大麦(Hordeum vulgare)是重要的作物和工业原料,大麦叶斑病(Spot blotch)是严重危害大麦生产的病害之一。该病害主要侵害叶片和叶鞘,其发生和流行严重影响大麦的产量和品质。为挖掘与大麦抗叶斑病相关联的分子标记,本研究通过在苗期人工接种叶斑病菌株对142份大麦材料进行抗性鉴定,并利用SSR分子标记结合大麦抗叶斑病表型鉴定结果进行关联分析,寻找有效抗叶斑病位点。结果表明,70个SSR标记共检测出504个等位变异,平均每个标记为7.2个;主基因频率变异范围是0.196 3~0.503 5,平均为0.344 2;PIC变化范围为0.521 2~ 0.847 0;基因多样性指数的变化范围是0.600 7~0.862 4;聚类分析和群体遗传结构分析同时将该群体分为5类。结果共检测到6个显著关联的SSR标记,分别位于大麦的3H、4H和5H染色体上,并在4H染色体上最终确定了1个赋予大麦叶斑病抗性的QTL位点。本研究结果将有助于大麦品种的选育,获得的抗大麦叶斑病相关联位点可为大麦的分子标记辅助育种提供参考。

TCP (teosinte branchedⅠ, cycloidea, proliferating cell factors 1 and 2)是植物特有的一类转录因子,在植物生长发育过程中发挥着重要的调控作用。马铃薯(Solanum tuberosum)块茎的休眠和发芽,对马铃薯育种、块茎生产和加工都极为重要。课题组前期研究发现马铃薯StTCP23 (GenBank No. NW_006239107.1)基因在块茎休眠解除过程中表达量持续上调,为了阐明马铃薯StTCP23基因的生物学功能,本研究对其进行了克隆、亚细胞定位和生物信息学分析,并利用qPCR技术分析了其组织特异性和块茎休眠解除过程中的表达情况。结果表明,StTCP23主要定位在细胞核上;StTCP23含有1个典型的TCP保守结构域,属于非跨膜蛋白,总磷酸化位点占22.44%。StTCP23基因在马铃薯叶中表达量最高且存在品种差异,在块茎休眠至发芽过程中StTCP23基因的表达量呈持续上升趋势,且休眠和休眠解除过程中该基因表达差异极显著(P<0.01)。本研究为阐明马铃薯StTCP23基因功能提供了基础资料。

脱落酸(abscisic acid, ABA)及其受体pyrabactin resistance-like (PYL)蛋白在植物抵御干旱胁迫中发挥重要功能。为探究木薯(Manihot esculenta) MePYL4a (GenBank No. XM_021766535)基因的抗旱功能,本研究从木薯品种'SC8'中克隆MePYL4a基因,对其进行了生物信息学分析,利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的瞬时转化法进行亚细胞定位;通过实时荧光定量PCR检测MePYL4a基因在干旱胁迫处理下的表达情况;并构建了MePYL4a过表达载体转化拟南芥(Arabidopsis thaliana),进行拟南芥转基因植株的抗旱分析。结果表明,MePYL4a是不稳定蛋白,MePYL4a蛋白的亚细胞定位特征分析表明其定位于细胞核和细胞质内;qPCR分析显示,MePYL4a基因的表达水平显著受到干旱胁迫诱导,在1 h达到最高,随后慢慢下降。干旱处理后,观察表型发现MePYL4a能够提高干旱胁迫下拟南芥幼苗的耐旱性,过表达植株平均生物量是野生型(wild type, WT)的1.5倍,ABA合成关键限速酶基因9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase, NCED3)和干旱胁迫诱导表达基因(responsive to desiccation 29A, RD29A)表达量显著高于WT和Atpyl4突变体植株,抗氧化酶活性也大约比WT高了2倍,表明MePYL4a的过表达植株清除活性氧的能力强于WT和Atpyl4突变体植株,在干旱胁迫下能积累更多的生物量,增强拟南芥的抗旱性。综上所述,MePYL4a过表达降低了干旱胁迫下拟南芥中活性氧的积累,诱导抗逆基因上调表达,增强拟南芥抗旱性。本研究为MePYL4a参与木薯抗逆的进一步研究提供参考依据。

