硫氧还蛋白(thioredoxin, TRX)是一类具有二硫化物活性中心的功能多样化蛋白质,在植物抗逆等方面具有重要作用。核氧还蛋白(nucleoredoxin, NRX)是TRX超家族的新成员,在小麦(Triticum aestivum)中的研究发现其与抗旱性相关,但是抗旱性机制尚不明确。因此,探究小麦核氧还蛋白TaNRX1的互作蛋白,有助于深入揭示TaNRX1的作用机制。根据前人研究和生物信息学分析,本研究预测得到3个TaNRX1-D的候选互作蛋白：蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase, PDI)、h型硫氧还蛋白(TRX-h)和蛋白磷酸酶2A催化亚基(protein phosphatase 2A catalytic subunit, PP2Ac),并从干旱耐受型小麦品种'晋麦47'中分别克隆得到TaPDI-A、TaPDI-B、TaPDI-D、TaTRX-h-A、TaPP2Ac-B和TaPP2Ac-D的ORF序列。进一步利用酵母双杂交(yeast two-hybrid, Y2H)和双分子荧光互补技术(bimolecular fluorescence complementation, BiFC)对互作蛋白进行验证,结果表明,3个蛋白质与TaNRX1-D均存在互作关系,互作部位主要为细胞核和细胞膜。构建酵母(Saccharomyces cerevisiae) pYES2过表达载体进行甘露醇模拟干旱胁迫实验,结果表明,TaPDI、TaTRX-h和TaPP2Ac对甘露醇胁迫均具有正向调控作用。本研究结果可为深入揭示TaNRX1-D抗旱机制提供参考依据。

c型溶菌酶是鱼类在先天性免疫机制中抵抗细菌感染的关键性免疫蛋白。鲤鱼(Cyprinus carpio) c型溶菌酶具有鱼类c型溶菌酶的基本特征：N端含有信号肽;C端成熟肽中的Glu35和Asp51构成酶的活性位点,并含有8个保守的半胱氨酸残基。本研究通过反转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR)获得鲤鱼c型溶菌酶成熟肽的cDNA,该序列全长381 bp,编码由127个氨基酸残基组成的成熟肽;通过PCR在其5'端添加限制性内切酶XhoⅠ位点和6×His标签、3'端添加XbaⅠ位点;获得的目的基因,即鲤鱼c型溶菌酶基因(common carp c-type lysozyme, CLYc),与表达载体pPICZαA连接后电转至毕赤酵母(Pichia pastoris) X-33,通过高浓度博来霉素筛选高拷贝酵母转化子;在29 ℃、250 r/min条件下,使用1.5%甲醇诱导表达120 h,表达上清液经固化金属离子亲和层析(immobilized metal affinity chromatography, IMAC)纯化,获得分子量为15.4 kD的重组蛋白,表达量约为40 mg/L;Western blot分析和MALDI-TOF/TOF质谱鉴定表明该重组蛋白为预期的目的重组蛋白CLYc。抑菌试验证明,含重组CLYc的培养上清液对革兰氏阳性的单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)以及革兰氏阴性的大肠杆菌(Escherichia coli)和副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)具有明显的抑菌活性;纯化的重组CLYc对单增李斯特菌、枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）、大肠杆菌和副溶血性弧菌显示了相同的最小抑菌浓度。本研究结果为鱼类来源的天然抗菌剂的开发和生产提供了技术途径。

枇杷(Eriobotrya japonica)细胞悬浮培养可以产生丰富的五环三萜类化合物。香树素合成酶(amyrine synthase, AS)是三萜合成途径中的关键酶,决定主要代谢和次生代谢的分支点。枇杷AS基因的功能未见报道。本研究以AS基因过表达质粒(pDONR207-AS)为模板,经PCR扩增获得AS基因的正向开放阅读框,经酶切及与载体的连接,成功构建表达载体pBWA(V)HS-AS-GFP-Tnos。以枇杷悬浮细胞(AS分离的同源系统)为受体材料,在农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) GV3101的介导下进行瞬时表达,通过共转化的GFP在激光共聚焦显微镜下成像,分析AS蛋白的亚细胞定位;采用气相色谱-质谱联合分析AS催化产物。研究结果显示,AS在枇杷悬浮细胞中定位于内质网;枇杷悬浮细胞中AS的催化产物含α-香树素和β-香树素,AS属于多功能酶。本研究可为明确五环三萜类化合物合成途径以及枇杷悬浮细胞的转基因应用提供参考依据。

