血凝素(hemagglutinin, HA)蛋白是禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)表面的一种糖蛋白,能诱导机体产生中和抗体,也是AIV主要的保护性抗原。已在水稻(Oryza sativa)胚乳中成功表达禽流感病毒H9N2 HA蛋白。为了建立水稻源禽流感病毒H9N2亚型HA蛋白的纯化方法,本研究分别采用两种方法进行HA蛋白的纯化。方法一：将HA蛋白水稻粉末按照质量与体积1∶5比例加入到提取液中,室温下搅拌,离心、取上清液,过滤后,首先经Q阴离子层析捕获到HA粗提蛋白,其次利用HA蛋白抗体亲和层析精细纯化HA蛋白,收集洗脱液,检测目的蛋白;方法二：用与方法一同样的方法获得HA粗提蛋白,根据Butyl疏水填料特性,HA粗提蛋白液中加入硫酸铵,搅拌、离心和过滤,进行第2步纯化,将收集到的洗脱液浓缩、换液,再经过SP阳离子层析纯化,收集洗脱液,获得HA蛋白。将两种方法纯化的HA蛋白经过SDS-PAGE和Western blot检测蛋白的纯度,并将HA蛋白送公司测序。结果表明,方法一：Q阴离子层析与HA免疫抗体亲和层析两种组合纯化HA蛋白的纯度约为90％左右。该组合纯化蛋白的方法相对简单,但需要培养和纯化单克隆抗体,此方法适合实验室快速小规模的蛋白纯化;方法二：Q阴离子层析、Butyl疏水层析和SP阳离子层析3种组合纯化的HA蛋白纯度达到90％左右。该方法适合建立HA蛋白的纯化工艺,用于大规模纯化HA蛋白。这两种方法获得的HA蛋白经测序与已知的氨基酸序列一致。本研究首次建立2种从水稻中获得高纯度重组H9N2亚型HA蛋白的方法,为今后制备禽流感H9N2亚型亚单位疫苗提供基础资料。

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)基因家族在马铃薯(Solanum tuberosum)生长发育和逆境胁迫响应中具有重要作用,但是马铃薯SOD基因家族成员的鉴定及其在块茎损伤后的变化鲜有报道。为分析SOD基因家族成员的生物信息学特性,研究各家族成员在马铃薯不同器官的表达差异以及在损伤块茎中的响应,本研究使用GSDS 2.0和PLACE分析StSOD基因结构和顺式作用元件,采用ProtParam、ProtComp 9.0、MEGA7.0、MEME4.11.1分析StSOD蛋白的理化性质、亚细胞定位、进化关系及保守基序,利用qRT-PCR技术检测各家族成员在不同组织中的表达差异及块茎损伤24 h内的表达变化,利用生化方法测定SOD抑制剂二乙基二硫代氨基甲酸钠(diethyldithiocarbamate, DDC)处理对损伤块茎SOD活性以及O₂^{• -}和H₂O₂含量的影响。结果表明,共鉴定出8个SOD基因家族成员,分别含有Cu/ZnSOD结构域、Fe/MnSOD α-发夹结构域和C末端Fe/MnSOD结构域。马铃薯SOD蛋白含152~312个氨基酸,等电点分布在5.28~7.13,亚细胞定位预测包括细胞质、叶绿体和线粒体。StSOD家族成员不均匀分布于12条染色体中的6条。8个SOD家族成员基于其保守结构域的不同分为Cu/ZnSOD、FeSOD和MnSOD亚家族。8个StSODs启动子上分布大量光、环境胁迫和激素响应元件。马铃薯根、茎、叶、芽和块茎中均有StSODs表达,其中StCSD1和StCSD2在块茎中的表达明显高于其他组织;块茎中StSODs均可被损伤诱导表达,StFSD1和StFSD2在损伤早期表达明显,StCSD3在损伤早期和晚期均上调表达,其他SOD成员均在损伤中期显著表达。DDC处理显著抑制损伤块茎的SOD活性、提高O₂^{• -}含量、抑制H₂O₂积累。本研究为深入开展StSOD基因家族在块茎损伤中的功能研究提供参考依据。

