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农业生物技术学报  2018年 26卷 12期  刊出日期:2018-11-23
 
研究论文与报告
金黄色葡萄球菌和大肠杆菌感染BMECs对细胞因子和受体表达及细胞凋亡的影响
Effect on the Expression of Cytokine, Receptor and Apoptosis in BMECs by Staphylococcus aureus and Escherichia coli Infected
赵凌 潘阳阳 何翃闳 李秦 丁天翊 张慧珠 樊江峰 崔燕 余四九
2018, 26(12): 2132-2141  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (5134 KB)  ( 167 )
摘要
奶牛(Bos taurus)乳腺炎的产生使奶牛业的发展受到制约,奶牛健康遭到破坏的同时,乳制品的质量也随之进行下降。病原微生物是乳腺炎产生的主要源头,细胞的凋亡由病原微生物引起,而且能够干扰病症的发展过程。本研究旨在探究金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和大肠杆菌(Escherichia coli)感染奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells, BMECs)对细胞因子和受体的表达及细胞凋亡的影响。本实验通过体外培养BMECs并进行免疫化学细胞鉴定,选取纯化的第5代BMECs,分别加入0、101、102、103、104 CFU/mL (CFU: 菌落形成单位, colony-forming units)浓度的S. aureus或E. coli,经过公式计算,以最佳感染量0.6 mL感染细胞,实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR, qRT-PCR)对细胞中白细胞介素1β (interleukin-1, IL-1β)和受体IL1RⅠ及肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF-α)的基因表达量进行检测,通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法(terminal dexynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)对细胞凋亡进行检测。结果表明,本实验所培养的细胞不表达波形蛋白,表达角蛋白18和β-酪蛋白,故培养的是BMECs。分别以0、101、102、103、104 CFU/mL的S. aureus处理细胞12 h,IL1RⅠ、IL-1β、TNF-α的表达量分别在浓度为102、104、103 CFU/mL时最高。分别以0、101、102、103、104 CFU/mL的E. coli处理12 h,IL1RⅠ、IL-1β、TNF-α的表达量分别在浓度101、103、104 CFU/mL时最高。利用浓度为101、102、103、104 CFU/mL的S. aureus或E. coli对细胞进行处理,在浓度为104 CFU/mL时凋亡率最高。本研究结果表明,不同浓度菌液感染BMECs,细胞因子表达呈上升趋势,其受体表达呈下降趋势,并诱导细胞出现凋亡现象。本实验为研究因细菌感染而导致乳腺炎的致病机制提供了科学依据。
基于CRISPR/Cas9技术构建BHV-1 gE缺失株及其免疫生物学特性初步鉴定
Construction of BHV-1 gE Deletion Strain Based on CRISPR/Cas9 Technique and Preliminary Identification of Its Immunobiological Characteristics
穆艳霞 张金玲 刘春羽 刘海瑞 温永俊 李光鹏 杨洋
2018, 26(12): 2003-2016  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (5302 KB)  ( 504 )
摘要