赤霉素受体(gibberellin insentive dwarf 1, GID1)是赤霉素(gibberellin, GA)信号转导途径的重要元件,直接影响着赤霉素对植物的作用效果。以山药(Dioscorea opposita)品种'牛尾山药'珠芽的表皮为料材,采用反转录PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术克隆山药的赤霉素受体基因GID1的cDNA全长,用qRT-PCR检测山药GID1基因在山药珠芽采后不同时期的表达量,及其对多效唑处理的响应。结果显示,克隆得到的山药赤霉素受体基因GID1的cDNA全长1 123 bp,开放阅读框996 bp,编码331个氨基酸,命名为DoGID1A (GenBank No. MK268684)。生物信息学分析显示,DoGID1A蛋白质分子量为3.72×10⁴ D,理论等电点为8.25,为不稳定蛋白,此蛋白无跨膜结构和信号肽,有典型的自水解酶(abhydrolase)活性区域(93~304 aa)。蛋白质同源性分析表明,DoGID1A蛋白与小果野芭蕉(Musa acuminata)等13种植物的GID1蛋白整体同源性达73.56%,有多个高度保守的区域,具有与DELLA和GA结合的活性区域。系统进化分析显示,山药和水稻(Oryza sativa)的GID1蛋白与其他植物进化关系远,这两种植物的GID1蛋白各自为一类,其他植物则是单子叶植物聚于一类,双子叶植物聚于另一类。qRT-PCR分析显示,山药珠芽发芽期DoGID1A表达量升高,多效唑处理使该基因表达量上调。预测该基因与山药珠芽休眠解除及发芽有关,本研究结果为进一步研究该基因的表达规律和功能提供了基础资料。

菰孕茭是菰黑粉菌(Ustilago esculenta)侵染菰(Zizania latifolia)植株,诱导茎部膨大发育的结果,但其膨大发育的调节机制尚不清楚。本研究克隆获得菰GH3-8 (Gretchen Hagen 3-8)基因的全长序列,其基因序列全长为1 915 bp,含有2个内含子。cDNA全长为1 173 bp,编码390个氨基酸(GenBank No. MH355951),具有1个GH3结构域及1个吲哚乙酸酰胺合成酶结构域,与粳稻(Oryza sativa ssp. japonica) OsGH3-8 (GenBank No. XP_015647797.1)相似度较高。孕茭植株中ZlGH3-8表达变化与菰黑粉菌菌丝侵染增殖相关,茎部ZlGH3-8表达量显著高于叶片(P<0.05);茎部膨大初期灰茭ZlGH3-8表达量显著高于正常茭,而雄茭表达量最少(P<0.05)。进一步分析发现,正常茭茎部膨大发育期间ZlGH3-8表达量存在显著差异,表明ZlGH3-8可能参与了菰茎部形态发育,可能与孕茭期间植株对菰黑粉菌侵染相关的免疫防御反应下调相关。本研究初步阐明了ZlGH3-8在菰发育过程中的表达响应,为菰茎部膨大发育机制研究提供了基础资料。

