农业生物技术学报

Relationship of Lignin Content with the Stem Color in the
Transgenic Poplar with Depressed Expression of 4CL Gene

贾彩红1，3 王宏芝1 杜克久3 宋艳茹2 ** 魏建华1 **

2004, 12(6): 621-624 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要：将反义4CL（4-香豆酸辅酶A连接酶, 4-coumarate:CoA ligase）基因转入三倍体毛白杨（Populus tomentosa Carr.）可显著降低转基因植株的木质素含量。转基因植株茎杆在剥皮后呈现程度不等的红褐色，而对照为白色。茎杆全部为红褐色的转基因株系中木质素含量下降最多，茎杆局部为红褐色或呈现红褐色斑点的株系中木质素含量下降幅度减小。野生型对照茎杆的Wiesner反应为典型的紫红色，转基因植株红褐色茎杆的Wiesner反应为红色。茎杆为红褐色斑块的株系中，红褐色部分的Wiesner反应呈红色，白色部分与对照相同，呈典型紫红色，进一步证明颜色改变与转基因株系木质素含量的关系。茎杆颜色的改变可作为一个辅助指标筛选低木质素含量的转基因株系。

茶树β-葡萄糖苷酶cDNA克隆和原核表达

β-glucosidase cDNA Cloning in the Tea(Camellia sinensis )
and Its Prokaryotic Expression

李远华江昌俊** 杨顺利余有本

2004, 12(6): 625-629 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要：对与萜烯类香气前体及与抗病虫害有密切关系的茶树(Camellia sinensis ) β-葡萄糖苷酶cDNA进行克隆和原核表达。结果表明，该酶cDNA全长序列为1 475 bp(GenBank登录号为AF537127)，与其它植物同源性为40%～60%。α-螺旋构象14.33%、β-折叠构象25.43%，存在多个氨基酸功能结构域。利用pET-32a表达载体构建的重组质粒，转化到大肠杆菌(Escherichia coli )菌株BL21zztrxB（DE3）中，诱导产生63 kD的融合蛋白，表达产物具有正常的生物学活性，能催化葡萄糖苷键的水解反应；诱导表达结果显示，主要在细胞质中以可溶性蛋白形式进行表达。

玉米In5-2启动子功能区域结构分析

　　Structural Analyses of Functional Region of Maize
In5-2 Promoter in Transgenic Tobacco

袁媛梁本国刘允军王涛**

2004, 12(6): 630-634 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要：利用PCR技术获得6个不同长度的玉米In5-2启动子5'端缺失片段，分别克隆到植物表达载体p1301后转化烟草。GUS活性定量检测结果显示，玉米In5-2的基础转录区域可能位于ATG上游-1 520~-1 431 bp之间。利用DNAMAN软件分析在-1 108~-1 079 bp和-891~-864 bp之间存在着2个茎环结构，推测茎环结合蛋白位点可能位于-1 079~-897 bp之间，且ATG上游-388~-86 bp之间可能存在乙酰苯胺类化合物诱导元件。

小鼠SN和NSN卵成熟分裂过程中S1核酸酶敏感性变化

S1 Nuclease Sensitivity of Surrounded Nucleolus(SN)- and Non Surrounded Nucleolus(NSN)-type Mouse Ooctyes during In vitro Maturation

李俊杨明升李迎香徐银学刘红林**

2004, 12(6): 658-661 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要：比较了两种染色质构型不同的小鼠卵泡卵子体外成熟过程中S1核酸酶敏感性的变化。结果发现，染色质构型不同的两类小鼠卵子在第1次减数分裂中期（MⅠ期）S1核酸酶的敏感性存在显著差异，NSN(non-surrounded nucleolus，染色质结构较松散，散布在核质中)型卵子S1核酸酶的敏感性显著高于SN(surrounded nucleolus，染色质高度凝集，集中围绕在核仁周围，形成染色质环)型卵子（P <0.01）；然而在第2次减数分裂中期（MⅡ期）两种类型卵子S1核酸酶的敏感性趋于一致，二者无显著差异（P >0.05）。染色质构型不同的两种卵子发育至MⅠ期时，染色体单链构型丰富度存在显著差异，但由MⅠ期发育到MⅡ期过程中，二者单链构型丰富度趋于一致。