植物通过启动一系列信号转导途径来应对外部环境,这些途径通常涉及多种蛋白激酶,CBL特异性结合蛋白(CBL-interacting protein kinases, CIPKs)是其中的重要成员之一。本研究利用序列比对法在蓖麻(Ricinus communis)全基因组范围内进行CIPK基因家族鉴定;利用生物信息学手段对基因家族成员序列结构、理化性质、染色体定位、启动子顺式作用元件、蛋白保守结构域、系统进化关系以及聚类方式进行分析;利用RNA-seq与qRT-PCR对RcCIPKs在冷胁迫下的表达进行分析;利用qRT-PCR分析RcCIPKs的组织特异性表达模式与脱落酸(abscisic acid, ABA)激素诱导下的CIPK表达水平;并在烟草(Nicotiana tabacum)表皮细胞中实现RcCIPK16的亚细胞定位分析。结果显示,成功鉴定到18个RcCIPKs基因家族成员;基因分析发现RcCIPKs可分为外显子富集型与外显子贫乏型两类,定位于16个染色体片段上且呈不均匀分布;大多数RcCIPKs启动子区均含有MYB、MYC与ABA响应元件(ABA response element, ABRE)和乙烯响应元件(ethylene response element, ERE),暗示其响应激素诱导与逆境胁迫。大多数RcCIPK蛋白的基序类型与排布顺序基本相同,只有RcCIPK3与RcCIPK4存在不同程度的motif缺失;进化树分析将18个RcCIPKs基因聚为A、B、C、D、E 5类,推测不同类型的CIPK蛋白功能存在差异;RNA-Seq和qRT-PCR结果表明仅有RcCIPK1、RcCIPK12与RcCIPK16受冷胁迫诱导表达。该3个基因的组织特异性分析显示,RcCIPK1、RcCIPK12仅在叶与茎中表达,RcCIPK16仅在叶中表达;且3个基因的表达水平均受ABA激素诱导。亚细胞定位分析初步将RcCIPK16定位于细胞质中。本研究在蓖麻全基因组水平对CIPK基因家族进行鉴定,并分析了其冷胁迫下的表达水平,为进一步创制蓖麻抗冷新种质提供重要的候选基因。

花青素是使草莓(Fragaria × ananassa)果实着色的重要色素,FaMYB10是花青素合成调控的关键转录因子。为了明确FaMYB10等位基因的核苷酸多态性在烟草(Nicotiana benthamiana)花青素积累中的作用,本研究通过同源克隆的方法,从草莓果实中分离出FaMYB10的3个等位基因,从草莓红色品种'甜查理'中鉴别出等位基因FaMYB10a (GenBank No. MW478285)和FaMYB10b (GenBank No. MG456859),从白色品种'白雪公主'的果实中鉴定出等位基因FaMYB10c (GenBank No. MG456860)。序列分析表明,FaMYB10a和FaMYB10b的开放阅读框长702 bp,编码233个氨基酸,从起始密码子ATG开始在94 bp处存在1个核苷酸多态性位点,FaMYB10a为碱基A,FaMYB10b则为碱基C;FaMYB10c的开放阅读框长710 bp,从ATG开始在491 bp处有8个碱基插入,导致提前终止,编码179个氨基酸。FaMYB10c在开放阅读框中的碱基插入导致与其他2个等位基因在理化性质和蛋白结构上产生差异。利用瞬时转化技术将3个FaMYB10等位基因在烟草叶片中进行过表达,转FaMYB10a和FaMYB10b的叶片过表达区域出现花青素积累的现象,呈现红色表型;而转FaMYB10c的叶片过表达区域没有出现花青素积累的现象。以上结果说明等位基因FaMYB10a和FaMYB10b核苷酸多态性不影响花青素积累,而等位基因FaMYB10c的核苷酸多态性导致功能改变,最终烟草叶片不能积累花青素。该研究为其他重要基因的功能研究提供借鉴,对于植物性状差异和演化研究提供参考依据。