v-myb禽成髓细胞瘤病毒致癌基因同源物(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog, MYB)转录因子家族在调控植物生殖及生长发育过程中发挥着重要的作用,本研究在转录水平上鉴定出亚洲百合品种'小小的吻' (Lilium Asiatic hybrids 'Little Kiss') MYB转录因子家族成员并对其进行生物信息学分析,旨在筛选出调控花粉败育的基因,为亚洲百合MYB的功能研究提供基础资料。基于百合转录组数据,利用Pfam31.0和BLASTP等软件对百合MYB蛋白序列进行筛选与鉴定,使用MEGA 7.0、Web Logo 3.0等生物信息学软件,重点对占比最多的R2R3-MYB类转录因子进行保守结构域和系统进化树分析,并用Mev软件对LaMYB基因在小孢子减数分裂时期和单核花粉粒时期的表达水平进行分析。共筛选出69个LaMYB基因,包含50个R2R3-MYB类基因,15个1R-MYB类基因和4个3R-MYB类基因,所有LaMYB蛋白均为亲水性不稳定蛋白;亚细胞定位预测结果表明LaMYB基因编码的蛋白均定位于细胞核;Web logo3.0分析发现R2R3-MYB类蛋白结构域比较保守,但其C-端转录激活域的易变性使其具有功能多样性;系统进化分析将百合R2R3-MYB类蛋白划分为22个亚家族,其中参与花粉败育的拟南芥同源基因主要属于S18、S23、S21和S22亚家族;同时,RNA-Seq数据分析结果表明,和花粉发育的正常时期(减数分裂时期）相比,在花粉败育的关键时期(单核花粉粒时期),69个LaMYB基因中有42个的表达量呈现上调趋势,仅27个基因的表达量呈现下调趋势;qRT-PCR分析结果表明6个候选基因在百合花粉正常时期(减数分裂时期)和败育时期(单核花粉粒时期)的表达量有显著差异。该研究结果表明LaMYB基因在花粉败育过程中发挥重要的调控作用。此研究为深入探究LaMYB基因在花粉败育过程中发挥的功能提供基础资料。

彩叶香樟(Cinnamomum camphora)是人工选育的香樟新品种,具有很高的观赏与经济价值,探索彩叶香樟特殊叶色形成的生理生化机制对香樟观赏新品种选育具有重要意义。为研究彩叶香樟特殊叶色的形成机制,以彩叶香樟新品种'涌金'(C. camphora 'Yongjin')和野生香樟为实验材料,比较两种香樟的叶片颜色变化、叶绿素、类胡萝卜素与花青素含量以及光合特性,同时利用qRT-PCR技术检测15个叶绿素合成相关基因在二者间的表达差异。结果表明,4月'涌金'的叶片颜色与野生香樟明显不同,测定期间'涌金'的叶色值呈上升趋势,4月10日时最小,为2.757,4月21日时最大,为8.163,且皆显著低于野生香樟(P<0.05)。4月10日'涌金'叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量与野生香樟的差异最大,仅为后者的24.9%、42.2%和29.7%。虽然两种香樟的叶绿素含量在各测定时间点均存在极显著差异(P<0.01),但二者的类胡萝卜素和花青素含量差异均未达到显著水平。'涌金'的光响应变化趋势与野生香樟相似,其最大净光合速率为7.44 μmol/(m² ·s),光饱和点为396.7 μmol/(m² ·s),均显著低于野生香樟(P<0.05)。两种香樟间叶绿素合成相关基因的表达模式存在较大差异,尤其在4月10日差异最大,二者共有11个基因的表达量存在显著差异(P<0.05),其中'涌金'谷酰胺-tRNA还原酶基因(C. camphora glutamy l-tRNA reductase, CcHEMA)与尿卟啉原Ⅲ合成酶基因(C. camphora uroporphyrinogen Ⅲ synthetase, CcHEMD)表达量仅为对照的38.7%和31.7%;'涌金' CcHEMD、粪卟啉原Ⅲ氧化酶基因(C. camphora coproporphyrinogen Ⅲ oxidase, CcHEMF)在测定期间的表达量均显著低于野生香樟(P<0.05),与低叶绿素含量的表型相符。综上认为,'涌金'在春季叶绿素相对含量低是其特殊叶色形成的直接原因,这与其HEMA、Mg-螯合酶H亚基(magnesium chelatase H subunit, CHLH)、CHLI、CHLD、HEMD和HEMF等编码基因呈现相对低的表达量有关。本研究结果为后续深入解析彩叶香樟特殊叶色形成的机制和选育香樟观赏新品种提供理论依据。