鸡γ-干扰素基因在昆虫细胞/杆状病毒载体系统中的表达

Expression of Recombinant Chicken IFN-γ Gene in Baculovirus Vector System

王海艳2 刘胜旺1** 孔宪刚1 赵振华2

2004, 12(6): 639-643 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要：将鸡（Gallus gallus）的γ-干扰素（interferon-γ, IFN-γ）基因亚克隆到杆状病毒转移载体pMelBacB的BamHⅠ位点上，构建真核转移载体pMelBacB-ChIFN-γ，经限制性内切酶消化、ChIFN-γ特异引物PCR鉴定和序列测定，证明目的基因正确克隆到载体的预期位点。将纯化的pMelBacB-ChIFN-γ质粒与杆状病毒DNA（Bac-N-BlueTM DNA）共转染sf9昆虫细胞，经3轮蓝斑筛选纯化，获得了重组杆状病毒rBaculovirus-ChIFN-γ。提取病毒DNA经ChIFN-γ特异引物和重组杆状病毒特异引物PCR鉴定，证明获得了纯化的重组杆状病毒，命名为rBaculovirus-ChIFN-γ。用该重组病毒接种sf9昆虫细胞，收获接种后不同时间的细胞进行SDS-PAGE,结果表明ChIFN-γ基因在昆虫细胞中获得了表达，表达的重组蛋白分子量约为19 kD。应用在大肠杆菌(Escherichia coli )原核表达系统中表达的重组蛋白制备的兔抗ChIFN-γ多克隆抗体进行Western blot分析，表明表达的重组蛋白具有抗原性。

猪伪狂犬病gE-ELISA鉴别诊断方法的建立及初步应用

Development and Preliminary Application of the gE Enzyme Linked Immunosorbent Assay for Detecting Antibodies to gE Protein of Pseudorabies Virus in Pigs

　唐　　　　勇1,2　　　　陈焕春1**　　　　覃雅丽1　　　　何启盖1　　　　金梅林1　　　　吴　　　　斌1　　　　刘正飞1

2004, 12(6): 635-638 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要: 为了区分伪狂犬病野毒感染猪与糖蛋白E(gE　)基因缺失疫苗免疫猪，利用大肠杆菌(Eschirchia coli　)BL21(DE3)表达伪狂犬病病毒gE糖蛋白，经纯化、变性、复性等处理后将gE蛋白作为抗原建立了伪狂犬病的gE-ELISA鉴别诊断方法。以该方法检测115份已知背景猪血清，结果表明，该方法诊断特异性为94.5%，诊断敏感性为96.7%。以5块不同批次的包被抗原的酶标板检测5份血清，结果显示阳性血清的变异系数均小于10%，表明该方法重复性好。对比国外阻断gE-ELISA同时检测临床356份猪血清，两者阳性符合率为87.44%（195/223），总符合率为92.13%（328/356）。以上结果表明该gE-ELISA特异、敏感且重复性好，可用于猪伪狂犬病的鉴别诊断。

牛体细胞核移植胚和孤雌激活胚的两步法体外培养

Develeopment of Bovine Somatic Cell Nuclear Transfer and
Parthenogenesis Embryos in Two-step Culture System In vitro