植物的钼辅因子硫化酶(molybdenum cofactor sulfurases, MCSU or LOS5)在应对非生物胁迫中有重要作用。目前探究葡萄(Vitis vinfera)中的VvMCSU基因调控脱落酸(abscisic acid, ABA)合成以应对光胁迫的研究较少。本研究利用PCR扩增克隆葡萄VvMCSU基因(GenBank No. LOC100247369)的编码区序列全长,通过生物信息学对基因功能和所编码的蛋白氨基酸序列进行分析和预测,并通过实时荧光定量PCR分析该基因在不同的光照条件下的表达特征。结果表明：重度遮光引起植株的最大光合量子产量(the maximum photosynthetic quantum yield, Fv/Fm)和非光化学淬灭参数(non-photochemical quenching, qN)分别上升4.32%和28.13%,相较对照组T2,叶宽显著增加了10.16%,ABA含量显著增加了1.50倍。VvMCSU基因编码区全长2 478 bp,编码825个氨基酸;其启动子区域具有多个响应非生物胁迫和激素的顺式元件。VvMCSU为具有MCSU结构的亲水性蛋白,与ABA合成相关蛋白互作;与山茶(Camelia sinensis)属同一条进化分支,亲缘关系最近。光胁迫可诱导VvMCSU的表达上调,在自然光照下,上调为对照组的2.77倍;在重度遮光下,上调为对照组的4.01倍。VvMCSU基因表达量与ABA含量和植物Fv/Fm呈极显著正相关(P<0.05)。本研究结合叶绿素荧光参数和ABA含量分析了VvMCSU在不同光照条件下的表达规律,推测该基因为葡萄应对光胁迫的重要调控基因,为提高葡萄耐荫性的研究提供了理论依据。

PYL (Pyrabactin resistance 1-like)蛋白作为脱落酸(abscisic acid, ABA)的直接受体,在植物的生长发育和逆境胁迫响应中发挥重要作用。为探究草莓PYL家族的功能,本研究利用生物信息学方法,对森林草莓(Fragaria vesca)和凤梨草莓(F. ananassa) PYL基因家族成员进行鉴定,并采用qPCR对该基因在不同模拟逆境胁迫下的表达进行分析。结果表明,森林草莓中共含有16个FvPYL基因,分布于7条染色体上;凤梨草莓中共40个FaPYL基因,分布于18条染色体上;FaPYL基因家族的基因大小跨度较FvPYL基因大,但其蛋白结构相似,以α-螺旋和不规则卷曲为主;除了FvPYL15和FaPYL40蛋白外,其余均属于亲水性蛋白,且主要在叶绿体、细胞质及细胞核中表达。系统进化分析发现,FaPYL和FvPYL基因分布于5个亚家族中,存在于同一亚族的同一品种,其基因结构、基序位置基本相同;FvPYL基因中仅存在3对片段重复,而FaPYL基因中存在大量片段重复和个别串联重复;基因的选择压力分析发现,草莓PYL基因偏向于正选择效应。顺式作用元件分析发现,草莓PYL家族基因主要包含光响应元件、激素响应元件、胁迫响应元件及生长发育相关元件。qPCR分析表明,草莓PYL基因在不同激素、盐、PEG处理下相对表达量存在显著差异：除FvPYL8,其余FaPYL和FvPYL在ABA处理下均呈上调表达;在NaCl处理下,大部分FaPYL基因呈不同程度上调表达,其中FaPYL21和FaPYL40受200 μmol/L NaCl的强烈诱导;FvPYL基因表达量总体上调,其中FvPYL11相对表达量达到对照的60倍;在PEG处理下,FvPYL基因整体呈正向调控,FvPYL1、FvPYL7上调趋势显著;FaPYL基因上调幅度差异较大,其中FaPYL2、FaPYL7相对表达量上调显著(P<0.05)。综上所述,凤梨草莓PYL基因家族的基因大小差异较森林草莓的大,但其理化性质相似;FaPYL和FvPYL基因对ABA、NaCl和PEG处理均存在不同程度的响应。本研究为草莓PYL基因家族的功能挖掘及应用研究提供了理论依据。