桃(Prunus persica)是我国重要的经济果树,对农业经济的发展具有重要作用。低温影响桃树生长发育,是桃早春生产的威胁之一。为探究亚热带地区桃树的低温适应及冷驯化机制,本研究对比分析了4 ℃ 48 h低温处理后桃树低需冷量种质'MX14-1'叶片转录表达谱的变化,差异表达基因的GO功能注释和KEGG通路功能富集分析显示,低温胁迫下桃树叶片差异表达基因主要与胁迫应答相关,富集于次生代谢物合成途径,涉及类黄酮、芪类、二苯基庚酮、姜酚和苯丙烷合成、亚油酸代谢等途径。利用qRT-PCR技术对类黄酮代谢相关基因进行分析,结果显示4 ℃ 48 h处理后,苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase, PAL)、肉桂酸4-羟酶(cinnamic acid 4-hydroxylase, C4H)、4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate: CoA ligase, 4CL)、查尔酮合酶 (chalcone synthase, CHS)、查尔酮异构酶(chalcone isomerase, CHI)、类黄酮-3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase, F3H)基因表达显著上调,和转录组测序结果一致。叶片代谢物含量测定表明,低温胁迫桃树叶片中类黄酮代谢相关的黄酮醇及衍生物含量显著增加。4 ℃ 48 h处理组和对照同时进行-2 ℃冷冻处理,结果表明经4 ℃低温处理桃树叶片中类黄酮物质总量和抗氧化能力显著提高,-2 ℃冷冻处理时损伤降低。本研究可为进一步探究桃树低温响应与抗寒的分子机制提供参考。

肌内脂肪是衡量牛肉品质的重要指标,肌内前脂肪细胞的分化对于大理石纹牛肉的形成至关重要。本研究旨在探究丙酸对肉牛(Bos taurus)肌内前脂肪细胞分化的影响,从细胞和分子水平解析肉牛肌内脂肪组织分化的信号机制。采用Ⅰ型胶原酶消化法分离获得牛肌内前脂肪细胞,设计不同剂量丙酸(1, 3和6 mmol/L)、胰岛素(10 µg/mL)和地塞米松(0.25 µmol/L)的不同组合分化培养基,诱导培养肉牛肌内前脂肪细胞6 d。细胞内脂肪含量测定和qRT-PCR技术分析表明,丙酸呈剂量依赖性地增加肌内前脂肪细胞胞质内脂肪含量(P<0.05),1、3和6 mmol/L的丙酸均显著升高了肌内前脂肪细胞中PPARγ、C/EBPα mRNA的表达水平(P<0.05)。在丙酸、胰岛素和地塞米松都加入培养基时,培养的细胞胞质内脂肪含量最高,细胞中PPARγ、C/EBPα mRNA的表达水平最高。然而,当分别去掉胰岛素和地塞米松后,培养的细胞胞质内脂肪含量分别下降77%、85%,细胞中PPARγ、C/EBPα mRNA的表达显著降低(P<0.05)。而且,当从分化培养基中去除丙酸时,培养的细胞胞质内脂肪含量也降低了68%,细胞中PPARγ、C/EBPα mRNA的表达水平也显著降低(P<0.05)。以上结果表明,丙酸刺激肉牛肌内前脂肪细胞的分化可能是通过发挥类似激素(如胰岛素或地塞米松)的第一信使功能,作为信号分子通过信号转导机制达到刺激肌内前脂肪细胞的分化。本研究为阐明肉牛肌内脂肪的沉积机制,实现营养调控模式生产高档牛肉提供基础资料。

褪黑素受体1A (melatonin receptor 1A, MTNR1A)是影响绵羊(Ovis aries)季节性繁殖和产羔数的重要基因。为研究MTNR1A基因与多胎萨福克羊和中国美利奴羊(新疆军垦型)产羔性状的相关性,利用PCR、测序和 限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)技术检测MTNR1A基因外显子2在2个绵羊群体中的基因多态性,通过连锁不平衡分析构建单倍型,应用基因关联分析探究MTNR1A基因多态性及单倍型与绵羊产羔性状的关联性。结果表明,2个绵羊品种中MTNR1A基因外显子2区域存在SNP1 (G735A)、SNP2 (G753A)和SNP3 (C845A),3个SNPs中SNP1和SNP2为同义突变,SNP3为错义突变,导致第282位的丙氨酸突变为天冬氨酸(A282D),且均存在3种基因型,符合哈代温伯格平衡检验,并表现为中度多态。相关性分析显示,SNP1和SNP2位点均与绵羊产羔性状极显著相关(P<0.01),GG基因型个体产羔数均极显著高于AG基因型与AA基因型个体(P<0.01);SNP3位点与绵羊产羔数显著相关(P<0.05),CC基因型个体产羔数显著高于AA基因型个体(P<0.05);MTNR1A基因存在4种单倍型,不同单倍型极显著影响绵羊产羔数(P<0.01),单倍型H1 (GGC)与绵羊高产羔数极显著相关(P<0.01)。研究结果表明,MTNR1A基因与多胎萨福克羊和中国美利奴羊(新疆军垦型)产羔性状密切相关,MTNR1A基因H1是绵羊高产羔数的主要单倍型,SNP1、SNP2和SNP3位点可以作为绵羊高繁殖力的分子标记用于标记辅助选择育种。