李裕强张琇李煜张涌

2004, 12(6): 653-657 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要：研究了牛体细胞核移植胚和孤雌胚在不同体外培养系统中的发育效果。结果显示：牛孤雌胚在培养液BECMaa＋10％FBS中的囊胚发育率明显高于SOFaa＋10％FBS或TCM199＋10％FBS （16.5% ∶ 13.6% / 12.8%, P＜0.05）；而在SOFaa＋10％FBS中添加还原型谷胱甘肽（GSH）后，牛孤雌囊胚的发育率显著提高（18.5% ∶12.8%, P＜0.01）。成纤维细胞生长因子4（FGF4）或胰岛素添加进无血清SOFaa（含GSH）中，可明显提高牛体细胞核移植胚的囊胚发育率（8.7% / 9.3%∶5.5%, P＜0.05），血清存在时，这两种生长因子无明显作用。依据上述结果及牛早期胚胎的代谢特征，以SOF为基础液合成两组培养液分两步培养牛胚胎，即先用胚胎培养液Ⅰ（SOFnaa＋GSH＋EDTA＋insulin）培养72 h，然后换用胚胎培养液Ⅱ（SOFaa＋GSH＋5％FBS＋葡萄糖＋insulin）继续培养，与对照组（SOFaa＋GSH＋10％FBS一步培养）相比，牛孤雌胚和核移植胚的囊胚发育率都明显提高（22.3%∶18.5%; 15.0%∶11.7%, P＜0.01），说明两步法培养体系更符合牛早期胚胎不同发育阶段的代谢特征和营养需求，是一种适宜的牛胚胎培养方法。

肿瘤坏死因子-α诱导大鼠脂肪细胞凋亡

Rat Adipocyte Apoptosis Induced by Tumor Necrosis Factor-α

林亚秋李瑞文孙超陈国柱杨永青孟德连杨公社**

2004, 12(6): 644-647 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要：采用光学显微镜、DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞术3种技术，检测了不同浓度肿瘤坏死因子α(TNF-α)对大鼠脂肪细胞凋亡的影响。结果表明，①TNF-α诱导脂肪细胞凋亡的形态学变化与浓度呈线性相关，在5~20 ng/mL范围内，浓度越大，凋亡特征越明显。②5 ng/mLTNF-α处理有明显的形态学变化，但电泳结果未见梯状条带，说明细胞凋亡的形态学变化早于细胞凋亡的生化特征性改变。③TNF-α诱导脂肪细胞凋亡在5~20 ng/mL浓度范围内存在剂量-效应关系，5，10，15和20 ng/mL TNF-α处理组与对照组相比差异极显著（P <0.01），10 ng/mL与15和20 ng/mL处理组之间差异不显著（P>0.05），以10 ng/mL为最佳诱导浓度。

山羊胎儿睾丸细胞体外分离培养及雄性生殖系干细胞的生长行为

Separation and In vitro Culture of the Goat Fetal Testicular Cells
and the Behavior of Male Germ-line Stem Cells(mGSCs)

董武子1 华进联1 庄淑珍1 沈文正1,2 窦忠英1**

2004, 12(6): 648-652 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要：采用4种不同的处理方法消化山羊胎儿睾丸组织，其中0.1%的胶原酶Ⅰ处理15 min后，用0.25%胰酶处理5 min，经3次洗涤，睾丸细胞分散较好。用不同的培养体系体外培养，结果显示：原代培养山羊胎儿睾丸细胞培养120 h左右，获得桑椹状雄性生殖系干细胞(mGSCs)集落和单层支持细胞，mGSCs集落呈半悬浮式隆突生长，mGSCs集落和支持细胞分区明显；传代培养显示，在小鼠成纤维细胞饲养层上， mGSCs集落和mGSC单细胞被同质化程度较显著，而含有支持细胞的mGSC单细胞和mGSCs集落被同质化程度较弱；传代mGSCs集落和支持细胞共培养体系中，mGSCs集落正常生长，而且集落中细胞间隙紧密，mGSCs分化较慢。

江西地方鸡种的AFLP多态性及其群体遗传关系

Polymorphism of Jiangxi Indigenous Chicken Breeds and Its
Population Genetic Relationships Inferred by AFLP Analysis