苏尼特羊(Ovis aries)是我国优质的肉羊资源,也是我国北方地区主要羊肉来源之一。长链非编码RNA (long non-coding RNA, LncRNA)在绵羊肌肉发育中发挥重要作用。为预测Lnc_000588在苏尼特羊骨骼肌发育中的调控网络,本研究对其在不同部位的组织表达量进行了实时荧光定量PCR分析及靶向miRNA-mRNA的生物信息学互作预测。同时,在小鼠(Mus musculus)成肌纤维细胞(C2C12)中检测了Lnc_000588的表达量。Lnc_000588在各组织中均有表达,且在背最长肌中的表达量极显著高于其他组织(P<0.01);Lnc_000588在C2C12细胞中的表达量随着细胞分化时间的延长而增加,48 h以后极显著高于较早时的表达(P<0.01)。;Lnc_000588可能通过miRNA参与调控肌肉的生长发育,其中的3个miRNA的靶基因富集于Ras信号通路(oas04014:Ras signaling pathway)、Rap1信号通路(oas04015:Rap1 signaling pathway)和AMPK信号通路(oas04152:AMPK signaling pathway)等66条通路。综上,Lnc_000588在苏尼特羊肌肉组织的表达量极显著高于其他组织,推测其参与了C2C12细胞分化。本研究为探究LncRNA参与苏尼特羊肌肉组织的调控功能提供了科学依据。

繁殖性状和产羔数是绵羊(Ovis aries)重要的经济性状,黄体生成素/绒毛膜促性腺激素受体(luteinizing hormone/choriogonadotropin receptor, LHCGR)对绵羊的繁殖性能和产羔数具有重要的影响。为了验证LHCGR基因对绵羊产羔数的影响,本研究以杜泊羊、小尾寒羊和滩羊及其杂交后代(D, TH, F₁, F₂和H₁) 5个绵羊群体为研究对象,运用飞行质谱(Sequenom MassARRAY^® SNP)技术对LHCGR基因的g.75709226 G>T、g.75733123 G>A、g.75747421 A>C和g.75748150 A>G 4个突变位点进行分型,并对各位点不同基因型和产羔数进行关联分析。结果表明：g.75709226 G>T和g.75733123 G>A位点在5个绵羊群体中为低度多态(polymorphic information content, PIC<0.25),g.75747421 A>C和g.75748150 A>G位点在5个绵羊群体中为中度多态(0.25≤PIC<0.5)。在g.75747421 A>C位点中,H₁绵羊群体野生型AA个体产羔数显著高于杂合型AC和突变型CC个体(P<0.05);g.75709226 G>T、g.75733123 G>A和g.75748150 A>G位点各基因型之间对各个群体的产羔数差异均不显著(P>0.05)。g.75747421 A>C和g.75748150 A>G位点间存在完全连锁不平衡,产生4种单倍型和6种双倍型;双倍型H3H3个体产羔数与双倍型组合H2H3个体差异不显著(P>0.05),显著高于双倍型组合H1H1、H1H2、H1H3和H2H2个体产羔数(P<0.05)。本研究结果表明,LHCGR基因g.75747421 A>C位点的多态性与H₁绵羊群体的产羔数相关,为改善H₁绵羊群体产羔数提供有效位点;LHCGR基因SNP位点g.75747421 A>C和g.75748150 A>G中的AAAA双倍型可以作为筛选绵羊产羔性状的潜在分子标记。本研究为LHCGR基因在绵羊产羔数性状选育中的应用提供了参考,为绵羊的选育工作提供理论依据。