牛(Bos taurus)疱疹病毒Ⅰ型(Bovine herpes virus type I, BHV-1)可引发牛传染性鼻气管炎(infectious bovine rhinotracheitis, IBR),对养牛业造成巨大经济损失。基因缺失疫苗的广泛使用可有效减少BHV-1感染。为了更高效地构建基因缺失疫苗,本研究应用CRISPR/Cas9基因编辑与同源重组技术,构建带有增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)标记并缺失糖蛋白E基因(glycoprotein E, gE)的重组BHV-1病毒,命名为BHV-1 gE-/EGFP+。随后通过特异性的小向导RNA (small guide RNA, sgRNA)敲除BHV-1 gE-/EGFP+病毒基因组中的EGFP基因,该gE基因缺失株命名为BHV-1 ΔgE。体外生物学特性分析显示,BHV-1 ΔgE与亲本BHV-1具有相似的生长特性和噬斑形态。动物免疫实验结果显示,gE基因缺失没有改变BHV-1的免疫原性,BHV-1 gE缺失株可作为新型重组IBR疫苗的候选毒株。本研究首次利用CRISPR/Cas9系统对BHV-1 gE基因进行了缺失编辑,提供了一种高效的BHV-1基因缺失毒株的构建方法,为IBR基因缺失疫苗研制提供了实验依据。
基于基因组重测序分析高油酸转基因大豆事件外源T-DNA旁侧序列及特异性检测
Identification of the T-DNA Flanking Sequences and Event-Specific PCR Analysis of High-Content Oleic Acid Transgenic Soybean Based on Genome Re-sequencing
仲晓芳 杨静 贺红利 牛陆 邢国杰 杨向东
2018, 26(12): 2017-2026  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (5083 KB)  ( 216 )
摘要
基于外源T-DNA与植物基因组的连接区域的特异性建立的特异性检测方法,具有非常高的特异性和准确性,是实现对该转基因事件及其衍生品种的有效监督管理、保障转基因产业健康发展的重要技术手段。本研究前期利用反义RNA和RNAi技术,获得2个油酸含量达78%以上的高油酸转基因大豆(Glycine max)事件。由于T-DNA携带大豆内源基因,旁侧序列不易分析,且为进一步推进上述转化事件的安全评价及应用,本研究基于基因组重测序技术并结合PCR,分析上述2个转基因大豆事件外源T-DNA整合位点旁侧序列。Southern杂交结果显示,2个高油酸转基因大豆事件E2D9050和EB8072外源T-DNA插入拷贝数分别为1个和2个。采用BWA-Burrows-Wheeler Alignment tool (http://bio-bwa.sourceforge.net/)方法,将基因组重测序分析获得的转基因事件序列信息与参考大豆基因组进行对比。结果表明,转基因大豆事件E2D9050整合位点为Chr04号染色体的51410941位点,整合方式为反向单拷贝插入;EB8072整合位点为大豆基因组Chr19染色体38147218位点,整合方式为单位点双拷贝反向插入,两个拷贝的右边界相接。结合PCR扩增,分别获得E2D9050和EB8072转基因事件整合位点的左、右边界旁侧序列。依据其序列特征,建立了转基因大豆事件两个转化体特异性检测方法,检测灵敏度为0.1%,为上述2个高油酸转基因大豆事件及其衍生产品特异性检测提供依据。
多环境下玉米籽粒品质性状的QTL定位
Mapping QTL for Grain Quality Traits in Maize (Zea mays) Under Multi-Environments
赵志鑫 崔婷婷 何坤辉 兰天茹 常立国 刘建超
2018, 26(12): 2027-2035  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (2392 KB)  ( 182 )
摘要
挖掘玉米(Zea mays)籽粒品质性状相关QTL可为玉米育种实践提供理论参考。本研究以玉米优良自交系许178和K12为亲本杂交衍生的包含150个家系的玉米重组自交系(recombinant inbred lines, RILs)群体为实验材料,对3年共7个环境的各家系玉米籽粒蛋白质含量、淀粉含量、油分含量共3个品质性状进行表型鉴定,使用最佳线性无偏预测法(best linear unbiased prediction, BLUP),结合表型值估计各家系各性状的BLUP值,利用WinQTLcart2.5的复合区间作图法(composite interval mapping, CIM),以似然函数比值对数值(logarithm viscosity odds, LOD)为2.5对目的性状进行全基因组QTLs扫描。经QTL定位分析,共挖掘到20个QTL位点,包括9个蛋白质含量QTL、6个淀粉含量QTL、5个油分含量QTL,分布于1、2、4、5、6和10号染色体,单个QTL可解释表型变异为2.3%~15.7%,LOD值介于2.52~6.50。位于染色体Bin4.07/4.08区间的QTL可在4个环境(2016杨凌, 2016榆林, 2014杨凌, 2014葫芦岛)中以及利用BLUP值检测到;位于染色体Bin6.05/6.06的QTL可在4种环境中检测到;位于染色体Bin5.07的2个QTL可在3种环境中检测到。本研究检测到的20个玉米籽粒品质相关的QTL中,位于4号染色体上umc1194~umc2384区间的QTL,可解释10.3%~15.7%的表型变异,在多种环境中均能检测到,有较高的环境稳定性,是控制玉米籽粒蛋白质含量的主效QTL,有望在玉米品质遗传改良上加以应用。本研究为玉米的分子辅助育种提供了基础资料。