瘦素受体(leptin receptor, LEPR)是Ⅰ型细胞因子受体超家族的成员,在哺乳动物的采食、能量平衡和繁殖中起关键作用。溆浦鹅(Anser cygnoides)是湖南省优良的地方鹅品种,其肥肝性能优异,具有较高的营养价值。为了探究LEPR基因在溆浦鹅不同组织中的表达特性,本研究采用RT-PCR方法克隆了溆浦鹅LEPR基因(GenBank No. MK055330)全编码序列,并运用生物软件对LEPR蛋白空间结构进行分析。同时采用实时荧光定量PCR对LEPR基因在溆浦鹅不同组织中的表达模式以及LEPR基因在脂肪组织中表达量与肝重、肝体比和血液生化指标的相关性进行了初步研究。结果表明：溆浦鹅LEPR基因CDS区长度为3 468 bp,编码1 155个氨基酸,与其他禽类动物LEPR基因具有较高同源性;系统进化分析发现,溆浦鹅与浙东白鹅(Zhedong white goose)的亲缘关系最近,其次是鸭(Anas platyrhynchos)和鸡(Gallus gallus),与哺乳动物的亲缘关系较远。LEPR基因在溆浦鹅8个组织中均有表达,表达量由高到低依次为睾丸、脾脏、皮脂、肝脏、腹脂、心脏、腿肌、胸肌。LEPR基因在脂肪组织中的表达量与肝重和谷草转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)含量呈显著负相关。本研究可为肝用型鹅的分子遗传研究提供候选基因,为LEPR基因的生物学功能研究提供基础资料。

鱼类遗传多样性与其环境适应能力和遗传进化潜能密切相关。为了了解我国华南地区稻田养殖鲤不同地理群体的遗传背景,通过PCR扩增细胞色素氧化酶Ⅰ (cytochrome oxidase subunit Ⅰ, COⅠ)-线粒体控制区(displacement loop region, D-loop)-内转录间隔区(internal transcribed spacer 1, ITS1)串联序列和序列比对,分析了4个鲤(Cyprinus carpio)群体(广东连南(LN), 广东乳源(RY), 广西金边鲤(JB), 广西三江(SJ))的遗传多样性和遗传结构。结果表明：COⅠ-D-loop-ITS1串联序列长度为1 842 bp,共检测到71个变异位点(包括28个单变异位点和43个简约信息位点)和33种单倍型,JB和RY群体的单倍型较多(各为11种),各群体间无共享单倍型。LN群体的单倍型多样性(haplotype diversity, Hd)最高(0.824),JB群体的核苷酸多样性(nucleotide diversity, Pi)最大(0.002 78),SJ群体的单倍型多样性和核苷酸多样性均为最低(Hd=0.662; Pi=0.000 56)。遗传差异分析结果表明,SJ与JB群体之间的遗传距离最小(0.004 6),LN与RY群体之间的遗传距离最大(0.008 7),各群体间遗传分化显著(FST (F-statistics)>0.25, P<0.01)。分子方差分析(analysis of molecular variance, AMOVA)结果表明,群体间变异占总变异的70.65%。个体系统进化树表明COⅠ-D-loop-ITS1序列能够将4个鲤鱼群体的个体完全区分开,优于单个基因的聚类效果。种群系统进化树中SJ与JB群体先聚为一小支,再与RY群体聚为一大支,而LN群体独立聚为一支。综上所述,4个稻田养殖鲤群体单倍型多样性较高,核苷酸多样性较低,群体间分化显著,应作为4个进化显著单元分别进行种质资源保护与利用。本研究揭示了我国华南地区4个稻田养殖鲤鱼群体的遗传结构和亲缘关系,丰富了稻田鲤鱼种群种质资源的基础资料,可为其种质保存、开发与利用奠定理论基础。