自噬作为一种主要的降解/再循环途径,在维持细胞内稳态和生殖发育中发挥了重要作用。为探讨自噬在公猪(Sus scrofa)附睾发育过程中发挥的潜在作用,本研究以从江香猪附睾为对象,利用Western blot、免疫组织化学染色和qRT-PCR方法,分析了附睾在出生后15 d (初情期前)、30 d (初情期)、60 d (初情期后)和180 d (性成熟期) 4个时期自噬相关分子的表达和分布。Western blot结果显示,Beclin1在60 d表达量最高、180 d表达量最低;哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)在30 d表达量最高、180 d最低;微管相关蛋白1轻链3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3, MAP1LC3/LC3)-Ⅱ/LC3-Ⅰ在180 d最高,在30和60 d最低。免疫组织化学染色结果显示,Beclin1在15、30和180 d集中分布于附睾上皮主细胞和微绒毛,在60 d主要分布于附睾上皮周围的肌样细胞;LC3在15、30和60 d附睾中集中分布于主细胞和微绒毛,但180 d在上皮窄细胞有特异性表达。qRT-PCR结果显示,自噬相关基因Beclin1表达量在15 d最高、180 d最低,15和30 d差异不显著;MAP1LC3B基因表达量在180 d最高、60 d最低,各日龄段差异显著(P<0.05)。自噬相关蛋白12 (autophagy related protein 12, Atg12)和Unc-51样激酶1 (Unc-51-like kinase 1, ULK1)基因表达量变化趋势一致,在180 d最高、60 d最低,各日龄段差异显著(P<0.05);mTOR基因表达量在30 d最高、15 d最低,各日龄段差异显著(P<0.05)。上述结果提示,从江香猪附睾发育过程中可能存在mTOR介导的自噬调节通路。本研究为探讨自噬参与附睾发育的调节机制提供基础资料。

信使RNA (messenger RNA, mRNA)在调节骨骼肌发育的复杂动态网络中扮演重要角色。新西兰兔(Oryctolagus cuniculus)从胎儿到成年骨骼肌mRNA的作用尚不清晰。为筛选出与不同阶段新西兰兔骨骼肌发育相关的通路及候选基因,本研究选取新西兰兔2周龄胚胎、6周龄幼兔和6月龄成年兔的腿部肌肉进行转录组测序,分析差异mRNA及其潜在调控作用并通过qPCR进行验证。结果显示,共鉴定出12 845个mRNA,其中1 891个mRNA在3个发育阶段差异表达。胚胎组和幼年组之间有929个差异表达基因(上调393个, 下调536个);胚胎组和成年组有938个差异表达基因(上调449个, 下调489个);幼年组和成年组有24个差异表达基因(上调9个, 下调15个)。GO富集分析显示,胚胎组与幼年组的差异转录本与横纹肌收缩和骨骼肌收缩相关。幼年组和成年组的差异转录本与轴突延伸正调控、细胞生长正调控相关。KEGG分析结果显示,胚胎组与幼年组的差异转录本主要富集在PI3K/AKT信号通路、FoxO信号通路和AMPK信号通路。幼年组和成年组的差异转录本富集到控制肌肉生长发育的cGMP-PKG信号通路和HIF-1信号通路。qPCR验证了随机选取的10个差异基因的表达量与RNA-seq的分析结果一致。在胚胎组和幼年组中获得了ARG2、ATPTA2、TPM1、PRKAG3、PRKAA2和FoxO3等肌肉发育相关基因,在幼年组和成年组中获得了GOLGA4和PFKFB3等肌肉生长相关基因。本研究筛选了与新西兰兔骨骼肌发育的相关基因及相关通路,为后续研究新西兰兔骨骼肌发育提供了一定的理论依据。

大量基因组关联分析研究发现ADP核糖基化因子样15 (ADP-ribosylation factor-like 15, ARL15)基因变异与能量代谢相关疾病显著关联。为深入研究该基因生物学功能,本研究利用CRISPR/Cas9技术首次构建了ARL15基因敲除小鼠(Mus musculus)模型,并对其表型进行了分析。一代测序结果显示,敲除了小鼠ARL15基因2号外显子在内的1 841 bp;与野生型小鼠相比,ARL15^-/-小鼠ARL15基因和蛋白表达水平均显著降低(P<0.05);在胚胎期16.5 d,ARL15^+/+、ARL15^+/-和ARL15^-/- 3种基因型小鼠胚胎的存活比例符合孟德尔遗传定律;ARL15^-/-小鼠在出生后0.5 d死亡,且体重较轻(P<0.05);qPCR结果表明,小鼠ARL15基因缺失分别抑制了脂肪和肠道组织中脂联素(adiponectin, C1Q and collagen domain containing, Adipoq)和二酰基甘油O-酰基转移酶2 (diacylglycerol O-acyltransferase 2, DGAT2)基因的表达(P<0.05)。表明该基因对小鼠出生后早期存活和机体脂质代谢具有重要作用。本研究成功建立了ARL15基因敲除小鼠模型,可用于ARL15基因功能的深入研究。