辣椒细胞质雄性不育系和保持系蔗糖转化酶活性与相关基因表达分析
Invertase Activity and Related Genes Expression Analysis in Cytoplasmic Male Sterile and Fertile Pepper (Capsicum annuum) Lines
阮美颖 万红建 杨有新 周国治 王荣青 叶青静 姚祝平 杨悦俭 程远 李志邈
2018, 26(12): 2036-2046  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (5767 KB)  ( 164 )
摘要
蔗糖是植物光合作用的主要同化产物。植物生殖器官对蔗糖的有效利用,在植物的受精和坐果过程中发挥重要作用。蔗糖转化酶(invertase, INV)将蔗糖水解为葡萄糖和果糖,是蔗糖代谢的关键酶,根据细胞内位置不同,INV被分成细胞质蔗糖转化酶(cytoplasmic invertase, CIN)、液泡蔗糖转化酶(vacuole invertase, VIN)和细胞壁蔗糖转化酶(cell wall invertase, CWIN)。为探究蔗糖代谢在花粉败育导致辣椒(Capsicum annuum)雄性不育过程中的相关生理分子机理,本研究分析了INV的酶活性、基因表达模式与辣椒雄性不育性状之间的关系。本研究以1对辣椒细胞质雄性不育系131A和保持系131B为实验材料,利用INV酶活性测定、辣椒基因组INV鉴定与结构分析等,以及辣椒CWIN合成相关基因qRT-PCR等方法,对不同组织以及不同发育时期花中蔗糖转化酶的活性、转化酶合成基因表达模式等指标进行了比较分析。结果表明,在大花蕾和成花时期保持系131B的CWIN酶活性显著高于不育系131A,且差异显著性分别达到极其显著(P<0.001)和极显著(P<0.01),而这一现象与辣椒CWIN合成基因CaCWIN3和CaCWIN4在保持系131B雄蕊中的高表达水平紧密相关。据此推测,辣椒CaCWIN3和CaCWIN4可能是蔗糖转化酶参与调控辣椒雄性不育的重要功能基因。本研究结果为深入研究辣椒雄性不育分子调控机理提供了方向。
甘蔗纤维素合成酶基因ScCes3的全长克隆与表达分析
Full-length Cloning and Expression Analysis of ScCes3 in Sugarcane (Saccharum officinarum)
黄诚梅 吴凯朝 魏源文 邓智年 陆珍 曹辉庆 罗海斌 蒋胜理 徐 林
2018, 26(12): 2047-2056  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (5981 KB)  ( 179 )
摘要
植物纤维素合成酶(cellulose synthase)催化合成β-1, 4糖苷链,是一种重要的糖苷转移酶。本研究根据前期从甘蔗(Saccharum officinarum)水分胁迫cDNA文库中获得的1条与玉米(Zea mays) 纤维素合成酶3(cellulose synthase 3, Ces3)基因高度同源的核酸序列,通过反转录PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)结合cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术,成功克隆了甘蔗纤维素合成酶基因(ScCes3) 5'端80 bp序列和完整3'端非编码区的全长cDNA序列(GenBank No. MG324347)。生物信息学分析显示,ScCes3基因全长3 625 bp,包含1个3 225 bp的完整开放阅读框,编码1 074个氨基酸残基;ScCes3蛋白为稳定的两性蛋白,不存在信号肽;蛋白二级结构多为无规则卷曲,主要位于细胞质膜上,具有植物纤维素合成酶家族蛋白的保守结构域。qRT-PCR分析表明,ScCes3基因在甘蔗植株叶片、叶鞘、茎等不同组织器官中均有表达,在茎中表达量高,尤其以第5节间中表达量最高,在叶片中表达量较低。本研究结果为进一步对该基因的表达规律和功能分析提供基础。
杉木ClHA2基因的克隆及表达分析
Cloning of ClHA2 Gene and Its Expression Analysis in Chinese Fir (Cunninghamia lanceolata)
吴博慧 黎建辉 卢泳全