光照对鱼类的摄食、生长、应激、生殖及内分泌等生理活动起着重要的调控作用。为探究罗非鱼(Oreochromis niloticus)生长适宜的光质环境并揭示光质对其生长影响的机制,本研究以吉富罗非鱼为实验对象(49.2±3.2) g,设置5种LED光质处理组(红光, 黄光, 蓝光, 绿光, 白光)和1个黑暗组,并测定了各组罗非鱼的体成分、生长性能、胃消化酶活力和血液免疫酶活力以及皮质醇水平。结果显示：(1)黄光组罗非鱼摄食率(feeding rate, FR)最高、生长最快,增重率(weight gain rate, WGR)和特定生长率(specific growth rate, SGR)显著高于蓝、绿、白光组及黑暗组(P<0.05),且饵料系数(feed conversion ratio, FCR)显著低于上述4组(P<0.05),与红光组间无显著差异;绿光和黑暗条件下罗非鱼FR、WGR及SGR最低;(2)黄光组鱼体粗脂肪含量显著高于除蓝光外的其他实验组(P<0.05),水分含量显著低于绿光、白光组和黑暗组(P<0.05);(3)红光组胃组织蛋白酶(protease, PES)和淀粉酶(α-amylase, α-AMS)活力均显著高于其他光质处理组(P<0.05);(4)绿光组血浆皮质醇(cortisol, COR)浓度和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)活力显著高于其他光质处理组(P<0.05);黄光组血清溶菌酶(lysozyme, LZM)活力显著高于其他5组(P<0.05)。上述结果表明,红、黄光促进吉富罗非鱼生长,绿光对其形成胁迫而不利于生长。本研究对生产中提高养殖罗非鱼的福利水平和生产效率具有重要意义,为罗非鱼工厂化养殖的光质环境调控提供了理论依据。

肠道和环境菌群对水生动物的健康有至关重要的作用。为探究全人工养殖模式下三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)养殖过程中直肠和养殖水体细菌群落的变化,本研究选用两种微藻：旋转单针藻(Monora phidiumcontortum)和小环藻(Cyclotella sp.),分别投喂三角帆蚌,在第0、7、14和28 d测定水体pH、氨氮(NH₄⁺-N)、亚硝酸盐氮(NO₂^--N)、硝酸盐氮(NO₃^--N)和总磷(total phosphorus, TP)等理化指标,测定三角帆蚌养殖水体和肠道菌群的16S rRNA,探讨两种微藻投喂和养殖时间对三角帆蚌养殖水体和肠道菌群结构和功能的影响。结果显示：21个水体样本和21个直肠样本共检测出44个菌门和1 171个菌属。在门水平上,三角帆蚌养殖水体和肠道菌群组成相似,都含有放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和疣微菌门(Verrucomicrobia),但水体和肠道菌群在丰度上差异明显。在属水平上,水体和肠道菌群组成明显不同,仅有2个优势属相同,为变形菌门的多核杆菌属(Polynucleobacter)和Reyranella属。冗余分析(redundancy analysis, RDA)结果显示,pH和NO₂^--N分别是对水体和肠道菌群影响最大的水化指标。KEGG功能预测发现,水体和肠道菌群的功能聚类区分明显,但均主要与能量生产和生物合成相关。主坐标分析(principal co-ordinates analysis, PCoA)和非参数多元方差分析(permutational multivariate analysis of variance, PERMANOVA)结果表明,旋转单针藻和小环藻作为饵料对养殖三角帆蚌肠道菌群无显著影响,对水体菌群也无显著影响;养殖水体菌群在养殖过程中的各时间点菌群差异显著(P<0.05);肠道菌群在养殖过程中相对稳定。本研究表明,两种微藻对三角帆蚌养殖水体和肠道菌群的结构和功能没有显著影响,但水化指标对菌群有重要影响,该结果为进一步优化工厂集约化养殖模式提供理论基础。