汶上芦花鸡(Gallus gallus)是我国唯一的芦花羽国家级地方鸡品种。本研究旨在从基因组水平探究汶上芦花鸡群体的遗传多样性和遗传结构,检测基因组选择信号,发掘汶上芦花鸡的重要种质特性基因。根据地理分布、遗传背景等因素选择汶上芦花鸡与其他23个地方鸡种及3个引进鸡品种作为研究对象,利用酶切位点相关的简化基因组测序(restriction-site associated DNA sequencing, RAD-seq)技术鉴定基因组SNP,分析比较汶上芦花鸡群体与其他鸡种群体的遗传差异,并对进化过程中受到选择的基因进行功能注释。结果显示,在汶上芦花鸡群体中检测出SNP标记300 543个,鉴定到14个品种特异性SNPs,涉及5个功能基因;遗传结构上,汶上芦花鸡与元宝鸡、天津猴鸡、琅琊鸡、狼山鸡等聚为一类;筛选到16个受选择基因,功能分析表明受选择基因主要参与激素调节、神经系统发育、氨基酸代谢以及生殖细胞分化等生理功能。本研究有助于为汶上芦花鸡的保护和种质特性评价提供重要理论依据。

玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)黑色素调控转录因子1 (S. turcica melanin regulation factor 1, StMR1)具有双锌指结构域,通过调控基因表达影响玉米大斑病菌的生长、代谢和致病性,因此,阐明该转录因子的调控模式对解析玉米大斑病菌的致病机理至关重要。本课题组前期研究发现,StMR1基因被敲除后突变体黑色素合成受阻,菌落由黑色变为灰白色,致病力会显著降低。本研究利用玉米大斑病菌野生型菌株和StMR1基因缺失突变体的转录组测序(RNA sequence, RNA-seq)数据筛选差异表达基因,并对其进行基因本体论(Gene Ontology, GO)和KEGG功能注释分析,共筛选获得了1 383个上调表达基因和1 710个下调表达基因,下调表达基因与分子功能、细胞成分和生物学过程相关,涉及6类25条代谢通路。利用qRT-PCR对筛选获得的6个显著下调表达的基因SETTUDRAFT_172122、SETTUDRAFT_168776、SETTUDRAFT_166944、SETTUDRAFT_162601、SETTUDRAFT_131269和SETTUDRAFT_163249进行了表达量分析,结果发现,6个基因在突变体中的表达水平均呈下调趋势,说明转录因子StMR1对其可能具有正调控作用。生物信息学分析发现,SETTUDRAFT_162601基因具有典型的Catalase结构域,并通过qRT-PCR检测到该基因在H₂O₂胁迫下表达量显著升高(P<0.05),推测该基因与抗氧化胁迫有关。上述研究结果为深入分析转录因子StMR1调控玉米大斑病菌致病性的机制提供了借鉴,也为解析锌指类转录因子功能提供参考。

拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)、禾谷镰孢(F. graminearum)是引起玉米(Zea mays)茎腐病和穗腐病等病害的主要致病菌,可造成玉米产量和品质的下降,并影响机械化收获,同时病菌产生的真菌毒素会给人和家畜的健康带来严重威胁。热激蛋白(heat shock proteins, HSP)可以在生物体处于环境压力时大量表达从而防止蛋白质变性来提高生物体对各种逆境的抵抗力,目前Hsp70是最保守且研究较为广泛的一类热激蛋白。为探究拟轮枝镰孢及禾谷镰孢生长是否受温度的调控,本研究把生长期一致的拟轮枝镰孢和禾谷镰孢接种到培养基上,分别放置于20、25 与30 ℃的培养箱中培养,发现拟轮枝镰孢30 ℃时生长迅速,菌丝茂密,而禾谷镰孢20 ℃时生长更好。为进一步明确Hsp70基因家族是否参与调控温度胁迫下拟轮枝镰孢和禾谷镰孢的生长发育,本研究通过全基因组搜索,在拟轮枝镰孢基因组中鉴定获得了9个Hsp70基因,在禾谷镰孢基因组中鉴定得到了6个Hsp70基因,利用qPCR技术检测了生长在20、25和30 ℃条件下的拟轮枝镰孢和禾谷镰孢Hsp70基因家族的相对表达量。结果显示,拟轮枝镰孢Hsp70基因家族中的FvHsp70-2、FvHsp70-4、FvHsp70-5与FvHsp70-6基因在20 ℃的表达量显著升高(P<0.05),尤其基因FvHsp70-2,20 ℃时的表达量约是30 ℃时的4.5倍;而禾谷镰孢中与FvHsp70-6亲缘关系近的FgHsp70-6、与FvHsp70-2亲缘关系近的FgHsp70-2、与FvHsp70-4亲缘关系近的FgHsp70-4及与FvHsp70-5亲缘关系近的FgHsp70-3在30 ℃时表达量显著升高(P<0.05)。以上结果说明,拟轮枝镰孢和禾谷镰孢中均存在响应逆境温度的Hsp70基因,由此建立的Hsp70家族基因在不同温度下的表达模式可为解析Hsp70基因家族响应温度变化调控拟轮枝镰孢及禾谷镰孢生长的分子机制提供理论依据。