脂肪酸去饱和酶2 (fatty acid desaturation 2, FADS2)作为多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFAs)如花生四烯酸(arachidonic acid, AA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)等合成过程中的限速酶,可在脂肪酸链的第6、7位将其底物脱氢形成双键。本研究以原代奶山羊(Capra hircus)乳腺上皮细胞(goats mammary epithelial cells, GMECs)为材料,利用PCR及siRNA介导的干扰技术研究奶山羊FADS2的生物学特性及功能。本实验克隆得到FADS2基因(GenBank No. MK292654)的CDS区为1 335 bp,编码444个氨基酸,与绵羊(Ovis aries, XM_015103138.2)和牛(Bos taurus, NM_001083444.1)具有高度同源性;利用siRNA介导的干扰技术,在GMECs中转染si-FADS2时,FADS2自身mRNA水平下调60%~70% (P<0.01),同时蛋白水平下降15%~18% (P<0.05);干扰FADS2,显著上调与多不饱和脂肪酸合成相关的基因超长链脂肪酸延伸酶2基因(elongase of very long chain fatty acids 2, ELOVL2)、ELOVL6 (P<0.01)和脂肪酸去饱和酶1基因（fatty acid desaturation 1, FADS1) (P<0.05)表达;同时促进转录因子固醇调节元件结合蛋白1a基因(sterol regulatory element-binding transcription protein, SREBP1a) (P<0.01)、从头合成相关基因脂肪酸合酶基因(fatty acid synthase, FASA)和乙酰辅酶A羧化酶基因(acetyl-CoA carboxylase, ACACA)及硬脂酰辅酶A去饱和酶1基因(stearoyl-CoA desaturase1, SCD1)的表达(P<0.05);干扰FADS2,显著降低细胞中AA及DHA比例(P<0.05),导致细胞中PUFAs含量降低;并且抑制二酰基甘油转移酶基因1 (diacylglycerol acyltransferase 1, DGAT1)(P<0.01)及DGAT2 (P<0.05)表达,降低细胞中甘油三酯(triacylglyceride, TAG) (P<0.05)含量。因此,FADS2具有调控奶山羊乳腺PUFAs合成及甘油三酯代谢的重要功能。本研究为羊奶PUFAs代谢研究提供了实验依据。

骨形态发生蛋白2 (bone morphogenetic protein 2, BMP2)能够起始、促进和维持骨的再生。BMP2在促进脂肪形成也有着重要作用,与绵羊(Ovis aries)尾型的形成相关。本实验选择BMP2做候选基因,寻找与尾性状相关的位点和可用的分子标记。在533只绵羊实验群体中,选取藏羊、湖羊两个品种各30个个体的血液样本,等量混合分别构建两个DNA混池,对BMP2基因的外显子及其上、下游1 000 bp进行扩增,针对筛选到的突变位点进行飞行质谱基因分型,利用Haploview4.1软件进一步进行连锁不平衡分析,使用SPSS19.0软件将突变位点与尾型关联分析。结果显示,在BMP2基因及其上下游1 000 bp,共找到7个突变位点,其中rs402970343、rs594116558、rs160577302和rs429072090位点与尾长、尾宽以及尾周长相关,rs417201901和rs402226298位点与尾宽和尾周长相关,rs413373794位点的3种基因型仅在尾宽上存在差异。连锁不平衡分析结果表明,rs417201901-rs402970343,rs413373794-rs402226298-rs429072090之间存在强连锁,组合基因型与尾型关联分析结果显示,CCGG型和CCCCGG个体的尾长、尾宽和尾周长平均值与其他基因型相比均表现出优势,达到显著(P<0.05)或者极显著(P<0.01)水平。BMP2基因对绵羊的尾型有着较为显著的影响,其SNP位点作为分子标记对于绵羊尾型选育工作有着一定的指导意义。