美国白蛾(Hyphantria cunea)是一种重要的世界性检疫害虫,也是我国重大入侵害虫之一。苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)作为目前研究应用最广泛的杀虫微生物之一,对美国白蛾的作用机制尚不清楚。为了明确美国白蛾中肠受体碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)与Bt Cry毒素的结合特性,探索Bt Cry毒素对其作用机理,本研究利用PCR方法扩增获得美国白蛾中肠碱性磷酸酶HcALP3基因(GenBank No. MH796759),该基因的开放阅读框1 557 bp,编码518个氨基酸。构建原核重组表达载体pET30a-HcALP3,转化大肠杆菌(Escherichia coli) BL21,经IPTG诱导表达56.65 kD的HcALP3蛋白。qRT-PCR方法进行组织和龄期表达分析,结果显示HcALP3在美国白蛾的各龄期均有表达,5龄幼虫表达量最高,在不同组织中,中肠的表达量最高;Ligand blot分析结果发现HcALP3重组蛋白仅可以与Bt Cry1Ab35活化毒素特异结合,不与Bt Cry1Ac和Cry9Ea10结合。利用RNAi技术沉默HcALP3基因,HcALP3表达水平下降了75.32%;注射dsRNA-HcALP3后的美国白蛾幼虫对Bt Cry1Ab35、Cry1Ac和Cry9Ea10的校正死亡率分别为45.93%、73.33%和70%,对Bt Cry1Ab35的敏感性显著低于注射dsRNA-egfp的美国白蛾幼虫,推测HcALP3蛋白为Bt Cry1Ab35毒素的潜在功能受体。本研究通过对美国白蛾碱性磷酸酶HcALP3的鉴定及功能验证,为深入探讨Bt制剂防治美国白蛾的机制提供了科学依据。

花椒窄吉丁(Agrilus zanthoxylumi)是花椒(Zanthoxylum bungeanum)树的专一性蛀干害虫,为了分析其与寄主花椒挥发物的结合模式及能力,本研究基于花椒窄吉丁转录组数据,利用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)对花椒窄吉丁气味结合蛋白(odorant binding protein, OBP)基因AzanOBP4进行全长克隆;采用生物信息学软件预测分析其核酸序列及氨基酸序列;通过qRT-PCR检测AzanOBP4基因在成虫不同组织中(头, 胸, 腹, 足和翅)的表达情况;I-TASSER在线软件对AzanOBP4氨基酸序列三维建模,通过SAVES v6.0以及PROSA软件评价模型,应用AutoDock软件对AzanOBP4蛋白模型和14种寄主挥发物进行分子对接分析。AzanOBP4的cDNA全长序列为691 bp (GenBank No. MT318833),5'端非编码区182 bp,3'端非编码区89 bp,开放阅读框(ORF)为423 bp,编码140个氨基酸,含有6个保守半胱氨酸,属于典型的OBP。序列分析表明,AzanOBP4氨基酸序列与苹果小吉丁(Agrilus mali)的AmalOBP3氨基酸序列一致性最高为83.57%,两者在系统发育树中以99%的置信度聚为一支。AzanOBP4在雌雄成虫的不同组织中均有表达,其中在雌性成虫的足部表达量最高。分子对接显示,AzanOBP4与14种寄主挥发物主要以氢键、疏水作用和范德华力相结合,发现4种环状烯类寄主挥发物(葎草烯, β-石竹烯, 荜澄茄油烯和ç-依兰油烯)与AzanOBP4的结合能力较好。研究表明花椒窄吉丁基因AzanOBP4参与识别寄主植物的嗅觉机制,推测AzanOBP4可能在花椒窄吉丁寻找寄主与取食行为中发挥重要作用。本研究为揭示花椒窄吉丁的嗅觉识别机制提供参考依据。

水生植物满江红(Azolla)是蕨类、蓝藻(Cyanobacterium)和细菌的共生体。在满江红营养生长期,共生藻和内生菌共生于宿主的叶腔中。在满江红孢子果形成期,共生藻会移居到满江红的孢子果内。本研究借助超薄切片、荧光原位杂交和免疫金标记技术,通过荧光显微镜和电子显微镜观察,以揭示内生菌在满江红结孢期间的菌体形态特征和细胞响应。结果表明,内生菌伴随共生藻进入发育中的大孢子果并最终被定位在大孢子果顶端区域内。大约43%进入果腔的内生菌分泌胞外泡囊,有的还释放出DNA和多糖类似物等,25%的内生菌形成荚膜,17%的内生菌细胞质中累积了聚β羟基丁酸颗粒,9%的细菌呈现类似自噬性或坏死性的细胞死亡。大孢子果完全成熟时大部分的细菌栖身在类似生物被膜的基质中。本研究阐明了内生菌在宿主有性繁殖阶段形态结构特征和细胞响应,进而保持与宿主同步发育的节奏,以过渡到新的共生世代。这将为人工构建作物-微生物共生固氮体系提供新的思路。