黄瓜细菌性角斑病是保护地黄瓜(Cucumis sativus)栽培中常见的细菌性病害之一,使用生防菌是一种重要的防治手段。为提高贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)对黄瓜细菌性角斑病的拮抗活性,分别采用紫外线(ultraviolet, UV)和室温常压等离子体(atmospheric room temperature plasma, ARTP)诱变的方式,对贝莱斯芽胞杆菌ZF145菌株进行诱变处理。以扁桃假单胞流泪致病变种(Pseudomonas amygdali pv. lachrymans)为指示菌,通过平板对峙和活体盆栽的方式对突变菌株进行筛选,并比较2种诱变方式突变效率,对正突变菌株进行遗传稳定性测试,分析正突变菌株代谢产物变化。结果表明,正突变菌株A561在活体盆栽实验中对黄瓜细菌性角斑病的防治效果高于出发菌株ZF145和对照药剂5%中生菌素可湿性粉剂,防治效果可达到63.61%,且生防相关代谢产物表面活性素合成基因簇(surfactin synthetase gene clusters, srf)基因srfAA、srfAB、srfAC表达量均显著上调(P<0.05)。ARTP诱变的正突变率为10.86%,远高于紫外线诱变正突变率,更适于芽胞杆菌的诱变选育。本研究为贝莱斯芽胞杆菌的诱变育种提供了理论支撑,对黄瓜细菌性角斑病生物防治具有重要意义。

酵母双杂交(yeast two-hybrid, Y2H)系统是研究蛋白质相互作用的有效方法之一,Y2H系统在蛋白质组学、功能基因组学、病理学等研究领域发挥重要作用。由于Y2H的有效性,近年在其基础上发展出了许多衍生技术。本文介绍了Y2H、酵母单杂交、酵母三杂交、反向双杂交技术、分裂泛素化细胞质酵母双杂交系统等技术的原理,及其在高通量筛选、蛋白互作定量分析、蛋白质互作组学研究、致病机理的揭示、新药靶点的搜寻、农业等方面的应用。本文也展望了Y2H 技术未来的发展方向。本综述有助于研究人员全面了解酵母双杂交技术的原理和发展历程,了解酵母双杂交技术的应用范畴,为需要使用该技术研究蛋白质互作的人员提供借鉴。

细菌、真菌、病毒等植物病原微生物引起植物病害,严重影响农作物产量,造成巨大的经济损失。在现代农业迅速发展的今天,传统的植物病原检测技术已难以满足人们对快检技术准确性、灵敏度、可操作性和便携性的要求。生物分子传感器是植物病原检测的一种新型手段,随着生物技术、新材料技术等前沿技术的交叉融合,新型生物分子传感器向微型化、高灵敏、实时检测方向快速发展,逐渐在植物病原研究中扮演重要角色。本文综述了近年来基于核酸和蛋白识别的植物病原生物传感技术研究进展,详细介绍了利用纳米材料、玻碳电极、纳米芯片等新型技术搭建的高灵敏核酸识别生物分子传感器,以及利用酶与底物、抗原抗体、适配体等特异性反应的蛋白识别生物分子传感器,展望了利用生物分子传感器技术在农业病原实时现场检测中的应用。本文为生物分子传感技术在农业植保领域的进一步研究和推广提供参考。

