclopropane-
1-carboxylate (ACC) Oxidase from Sugarcane

王爱勤1,2;韦波3;韦宇拓4;何龙飞2;杨丽涛2;李杨瑞1**

2009, 17(2): 323-327 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

在IPTG诱导下，重组甘蔗(Sacharum sinensis)1-氨基环丙烷-1-羧基(ACC)氧化酶在体外以包涵体蛋白形式表达。包涵体蛋白经Ni2+-NTA金属螯合层析柱纯化和复性后，获得酶活力高达132.58 nmolC2H4/ mg/h 蛋白。该蛋白在pH 5.5 ~ 8.0 和20 ~ 45 ℃温度范围内比较稳定，最适pH 6.7，最适温度33 ℃；米氏常数(Km )61.77 μmol/L，酶动力学参数（Vm）值0.9647 μmol/min，被一定浓度的CO2和底物ACC所激活，受Mg2+、Cu2+、Zn2+和EDTA抑制。

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63与其突变株间的DNA多态性分析和序列特征性扩增区域(SCAR)标记

DNA Polymorphism Analysis and a Sequence-characterized Amplified Region (SCAR) Markers of Streptomyces roseoflavus Menmyco-93-63 and Its Mutant Strains

王璇;杨文香;张汀;李亚宁**;刘大群**

2009, 17(2): 334-340 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

玫瑰黄链霉菌(Streptomyces roseoflavus )Men-myco-93-63是分离自马铃薯疮痂病自然衰退土壤中的一株拮抗菌。前期研究表明，该菌株及其发酵液对棉花黄萎病菌（Verticillium dahliae）等多种重要的植物病原真菌具有较强的抑制作用。利用AFLP对Men-myco-93-63及其8株抗生素生物合成阻断突变株进行了基因组DNA多态性分析。结果表明，38对AFLP引物共产生3 142条谱带，其中2 362条为多态性谱带，占总带数的75.2 %。从96对引物中筛选得到了3对引物：E-CA/M-GA，E-GA/M-AC和E-GA/M-AG，分别扩增出254、312和209 bp 3条仅在Men-myco-93-63中存在，命名为EM254、EM312和EM209。将这3个片段回收、克隆和测序，成功地将其转化为SCAR标记，可以更加方便地用于对突变株的分子检测。

利用SSR和RAPD标记分析中国部分地区晚疫病菌群体遗传多样性

opulation Genetic Diversity of Phytophthora infestans from China Revealed by SSRs and RAPDs

李本金1**;吕新1,2**;陈庆河1;兰成忠1;赵健1;邱荣洲1; 翁启勇1，2***

2009, 17(2): 347-354 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

利用SSR和RAPD对来自福建、黑龙江、河北和内蒙古4个地理群体的80个马铃薯晚疫病菌（phytophthora infestans）株进行了遗传多样性分析。13对SSR引物共扩增出76条谱带，多态性条带比率78.9%，相似系数变化范围0.00～0.42之间；筛选出的14条RAPD引物共扩增出189条谱带，多态性条带比率95.2%，相似系数变化范围0.04～0.66之间。遗传多样性分析表明，在4个群体中，福建群体的多样性更为丰富。遗传相似性分析显示，黑龙江和内蒙古两个群体间的遗传相似性最高，而福建和河北两个群体间的遗传相似性最低。聚类分析显示，来自南方福建的菌株与来自北方黑龙江、河北和内蒙古的菌株亲缘关系较远，且福建群体分布于更多的聚类组，显示出更高的遗传变异度。

一株红霉素降解菌红圆酵母的选育及其降解特性

Screening of An Erythromycin-degrading Strain Rhodotorula and Its Degradation Characteristics

王敏奇1;许晓玲1;李卫芬**;许梓荣1;马玉龙2

2009, 17(2): 341-346 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

选取长期堆放红霉素药渣的土壤，经驯化富集后筛选到1株能高效降解红霉素的菌株，根据表型特征、生理生化特性及18S rDNA序列同源性分析，鉴定为红酵母属的粘性红圆酵母（Rhodotorula mucilaginosa）。该菌的18S rDNA序列片段长度为1 562 bp，在GenBank登录号为EU294522。该菌可以利用红霉素作为碳源生长，适用碳源与氮源分别为蔗糖和NH4Cl。该菌降解红霉素的最适温度为30 ℃，最适pH 5.0～5.5，最适接菌量6%，降解率与通气量成正相关。在最适反应条件下培养48 h, 该菌株对红霉素的降解率可达100%。