筛选木质素降解菌并研究其降解性质,可实现木质纤维素的高效利用,为化工业提供高附加值的原料、缓解原料短缺矛盾及获得性状优良、实用价值高的木质素降解菌,本研究采用加热富集、苯胺蓝平板脱色法及酶活力测定,从肉牛(Bos taurus)新鲜粪便中筛选到1株对苯胺蓝有明显脱色效果、且能同时氧化Mn²⁺和藜芦醇的产芽胞菌株MN-13。经形态观察、生理生化特性测定以及16S rDNA和DNA促旋酶B亚基(gyrB)基因序列分析,菌株MN-13被鉴定为解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)(GenBank No. KP292553)。通过木质素降解特性研究发现：该菌株能高效降解玉米秸秆中的木质素,发酵24 d后对木质素的降解率达44.8%,对中性洗涤纤维降解率为29.0%;菌株在秸秆发酵过程中能产生活性与木质素过氧化物酶(lignin peroxidase, LiP)和锰过氧化物酶(manganese peroxidase, MnP)类似的酶,且酶活力最高值与秸秆木质素最大降解幅度相对应。秸秆降解产物的气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)分析结果表明：菌株MN-13能通过断裂β-O-4键、氧化Cα和Cγ及断裂Cα-Cβ和Cβ-Cγ键将木质素降解为以H、G和S型酚类为主的小分子芳香族化合物。本研究不仅丰富了木质素降解的微生物菌种资源,同时为芽胞杆菌在木质素降解中的应用提供了理论依据。

生长分化因子8 (growth differentiation factor 8, GDF8)基因是转化生长因子β (transforming growth factor-β, TGF-β)超家族的成员之一,除了作为肌肉生长负调节剂外,还在脂质代谢、糖代谢等多种生物学过程中发挥功能,目前对其在生殖系统中的作用研究日渐增多。研究发现,GDF8及其受体在子宫、卵巢、输卵管、胚胎等组织中均有表达并发挥重要的生理作用,包括参与卵泡发育和排卵,调控卵泡类固醇激素的合成,影响细胞外基质的形成以及颗粒细胞的增殖、分化和扩散,与妊娠结果密切相关等。本文将结合国内外文献资料,综述GDF8在生殖系统中的研究进展,以期为后续研究提供参考。

免疫分析测定妊娠相关糖蛋白(pregnancy-associated glycoproteins, PAGs)是目前常用的家畜早期妊娠检测方法,但是抗体作为识别分子存在制备周期长、成本高等缺点。为丰富奶牛(Bos taurus)早期妊娠诊断技术,降低检测成本,本研究以牛(bovine)妊娠相关糖蛋白(bPAG)的核酸适配体为识别分子,基于双适配体夹心原理,建立了一种bPAG的可视化检测方法,并对适配体浓度、适配体-辣根过氧化物酶浓度、封闭剂浓度、反应时间、包被缓冲液等条件进行了优化。结果显示,在优化条件下,bPAG9在0.5~100 ng/mL浓度范围内呈良好线性(R=0.998),检测限为0.22 ng/mL,目测可视化检测限0.5 ng/mL。采用3个梯度浓度(1, 10, 100 ng/mL)的bPAG9做空白样品添加实验,平均加标回收率为93.2%~105.8%,相对标准偏差为 3.51%~7.13%。将建立的方法应用于人工授精30 d后的奶牛血清检测,并采用超声波检测法进行对比验证,本方法妊娠诊断准确率达到91.7%。本研究为奶牛早期妊娠诊断提供一种简便、经济、可靠的快速检测新技术。