2018, 26(12): 2057-2065  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (7628 KB)  ( 147 )
摘要
摘要:质膜H+-ATPase(Plasma membrane H+-ATPase,PM H+-ATPase)在植物响应低磷胁迫中起重要作用,本研究从杉木转录组测序结果中筛选出一个PM H+-ATPase基因序列。在三个杉木无性系X6、3号和39号中分别进行克隆,所得序列长2898bp,包含一个2862bp的完整开放阅读框,编码953个氨基酸,命名为ClHA2,登录号为。该cDNA与其他植物PM H+-ATPase高度保守。预测其蛋白质相对分子质量约为105.05kDa,理论等电点(PI)为6.38,为跨膜10次的蛋白,其二级结构主要由α-螺旋组成。实时荧光定量PCR结果表明,在低磷胁迫下三个杉木无性系ClHA2基因在根、茎、叶部位均有表达,且受到不同程度的抑制。
从江香猪FGF10基因干扰载体的构建及相关基因表达分析
Construction of Interference Vector of FGF10 Gene and Expression Analysis of Related Genes in Congjiang Xiang Pig (Sus scrofa)
杨洋 许厚强 陈伟 徐敏
2018, 26(12): 2066-2074  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (3676 KB)  ( 137 )
摘要
成纤维细胞生长因子10基因(fibroblast growth factor 10, FGF10)属于成纤维细胞生长因子家族成员之一,在脂肪组织的发育和代谢过程中具有重要的作用。为了进一步揭示FGF10基因在从江香猪(Sus scrofa)肌内脂肪中的调控作用,本研究通过在线软件设计了FGF10基因4对siRNA干扰序列和一对阴性对照序列,连入pGPU6/GFP/Neo载体后,筛选成功构建的干扰载体,并转染从江香猪肌内前体脂肪细胞,并采用qRT-PCR的方法筛选出最佳干扰载体,通过最佳干扰载体抑制FGF10基因的表达,采用qRT-PCR检测沉默FGF10对脂肪分化关键基因—过氧化物酶体增殖物激活受体γ基因(peroxisome proliferator activated receptorγ, PPARγ)、脂肪组织甘油三酯水解酶基因(adipose triglyceride lipase, ATGL)、脂联素基因(adiponectin, ADIPOQ)、脂肪酸结合蛋白4基因(fatty acid binding protein 4, FABP4)、脂肪酸合成酶基因(fatty acid synthase, FAS)、脂蛋白酯酶基因(lipoprotein lipase, LPL)、乙酰辅酶A羧化酶基因(acetyl-CoA carboxylase, ACC)以及激素敏感脂酶基因(hormone sensitive lipase, HSL)表达的影响。结果表明,本实验成功构建了从江香猪FGF10基因的干扰载体,并筛选出最佳干扰载体的干扰效率达74.30%;抑制FGF10基因表达后,相关脂肪分化关键基因ACC、ATGL、ADIPOQ、FABP4、FAS、LPL、PPARγ和HSL的表达量均显著降低,ACC与PPARγ的表达量显著低于空白对照组(P<0.05),ATGL、ADIPOQ、FABP4、FAS和LPL这5个基因的相对表达量均是极显著低于空白对照组(P<0.01),HSL基因的相对表达量与对照组无显著性差异(P>0.05)。本实验将构建的FGF10基因的干扰载体成功地转染了从江香猪肌内前体脂肪细胞,体外沉默FGF10基因可抑制猪肌内前体脂肪的分化,这可能与相关脂肪分化基因的低表达有关,为进一步研究FGF10基因对脂肪沉积的调控机理奠定基础。
DNMT1基因干扰对猪体细胞克隆胚胎发育、基因转录和DNA甲基化的影响
Effect of DNMT1 Interference on Development, Gene Transcription and DNA Methylation of Porcine (Sus scrofa) Cloned Embryos
许卫华 李紫聪 吴珍芳 石俊松
2018, 26(12): 2075-2083  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (3008 KB)  ( 149 )
摘要