基因组印记(genomic imprinting)是一种表观遗传(epigenetics)现象,是指哺乳动物中部分基因表现出亲本等位基因表达的差异性,即只表达一方的亲本等位基因。ANO1 (anoctamin 1)蛋白是钙激活氯通道的一个亚基,ANO1基因的过度表达与人类(Homo sapiens)多种癌症相关。该基因在人的胚胎和成年组织中为双等位基因表达,但在胎盘中为母源等位基因表达的印记基因。而ANO1基因在牛(Bos taurus)中的印记状态以及调控机理尚未见研究报道。为了分析ANO1基因在牛中的印记状态,首先通过PCR产物直接测序法在牛ANO1基因上找到SNP位点,进而对杂合子牛的组织和胎盘中的RNA进行反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR),经产物直接测序发现ANO1基因在牛中的印记状态为胎盘特异性印记,且为母源等位基因特异性表达。进一步采用亚硫酸氢盐测序法分析牛胎盘、牛精子以及成年牛组织中ANO1基因启动子区等位基因特异的甲基化状态,发现ANO1基因启动子甲基化不参与该基因的基因组印记表达。本研究结果表明牛ANO1基因为胎盘特异的父源印记基因,可为进一步研究ANO1基因表达与相关疾病的关联提供参考依据。

葛根素对动物具有解热作用,但其作用机制尚不清楚。本研究目的在于明确葛根素是否对受热应激猪(Sus scrofa)近端肾小管细胞(pig kidney proximal tubular cells, LLC-PK1)具有保护作用及其潜在机制。本研究将LLC-PK1细胞分为对照(C)组,热应激(HS, 42 ℃)组,葛根素(Pue, 10 µmol/L)组和热应激加葛根素(HS+Pue)组。分别用CCK-8和流式细胞术检测细胞生存率和凋亡率,使用qRT-PCR和Western blot分别检测B细胞淋巴瘤-2 (B-cell lymphoma, Bcl),Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax)、细胞色素c (cytochrome c, Cyto c)和细胞凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor, AIF) mRNA和蛋白表达水平,用相应试剂盒检测半胱天冬酶(cysteinyl aspartate specific proteinase, caspase) Caspase-9和Caspase-3活性及热休克蛋白(heat shock proteins, HSPs) HSP72和HSP90的含量。结果发现,葛根素抑制LLC-PK1线粒体Cyto c的释放和AIF mRNA的表达,并降低热应激条件下LLC-PK1细胞中Caspase-9和Caspase-3的活性。同时,热应激加葛根素组细胞中Bcl与Bax的比率以及HSP72的表达增加,HSP90的表达降低。上述结果表明,葛根素能降低热应激诱导的LLC-PK1细胞损伤,其机制是通过抑制线粒体凋亡通路的激活,上调细胞HSP72的表达来实现的。本研究揭示了葛根素抑制热应激诱导的LLC-PK1细胞损伤的部分机制,为临床上使用葛根素作为抗热应激的有效药物提供了基础资料。

哺乳动物各种生理功能中,生殖功能最易受热应激损伤。为探讨黄芩苷(baicalin)对受热应激小鼠(Mus musculus)子宫组织氧化损伤的影响及黄芩苷的抗热应激作用机制,本研究将性成熟雌性小鼠分为空白对照(C)组、黄芩苷(Bai)组、热应激(H)组和黄芩苷加热应激(H+Bai)组,采用TUNEL法、分光光度法、Western blot和免疫组化法检测子宫组织结构、细胞凋亡和信号转导的相关指标。结果显示,与H组相比,H+Bai组小鼠子宫组织损伤减轻、细胞凋亡水平降低,丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量极显著(P<0.01)降低,总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase dismutase, T-SOD)活性极显著升高(P<0.01),谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)和过氧化氢酶(catalase, CAT)活性均显著升高(P<0.05),胞浆蛋白伴侣分子kelch-like ECH-associated protein-1 (Keap1)和转录因子NF-E2相关因子2 (NF-E2-related factor 2, Nrf2)蛋白表达水平显著降低(P<0.05),子宫内膜上皮细胞及子宫腺上皮细胞中B淋巴细胞瘤-2 (B-cell lymphoma-2, Bcl-2)、Bcl2-关联X蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax)、凋亡蛋白酶激活因子(apoptotic protease activating factor-1, Apaf-1)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9 (cysteinyl aspartate specific proteinase-9, Caspase-9)和Caspase-3蛋白表达量减少,Caspase-9变化最明显。上述结果表明,黄芩苷减少热应激诱导的小鼠子宫组织氧化损伤和子宫内膜上皮细胞凋亡,其作用机制可能是通过激活Keap1/Nrf2信号通路进而调控抗氧化酶的活力实现的。本研究结果可为寻找缓解动物热应激方法提供理论依据,还可为抗热应激药物的筛选以及夏季奶牛(Bos taurus)繁殖力降低问题的解决提供基础资料。