耐除草剂大豆(Glycine max) 'DBN9004'是我国自主研发的对除草剂草甘膦和草铵膦同时具有耐受性的转基因大豆新品种,已获得安全证书,在中国具有重要的产业化应用前景。为满足转基因作物安全监管技术要求,亟需对其进行定量检测方法的研发。本研究以耐除草剂大豆'DBN9004'的3'端旁侧序列为靶标,设计引物和探针,经特异性、正确度、精密度、检出限、定量限等指标测试,建立了该转化体特异性qPCR和微滴数字PCR检测方法。结果显示,本方法特异性强、重复性好,定量限达0.1% (约40个拷贝),检出限达0.05% (约20个拷贝),测试样品定值准确度高,相对标准偏差(RSD)为6.00%~10.95%,且qPCR与微滴数字PCR方法定量结果一致。该方法为耐除草剂大豆新品种'DBN9004'的精准定量检测提供了一种新的技术手段,为农业转基因监管提供技术支撑。

对于山羊(Capra hircus)地方性鼻内肿瘤病毒(Enzootic nasal tumor virus 2, ENTV-2)引起的羊地方性鼻内肿瘤(enzootic nasal tumor, ENT),目前已建立了RT-PCR结合限制性内切酶鉴定ENTV的方法以及RT-PCR和qPCR等检测方法,但是内源性逆转录病毒(endogenous retrovirus, ERVs)的存在可干扰结果的准确性。本研究通过生物信息学方法将ENTV-2与ERVs和绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus, JSRV)进行比对,寻找ENTV-2囊膜蛋白(envelope protein, env)基因的保守序列并设计1对特异性引物,通过优化反应条件而建立高分辨率熔解曲线(high resolution melting curve, HRM)检测方法。优化结果显示,最佳反应体系为：上下游引物各0.4 μmol/L,模板1 μL,styo9 (2.5 μmol/L) 1 μL,2×Premix Taq 10 μL,补充ddH₂O至终体积20 μL;反应条件为：94 ℃ 2 min;94 ℃ 15 s,59 ℃ 15 s,72 ℃ 15 s,40个循环;之后进行熔解曲线分析。构建env基因重组阳性质粒作为标准品,对HRM方法的特异性、敏感性和重复性进行检测。结果显示,所建立的HRM方法的特异性强,与ENTV-2高度同源的ERVs无交叉反应;敏感性高,对env基因重组阳性质粒的最低检测限为82.7拷贝/μL;重复性好,批内和批间重复性试验的变异系数均<1%。对92份临床样品的阳性检出率为18.7%,与TaqMan检测方法的符合率为100%。本研究可为山羊地方性鼻内肿瘤病毒病的早期、快速检测提供技术支持。

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea, PED)是一种由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的高度传染性、高致死率疾病,导致3~10日龄仔猪(Sus scrofa)严重腹泻,该病的防控主要依赖于母猪疫苗免疫后乳汁中和抗体的保护作用,而快速地、高通量检测中和抗体方法有利于该病的防控。本研究通过方阵滴定、ELISA反应条件筛选、敏感性试验、特异性试验、符合性试验和中和试验等,确定基于PEDV基因Ⅱ型S蛋白中和表位的间接ELISA反应条件：抗原最佳包被浓度为0.2 μg/孔,血清的最佳稀释度为1∶100,血清最佳作用时间30 min,二抗最佳稀释度为1∶6 000,二抗最佳作用时间为60 min,底物最佳作用时间为10 min。该ELISA方法与临床常见病原(猪瘟病毒, 伪狂犬病毒, 猪繁殖与呼吸综合征病毒)的特异性抗体无交叉反应,组间和组内试验具有较好重复性。该ELISA方法与中和试验的结果关联分析表明,其直接正相关公式为：Y=0.370 8X+1.377 2 (X为S/P值, Y为lg(1/中和效价-32), R²=0.963),相比中和试验的结果,本研究建立的ELISA方法敏感性为94.74%,特异性为91.67%,Kappa值为0.93。本研究建立的间接ELISA方法为临床PEDV中和抗体高通量检测和疫苗免疫效果评估提供了候选工具。