胡小芬1,3** 高军1** 艾华水1 丁能水1 陈从英1 郭源梅1 舒希凡2 黄路生1 任军1***

2004, 12(6): 662-667 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要：利用15对AFLP引物组合，检测了8个地方鸡种(南城黑鸡、余干五黑鸡、崇仁麻鸡、宁都三黄鸡、万载康乐黄鸡、广丰白耳黄鸡、东乡绿壳蛋鸡和泰和丝羽乌骨鸡)、1个培育品种（景德黄鸡）和1个外来鸡种（以色列隐性白羽鸡）池DNA的遗传变异，计算了10个鸡种的遗传相似系数，其中南城黑鸡与余干五黑鸡的遗传相似系数最高（0.7790），其次为广丰白耳黄鸡与景德黄鸡（0.6726），崇仁麻鸡和以色列隐性白羽鸡的遗传相似系数最低（0.2801）。在UPGMA聚类关系图中，8个江西地方鸡种及培育鸡种景德黄鸡聚成一大类，其中余干五黑鸡与南城黑鸡、广丰白耳黄鸡与景德黄鸡分别两两相聚，以色列隐性白羽鸡另聚成一类。实验结果表明，江西省地方鸡种和引进品种之间的亲缘关系较远；南城黑鸡和余干五黑鸡的遗传距离最近，两者有着极密切的亲缘关系。结合生产性能、体形外貌及此前RAPD研究结果，认为南城黑鸡和余干五黑鸡可能是“同种异名”。广丰白耳黄鸡和景德黄鸡也表现出较密切的亲缘关系，这与RAPD分析结果及广丰白耳黄鸡是景德黄鸡的原始亲本之一的育种历史相一致。

绍兴鸭性成熟前卵巢GnRH-I与ER-βmRNA表达的发育性变化

Developmental Changes of GnRH-I and ER-β mRNA
Expression in the Ovary of Prepubertal Shaoxing Ducks

倪迎冬周玉传卢立志陈杰赵茹茜**

2004, 12(6): 668-671 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要：采用反转录多聚酶链式反应（RT-PCR）方法检测了绍兴蛋鸭出雏至90日龄卵巢GnRH-I和ER-β mRNA表达丰度的变化。结果表明：从1~90日龄卵巢GnRH-I mRNA含量逐渐升高，1日龄水平最低， 60和90日龄时水平显著高于1和30日龄（P <0.01）；卵巢ER-β mRNA含量呈先升后降趋势，60日龄时表达量最高，显著高于1、 30 （P <0.01）和90日龄（P < 0.05）。提示：绍兴鸭卵巢内GnRH-I mRNA表达的上调可能对后期等级卵泡的形成起重要调节作用；而ER-β mRNA则主要参与介导E2对卵巢早期发育调节。

转基因小鼠生产过程的优化

Optimization on Process of Transgenic Mice Production

郑敏 2 王莉莉1 王美丽 2 牛慧玲2 戴蕴平1*

2004, 12(6): 672-675 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要：以昆明小鼠作为制备转基因小鼠的供、受体，优化了转基因小鼠生产过程中的显微注射和移植过程，调整了对大小不同的DNA的注射浓度和受体鼠的选择标准。结果使转基因效率从10%上升到20%以上; 并得出DNA的大小与注射浓度的最适结合点为大于10 kb的DNA, 浓度应控制在2~3 μg/mL。

杆状病毒SpltMNPV gp41基因的克隆、表达及抗体制备

Cloning and Expression of Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus
gp41 Gene in Escherichia coli and Preparation of Its Antibody

潘丽晶李朝飞尹崇吕雷庞义**

2004, 12(6): 676-679 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

　摘要：GP41是杆状病毒包埋型病毒粒子（Occlusion-derived virus，ODV）特有的糖蛋白，它介导芽殖型病毒粒子（Budded virus，BV）的核衣壳通过胞核。用PCR方法扩增得到斜纹夜蛾核多角体病毒（Spodoptera litura nucleopolyhedro virus，SpltMNPV）gp41基因, 并将其克隆至5′端有6×His编码序列的原核表达载体pQE30上，转化大肠杆菌(Escherichia coli )M15[pREP4]，在1 mmol/L异丙基-D-硫代半乳糖（IPTG）诱导下超量表达了与理论预测值相符的1个37.9 kD融合蛋白。以纯化的融合蛋白为抗原，免疫新西兰大白兔制备了特异的抗GP41抗体。Western印迹分析表明，该抗体适合进一步分析SpltMNPV GP41蛋白。