地方鸡(Gallus gallus)品种是我国禽类遗传资源的重要组成部分。浙江省养鸡历史悠久,拥有众多鸡品种遗传资源,为研究浙江省主要鸡品种遗传多样性和遗传结构,促进不同鸡品种资源的保护以及合理的开发利用,本研究利用短串联重复序列(short tandem repeats, STR)分型技术对鹊山鸡、仙居鸡、萧山鸡、丝羽乌骨鸡、龙游麻鸡和白耳黄鸡6个鸡品种(共358只)在26个微卫星位点上进行了遗传多样性检测。结果显示,在6个群体的26个位点共检测到153个有效等位基因,平均有效等位基因数(effective number of alleles, Ne)为5.906 9,期望杂合度(expected heterozygousity, He)为0.795 9,基因流(gene flow, Nm)为2.007,Shannon信息指数I为1.925 1,多态信息含量(polymorphism information content, PIC)在0.24~0.87之间。Nei氏遗传距离结果显示,6个群体间的Nei氏遗传距离为0.103 5~0.380 9;其中,鹊山鸡与萧山鸡的遗传距离最大(数值为0.3809),鹊山鸡和白耳黄鸡的遗传距离次之(数值为0.1072),龙游麻鸡和仙居鸡的遗传距离最小(数值为0.1035)。聚类分析结果显示,鹊山鸡与白耳黄鸡、仙居鸡与龙游麻鸡分别聚为一类。6个群体均具有较高的遗传多样性,其中白耳黄鸡的遗传多样性最高,丝羽乌骨鸡的遗传多样性最低,鹊山鸡与其他鸡品种的相似性顺序由高至低依次为白耳黄鸡、丝羽乌骨鸡、龙游麻鸡、仙居鸡、萧山鸡。本研究通过对浙江省境内6个鸡品种的遗传多样性分析,进一步完善了浙江省主要鸡品种的遗传结构,为鸡遗传资源的保护及开发利用提供了基础资料。

三磷酸肌醇受体Ⅲ型(inositol triphosphate receptor type Ⅲ, IP3R3)是介导细胞内钙离子释放的第二信使,能结合三磷酸肌醇(IP3)形成钙离子通道,调节细胞内钙离子的释放。为了探究IP3R3基因对鸭(Anas platyrhyncha domestica)蛋壳品质的遗传效应,以期丰富蛋鸭相关重要经济性状的分子遗传研究基础。本研究以贵州三穗鸭为研究对象,采用qRT-PCR检测鸭IP3R3基因的组织表达;根据Genbank中IP3R3基因的序列,设计PCR扩增引物,直接回收、纯化、测序,利用DNAStar软件MegAlign程序结合测序峰图筛查鉴定120只三穗鸭的SNP位点,并运用SPSS18.0一般线性模型(general linear model, GLM)分析SNPs对蛋壳品质的相关性。实验结果显示,在鸭11个组织中均检测到IP3R3基因的表达,其中蛋壳腺表达丰度最高,肺、胸肌、肌胃相对表达量最低,其相对表达量顺序为蛋壳腺>心脏>脾>腺胃>胰腺>肾>肝>小肠>肺>胸肌>肌胃。SNPs鉴定结果表明,在IP3R3基因中发现4个SNP位点,分别是位于外显子20的g.21663 C>T和g.21699 G>A,以及位于内含子19的 g.21646 G>C和内含子20的g.21825 C>A;进一步分析发现,第20外显子g.21663 C>T、g.21699 G>A是同义突变位点,未引起酪氨酸(TAC)和赖氨酸(AAG)的改变。遗传特性分析结果显示,4个SNP 位点均为中度多态位点,且均偏离哈德-温伯格平衡(P<0.05);关联分析结果显示,g.21646位点对蛋形指数的影响达到显著水平(P<0.05),其中GG基因型蛋形指数显著高于CC基因型;g.21663位点对蛋壳强度的影响达到显著水平(P<0.05),其中CT基因型蛋壳强度显著高于TT和CC基因型(P<0.05),另外2个SNP位点对蛋壳品质的影响未达到显著水平。综合关联分析和表达量结果,IP3R3基因在鸭蛋壳腺中表达量均高于其他组织,初步推测IP3R3在蛋壳腺中高度表达可能与蛋壳品质调控有关;g.21663和g.21646位点均对鸭蛋壳品质影响显著(P<0.05),可以作为鸭蛋壳品质性状分子标记辅助的候选标记,该结果为提高鸭蛋品质及家禽选育工作提供科学资料。