相对于体外受精胚胎,猪(Sus scrofa)体细胞克隆胚胎DNA甲基转移酶1(DNA (cytosine-5)-methyltransferase 1, DNMT1)呈现延迟降解的现象。本研究通过向单细胞期重构胚胎注射抗DNMT1 siRNA,记录胚胎卵裂率、囊胚发育率以及囊胚期细胞总数,并提取四细胞期和囊胚期胚胎总RNA和DNA,对发育重要相关基因mRNA水平和DNA甲基化水平进行检测。结果显示,虽然抑制DNMT1未能显著提高猪体细胞克隆胚胎体外发育性能(P>0.05),但50 μmol/L干扰组囊胚发育率(30.43%)相对于阴性对照组(23.01%)和未注射组(25.74%)有上升的趋势(P=0.19);在基因转录方面,注射抗DNMT1 siRNA显著提高了四细胞期胚胎中POU结构域5类转录因子1 (POU domain, class 5, transcription factor 1, POU5F1)基因和囊胚中NANOG基因的表达水平(P<0.05),也显著上调了囊胚期DNMT1转录水平(P<0.05);在DNA甲基化方面,注射抗DNMT1 siRNA促进了四细胞期POU5F1基因5'-UTR区域DNA的去甲基化和降低了囊胚期整体甲基化水平;然而DNMT1的过度抑制破坏了非编码RNA H19基因印迹的DNA甲基化状态。本研究表明,温和抑制克隆胚胎中过高的DNMT1 mRNA水平,促进了多能基因的表达和DNA去甲基化重编程,该结果对研究DNMT1在早期胚胎生成过程中的作用机制提供了基础资料。
苏博美利奴羊毛囊发育不同时期皮肤组织LncRNAs及其靶基因的差异表达
Differential Expression of LncRNAs and Target Genes in Skin Tissue at Different Stages of Subo Merino Sheep (Ovis aries) Hair Follicle Development
朱桦 黄锡霞 田可川 何军敏 付雪峰 赵冰茹 徐新明 田月珍 阿布来提·苏来曼
2018, 26(12): 2084-2092  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (2566 KB)  ( 132 )
摘要
长链非编码RNA (long noncoding RNA, LncRNA)参与哺乳动物多种生物学过程,目前研究其在毛囊形成过程中的作用机制却相对较少,因此研究LncRNA对毛囊发育的影响成为了解毛囊形成生物学过程的新方向。为验证前期获得的苏博美利奴羊(Ovis aries)毛囊发育不同时期皮肤组织的RNA-Seq结果以及与预测靶基因表达量差异,本研究利用qRT-PCR技术检测了在苏博美利奴羊毛囊发育6个关键时期两种在皮肤组织中差异表达且靶基因与毛囊发育相关的LncRNA 00202353和LncRNA 00316173及其靶基因的表达情况。结果表明,LncRNA 00202353及其靶基因分泌型卷曲相关蛋白2 (secreted frizzled-related protein 2, SFRP2)的表达量在胚胎期85 d极显著高于胚胎期65 d、胚胎期135 d、出生后7 d和出生后30 d的表达量(P<0.01);LncRNA 00316173及其靶基因胰岛素样生长因子2 (insulin-like growth factor 2, IGF2)的表达量在胚胎期65 d时极显著高于胚胎期135 d、出生后7 d和出生后30 d的表达量(P<0.01);将苏博美利奴羊毛囊发育时期分为发育期和成熟期进行分析,发现LncRNA 00202353及其靶基因SFRP2与LncRNA 00316173及其靶基因IGF2的表达量在毛囊发育期极显著高于毛囊成熟期(P<0.01),研究表明LncRNA 00202353与LncRNA 00316173及其靶基因参与毛囊的发育过程。本研究结果对后期深入研究LncRNA对毛囊发育的研究具有重要的参考价值,也为探究超细毛羊毛囊周期性变化的生物学过程提供研究线索。
日粮添加亚甲基水杨酸杆菌肽对断奶仔兔肠道组织IL-2和IgG的影响
Effect of Dietary Supplementation of Bacitracin Methylene Disalicylate on IL-2 and IgG in Weanling Rabbits (Oryctolagus cuniculus)
陈阳 李佳丽 赵博昊 朱杰 朱慈根 潘雨来 吴信生
2018, 26(12): 2093-2099  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (1815 KB)  ( 124 )
摘要