香蕉束顶病毒海南分离物DNA组分的克隆及序列分析

Cloning and Sequencing of DNA Components of
Banana bunchy top virus Hainan Isolate

田娥庄军刘志昕*

2004, 12(6): 680-684 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要：以中国海南岛地区表现束顶病毒(Banana bunchy top virus, BBTV)症状的香蕉组织总DNA为模板，通过PCR方法克隆了BBTV海南分离物的6个DNA组分全序列，并进行了核苷酸序列分析。测序结果表明， DNA1~6序列全长分别为1104、1067、1059、1045、1014和1081 nt，均已登录到GenBank(登录号分别为AY450396、AY606084、AY494786、AY494788、AY606085和AY494787)。与世界不同地域分离物进行序列同源分析，发现DNA1序列较保守，与越南分离物的同源性达到了95.4%；而DNA2和DNA4变异较大，其中DNA2序列与广州分离物的同源性仅有83%。根据DNA1的序列差异分析初步确定BBTV海南分离物属于亚洲亚组。

甘蔗黑穗病菌（Ustilago scitaminea Syd.）分子多样性初步分析

Primary Analysis of Molecular Diversity in Populations of the
Fungus Ustilago scitaminea Syd.

阙友雄许莉萍** 邹添堂陈如凯

2004, 12(6): 685-689 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要：应用经筛选的13条10 bp随机引物，对来自福建等6个省（区）甘蔗(Saccharum ssp.)上的18个甘蔗黑穗病菌（Ustilago scitaminea）分离物进行了RAPD分析。来自福建和广西的2个代号分别为7和9的分离物间，显示出最大的相异系数为0.89474；最小相异系数为0.25217, 是在两个福建分离物间出现的。UPGMA聚类结果表明，18个分离物在0.75的相异水平上可以聚为6个群体，7个来自不同寄主品种的福建分离物相异系数较小，分布于2个相邻的遗传聚类群中，同时，2个来自同一寄主品种不同地理来源的分离物间，显示出高达0.82353的相异系数。说明分子多样性同地理来源之间具有一定的相关性，但与寄主来源无关。

几株固氮芽孢杆菌的分离与鉴定

Isolation and Identification of Nitrogen-fixing Bacilli

丁延芹1 王建平1 刘元1 陈三凤1** 王幼珊2 邢礼军2

2004, 12(6): 690-697 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要：从小麦（Triticum aestivum）、玉米（Zea mays）、黑麦草（Lolium sp.）和柳树（Salix sp.）的根际土壤中分离得到能在无氮培养基上生长的29株芽孢杆菌（Bacilli），通过固氮酶活的测定以及固氮酶结构基因 nifH 的PCR扩增得到7株固氮芽孢杆菌。对这7株固氮菌株进行了生理生化性状测定、16S rDNA序列分析(GenBank accession No. AY373358, AY373360,~AY373364和AY376876)、G+C mol%含量的测定及DNA-DNA杂交实验，结果表明，其中5株菌属于芽孢杆菌，另外2株菌属于类芽孢杆菌。在这7株被鉴定的菌株中，菌株T1被鉴定为Bacillus cereus；菌株G1、C4和C5被鉴定为B. megaterium；菌株W5的生理生化性状、16S rDNA和G+C mol%与Bacillus marisflavi 相近；G2的生理生化性状和16S rDNA 与Paenibacillus polymyxa 接近，但在基于16S rDNA的系统发育树中却与P. durus 聚在最小的分支内；T7可能是Paenibacillus属中的一个新种。

原生质体融合构建防病、杀虫和内生多功能工程菌

Construction of Antagonistical, Insecticidal and Endophytic Multifunctional-engineering Strains by Protoplast Fusion