立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)是马铃薯(Solanum tuberosum)黑痣病的病原菌,严重威胁着马铃薯产业的发展。立枯丝核菌在土壤中主要以菌核结构作为初侵染源进行潜伏休眠,其密度与马铃薯黑痣病的发病程度呈正相关。为快速准确地检测土壤中立枯丝核菌和菌核的密度,本研究基于立枯丝核菌融合群3 (anastomosis group 3, AG3)的翻译延长因子(translation elongation factor, TEF)保守区域,设计特异性引物TEF3/TEF7,以191-bp扩增产物的重组质粒为标准品,构建实时荧光定量PCR (real-time quantitative PCR, qPCR)检测体系,其灵敏度(19.5 fg/µL)为普通PCR 1 000倍。采用普通PCR和qPCR方法,对4个地区的疑似马铃薯黑痣病薯(18份)和病土(41份)的DNA进行检测,2种检测方法对马铃薯黑痣病薯的检出率均为100%;普通PCR对病土的检出率为65.85%,qPCR对病土的检出率为97.56%。为明确田间早期病土检测的带菌量,人工模拟不同带菌核量的土壤,结合水筛法进行qPCR检测,建立循环域值(cycle threshold, Ct)与土壤中菌核含量的曲线关系,回归方程为y=-3.982x+12.687,相关系数R²为0.986,呈良好线性关系;人工模拟带菌量检测下限为每克土5×10^-6 g。本研究建立的检测体系能够快速、准确地检测土壤中立枯丝核菌AG3的菌核密度。在种植前对大田土壤中立枯丝核菌含量进行定量检测,可为马铃薯黑痣病的早期预警提供技术支持。

剑麻紫色卷叶病是近年来剑麻(Agave sisalana)上发生的一种毁灭性病害。本课题组前期研究表明,该病与植原体高度相关。建立一种高效的分子检测技术对于植原体的深入研究及病害监测与检测非常必要。本研究拟建立剑麻紫色卷叶病相关植原体的高效单管巢式PCR检测技术。首先对单管巢式PCR反应体系的内外引物退火温度进行单因素试验;确定退火温度后,利用正交设计的方法对单管巢式PCR反应体系的内外引物浓度、dNTPs浓度和Ex Taq酶用量等关键因素进行优化。结果显示,当外引物Sis-F1/R1退火温度为64 ℃、内引物Sis-F2/R2退火温度为54 ℃,通过正交设计试验最终筛选出的最佳反应体系(25 μL)为：10×Ex Taq Buffer 2.5 μL,2.5 mmol/L dNTPs 5 μL,Ex Taq DNA Polymerase 1 μL,15 μmol/L的内引物Sis-F2/R2各 1 μL,0.02 μmol/L的外引物Sis-F1/R1各1 μL,模板 DNA 1 μL,ddH₂O 11.5 μL。上述反应体系只对紫色卷叶病植株DNA模板扩增出条带,具有高度特异性;最低检测限为植原体质粒浓度≥1 fg/μL。本研究所建立的剑麻紫色卷叶病相关植原体单管巢式PCR检测体系为后续病害监测、相关性调查、致病性以及功能验证等方面的研究提供技术支持。

茎基腐病是在世界上多数小麦(Triticum aestivum)种植区广泛发生的重要土传病害,假禾谷镰孢菌(Fusarium pseudograminearum)是该病的优势病原菌。假禾谷镰孢菌巨型双链RNA病毒1 (Fusarium pseudograminearum megabirnavirus 1, FpgMBV1)是在假禾谷镰孢菌菌株FC136-2A中发现的真菌病毒,使该菌株在小麦上的致病力显著降低,即具有弱毒作用。为了研究FpgMBV1的弱毒作用机制,本研究利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的遗传转化技术将pCAM-GFP-hyg导入FC136-2A菌株,并对转化子FC136-2A-GFP进行分子检测、荧光观察、生物学鉴定和致病力测定。结果表明,带有绿色荧光标记的转化子FC136-2A-GFP与FC136-2A在生长速率、产孢量和对小麦的致病力等生物学性状上差异不显著,且转化子FC136-2A-GFP仍然带有FpgMBV1。本研究获得带有GFP标记的假禾谷镰孢菌转化子FC136-2A-GFP,可用于观察弱毒菌株FC136-2A在小麦上的侵染和致病过程,为深入开展真菌病毒FpgMBV1对假禾谷镰孢菌的弱毒作用机制研究提供基础资料。