结合珠蛋白(haptoglobin, Hp)又称触珠蛋白,主要由肝脏合成,在感染、损伤及炎症诱导的急性期反应(acute phase response, APR)中发挥重要作用。本研究从花鲈(Lateolabrax japonicus)转录组测序结果中获得其Hp基因(LjHp)全长cDNA序列(GenBank No. MK820673)。LjHp由2 285个核苷酸组成,包含1个大的ORF,预测编码1个由309个氨基酸组成、分子量约为33.82 kD的前体蛋白,N端22个残基为信号肽。序列分析显示,LjHp具有鱼类Hp的典型特征,与欧洲海鲈(Dicentrarchus labrax)Hp氨基酸同源性高达76.8%;系统进化树分析表明,鱼类Hp形成1个大簇,LjHp与黄鳝(Monopterus albus)Hp形成1个小簇。LjHp mRNA主要在健康花鲈肝脏中表达,其在哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)感染后,在花鲈的肝脏、脾脏和头肾中表达量显著增加(P<0.05)。Western blot分析表明,LjHp在花鲈血清中存在N-糖基化修饰,并且在哈维氏弧菌感染后血清中LjHp的含量显著上调(P<0.05)。以上结果显示,LjHp mRNA及其蛋白的表达与哈维氏弧菌感染密切相关,揭示其可能作为一个正急性期蛋白参与花鲈抵抗细菌感染。本研究结果为进一步研究鱼类Hp的功能及其在病原菌感染引起的APR中的分子机制提供基础资料。

酪氨酸蛋白激酶ZAP-70 (70 kD zeta-associated-protein, ZAP-70)是启动T细胞受体(T cell receptor, TCR)信号转导的关键因子,在T细胞增殖、活化过程中发挥重要作用。为探索杂交鳢(Channa maculata♀ × Channa argus♂) ZAP-70 (CmaZAP-70)在抗菌感染过程中的作用及其在信号转导中的功能,本研究克隆获得CmaZAP-70基因(GenBank No. MK134563)的ORF,分析其对舒伯特气单胞菌(Aeromonas schubertii)和鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)感染的应答特性,构建真核表达质粒pEGFP-N1-ZAP70,检测其过表达对核因子κB (nuclear factor kappa-B, NF-κB)和活化蛋白1 (activating protein 1, AP-1)活性的影响。序列分析显示,CmaZAP-70基因的完整ORF为1 818 bp,编码605个氨基酸;CmaZAP-70含两个串联的SH2结构域和1个SH1激酶结构域;与哺乳动物ZAP-70某些磷酸化位点及催化基序具有极高的保守性;进化树中CmaZAP-70与其他鱼类ZAP-70聚为一支,并与欧洲鲈(Dicentrarchus labrax)亲缘性最近。qRT-PCR检测发现,CmaZAP-70在健康杂交鳢所检的10个组织中广泛表达,于脾脏中表达最高,皮肤中表达最低(P<0.05)。在杂交鳢分别感染两种病原菌后,CmaZAP-70在肝脏、脾脏和头肾中的表达主要呈上调趋势;其中感染舒伯特气单胞菌后,CmaZAP-70在肝脏和脾脏于第1天,头肾在第2天达到表达峰值(P<0.05),而感染鰤鱼诺卡氏菌后,均在第3天出现表达上调峰值(P<0.05)。双荧光素酶报告基因结果显示pEGFP-N1-ZAP70的过表达显著增强转录因子NF-κB和AP-1的活性。上述结果表明,CmaZAP-70在防御病原菌感染应答过程中发挥重要作用。本研究为进一步揭示鱼类TCR信号通路提供了理论基础。