颜念龙1 邱思鑫2 何红3 关雄1 胡方平2**

2004, 12(6): 704-708 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要：将含vip3A基因的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）和具有内生及防病等优良特性的枯草芽孢杆菌(B. subtilis)进行原生质体融合，构建了1株多功能工程菌, 经PCR检测vip3A基因呈阳性，并测定了融合子对黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)的拮抗作用、对小菜蛾(Plutella xylostella)毒性及内生定殖能力。实验结果显示多功能工程菌对黄瓜枯萎病菌具有拮抗作用，对小菜蛾的校正杀虫效率在59%以上，并具有内生定殖能力。

E26菌剂对葡萄悬浮细胞防卫反应基因pal和sts表达的影响

Effects of E26 Agent on the Expressions of
Defense Genes pal and sts of Grape Suspension Cells

郑祖宇李金云王建辉王慧敏**

2004, 12(6): 698-703 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要：以苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase, PAL）和1,2-二苯乙烯合成酶（stilbene synthase, STS）作为抗性反应指标，对秋黑（Vitis romanetii cv.Qiuhei）和赤霞珠（V. vinifera cv. Cabernet Sauvignon）葡萄悬浮细胞系在根癌病生防制剂—E26(Agrobacterium vitis )菌剂的不同组分（E26菌体细胞、发酵液和代谢液）处理后的PAL酶活性及防卫反应基因pal和sts的转录进行了研究。在E26菌体细胞处理后12~48 h、E26发酵液处理后的4~48 h和E26代谢液处理后的12~48 h，秋黑和赤霞珠的PAL酶活性均明显高于对照。Dot blotting显示，在E26菌体细胞处理后的12~48 h，秋黑和赤霞珠的pal和sts的转录表达量（mRNA）均明显高于对照; E26发酵液处理后，秋黑在4~48 h的pal转录表达量明显高于对照，赤霞珠在4~12 h的pal转录表达量明显高于对照；秋黑和赤霞珠在4~48 h的sts转录表达量均明显高于对照; E26代谢液处理后，秋黑在4~48 h的pal转录表达量明显高于对照，赤霞珠在4~24 h的pal转录表达量明显高于对照；秋黑和赤霞珠在6~48 h的sts转录表达量均明显高于对照。

缓冲体系对产弹性蛋白酶芽孢杆菌EL31410发酵的影响

Effect of Buffer Systems on Elastase Production by Bacillus sp. EL31410

徐莹1 何国庆1* 陈启和1 李景军2

2004, 12(6): 709-713 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要: 弹性蛋白酶是以降解弹性硬蛋白为特征的蛋白水解酶。培养芽孢杆菌(Bacillus sp.) EL31410产弹性蛋白酶的过程中，pH的波动对产酶有较大影响。菌体最适生长pH为6.0～7.0，最适产酶pH为6.4～6.6。采用单因素实验和二次通用旋转回归设计研究了缓冲体系对产弹性蛋白酶芽孢杆菌EL31410发酵的影响。优化结果显示：15 h后添加pH 6.4 KH2PO4-NaOH缓冲液，使其在培养基中浓度为0.02 mol/L时，对控制发酵液pH和提高菌体生长及酶活性的综合效果为最佳。验证实验证明该模型是较可靠的。

　人工合成的GFM cry11B基因在大肠杆菌中表达、纯化及抗体制备

Expression and Purification of GST-GFMCry11B Fusion Protein in E.coli and Preparation of Polyclonal Antibody Against GFMCry11B

丁敏1,2 王锋1** 苏军1 陈志厚1 陈在杰1 孙明2

2004, 12(6): 714-719 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要: 用限制性内切酶酶切的方法把人工合成的GFM cry11B基因编码区克隆到原核表达载体pGEX-4T-3中，构建成重组表达质粒pGC。在大肠杆菌(Escherichia coli )中表达了GST-GFMCry11B融合蛋白，表达量约占菌体总蛋白的21%，其表达产物主要以包涵体的形式存在。对包涵体蛋白进行可溶性处理，用Glutathione Sephrose 4B纯化出GST-Cry11B融合蛋白。Thrombin酶切后得到Cry11B蛋白，将其作为抗原免疫家兔获得了滴度（ELISA）为1∶8000的抗血清，并具有较强的特异性。