水生植物满江红(Azolla)是一种具代表性的植物和蓝细菌的共生体。利用常规技术,可以发现固氮蓝细菌和众多细菌栖居于满江红的叶腔中。本研究旨在应用扫描电镜(scanning electron microscopy, SEM),荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)和高通量测序技术探讨满江红微生物群落的遗传多样性,尤其揭示叶腔中真菌和古菌的存在。以新鲜健康的小叶满江红(A. microphylla, IRRI accesion No. 4018)萍体为材料,对从120个叶腔中分离到的250个微生物样本进行荧光显微镜和电镜的镜检,在230个样本中发现了真菌状的结构特征,包括了菌丝,子囊,子囊孢子,分生孢子和担子等结构。80%的真菌状结构可以定位于第七片至第十五片叶的叶腔中,且叶龄越大,被检出的真菌数量越多。86%的样本检测为古菌阳性,但其丰度与叶龄无关。随后通过高通量测序,对其群落组成进行分析。结果表明,满江红体内有子囊菌门(Ascomycota)(67.39%),拟杆菌门(Phragmoplastophyta)(31.72%),担子菌门(Cordycipitaceae)(0.56%),虫菌门(Entomophthoromycota)(0.33%) 4个真菌门和广古菌门(Euryarchaeota)(99.68%)为主的两2个古菌门共存。本研究结果表明满江红体内的微生态系统比我们原先想象的复杂得多,也再次证明满江红是植物-微生物相互作用研究颇具价值的模式植物。

肝损伤在宠物临床病例中发病率较高,可由多种因素导致。近年来,随着细胞治疗相关研究的不断深入,间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)移植治疗逐渐成为肝损伤疾病治疗的热点和主要方向之一。目前对于肝损伤治疗的研究多以药物诱导的动物模型为主,选择一个合适有效的MSCs高效诱导为肝细胞方法十分重要。研究表明,使用褪黑素(melatonin, Mel)对间充质干细胞进行处理,可提高其体外活力,从而增强其移植治疗的效果。本文对脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells, ADSCs)联合褪黑素移植治疗肝损伤做系统综述,为进一步研究提供一定的理论依据和指导。

P58^IPK (58 kD inhibitor of PKR)作为宿主细胞分子伴侣蛋白,在调节机体抗病毒反应和免疫应答方面发挥着重要作用。本研究拟克隆猪(Sus scrofa) P58^IPK基因CDS序列并构建其原核表达载体,纯化P58^IPK蛋白并以此为抗原制备多克隆抗体,以期为后续研究猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2, PCV2)与宿主之间的互作关系提供基础材料。根据猪P58^IPK全基因序列(GenBank No. HQ287801.1)设计引物,以反转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR)方法扩增P58^IPK基因CDS序列(去除信号肽序列),经NdeⅠ/XbaⅠ双酶切后定向克隆至原核表达载体pCzn1;将其转化Arctic-Express^TM大肠杆菌(Escherichia coli)进行诱导表达;表达产物经变性、复性及His-Band Ni⁺层析柱亲和纯化,将纯化产物His-P58^IPK重组蛋白作为抗原免疫兔子(Oryctolagus?cuniculus)制备多克隆抗体。抗体纯化后,分别利用间接ELISA和Western blot方法对其效价和特异性进行检测。结果显示,克隆所得的猪P58^IPK基因CDS序列长度为1 425 bp,表达产物His-P58^IPK重组蛋白主要以包涵体形式存在,分子量约为54.44 kD;由此蛋白制备的多抗效价在1∶512 000以上,能够特异性识别目标蛋白(包括重组蛋白His-P58^IPK和猪P58^IPK蛋白)。本研究成功克隆了猪P58^IPK多克隆抗体,可为深入研究猪P58^IPK蛋白功能和PCV2病毒与宿主之间的互作机制提供基础资料。