亚甲基水杨酸杆菌肽(bacitracin methylene disalicylate, BMD)作为第二代杆菌肽类饲料添加剂,可促进畜禽的生长和提高免疫力。本研究旨在探讨BMD对断奶仔兔免疫机能的动态影响,选取35日龄同期断奶新西兰白兔(Oryctolagus cuniculus)300只,设置亚甲基水杨酸杆菌肽高(BMD H, 100 mg/kg)、中(BMD M, 50 mg/kg)、低(BMD L, 25 mg/kg)剂量组、杆菌肽锌为(bacitracin zinc, BZ, 50 mg/kg)对照组、空白对照组(C, 无添加)。本课题组研究已证实BMD对家兔生长有促进作用,在35 d实验期结束时,利用酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)和qRT-PCR技术分别检测了盲肠和十二指肠中白细胞介素2(interleukin 2, IL-2)和免疫球蛋白G (immunoglobulin G, IgG)的含量和基因表达量。结果发现,在盲肠中BMD和BZ组的IgG和IL-2的含量均高于C组(P<0.05);十二指肠中BMD H显著高于C组(P<0.05)。检测mRNA表达水平后,相关性分析发现盲肠中的IL-2和IgG含量与其mRNA表达水平呈显著正相关(P<0.05)。结果表明日粮中添加适量BMD饲喂断奶仔兔可上调肠道IL-2和IgG含量及其mRNA表达水平,且与杆菌肽锌效果相当,以50~100 mg/kg添加剂量较好。本研究进一步证实了BMD具有提高家兔免疫力的作用,为其在兔产业上推广应用提供依据。
蛋白芯片筛选碱胁迫下红罗非鱼鳃差异表达蛋白
Screening the Differential Expressed Proteins by Protein Chip in Gill of Red Tilapia (Oreochromis mossambicus ♀ × O. niloticus ♂) Under Alkalinity Stress
黄思颖 赵金良 王燕 郝月月 涂翰卿 赵岩
2018, 26(12): 2100-2108  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (5707 KB)  ( 126 )
摘要
广盐性鱼类可在一定范围的盐碱水环境中生存,鳃组织被认为是主要的调节器官,负责离子转运,维持渗透压平衡和酸碱平衡。为进一步探讨鱼类在碱环境胁迫下的蛋白质水平应答机制,本文以红罗非鱼(Oreochromis mossambicus ♀ × O. niloticus ♂)为材料,结合高效、高通量的蛋白芯片技术,将红罗非鱼从淡水直接转入浓度为2、3和4 g/L NaHCO3碱水中进行急性胁迫实验,利用蛋白抗体芯片结合串联质谱技术,初步筛选了碱胁迫下红罗非鱼鳃组织的差异表达蛋白,并采用免疫组学技术对候选差异蛋白进行了验证。结果显示,与淡水组相比,碱水组中共筛选得到表达量有显著差异的蛋白质位点229个(变化倍数≥1.5),其中,碱度组特异表达位点90个,包含上调的位点41个、下调位点的49个。挑选其中5个蛋白质位点进行质谱鉴定,得到2个蛋白质:信号蛋白14-3-3(14-3-3 protein beta/alpha-A-like isoform X1)和热休克蛋白40家族伴侣蛋白(heat shock protein 40, Dna J homolog subfamily β member 11-like, Dna J)。免疫组化结果显示,14-3-3和Dna J蛋白在红罗非鱼鳃小片基部均有阳性反应,且阳性反应随NaHCO3浓度升高显著增强。Western blot结果显示,在淡水和碱水环境下,鳃中14-3-3和Dna J两种蛋白均有表达,14-3-3蛋白表达量随碱溶液浓度的升高而升高,Dna J蛋白碱水环境显著高于淡水环境;高碱度(4 g/L)下,随胁迫时间持续,14-3-3蛋白呈现先降低后升高的变化趋势,12 h表达量最低,72 h升高至峰值;Dna J蛋白表达量96 h达到最高值峰值 (P<0.05)。初步推断,在碳酸盐碱环境中,红罗非鱼能够通过启动鳃组织中的调节蛋白14-3-3和伴侣蛋白Dna J的表达水平来维持体内蛋白质的稳定性,以此维持二者在机体内的正常功能。结果表明,碱胁迫会导致红罗非鱼14-3-3和Dna J两种蛋白的表达量水平上升,两者参与了红罗非鱼碱环境胁迫下的应答,该研究为探索红罗非鱼在碱水环境下的调节和适应机理在蛋白水平提供了一定的依据。
悬铃木方翅网蝽触角转录组及嗅觉相关基因分析
Analysis of the Antennal Transcriptome and Olfactory-related Genes of the Sycamore Lace Bug (Corythucha ciliata)
杨海博 胡镇杰 李定旭 朱品红 董钧锋
2018, 26(12): 2109-2120  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (3341 KB)  ( 239 )
摘要
悬铃木方翅网蝽(Corythucha ciliata)是专一性危害悬铃木(Platanus acerifolia)的重要害虫。本研究的目的是建立悬铃木方翅网蝽成虫触角转录组数据库,获得与嗅觉相关的基因信息。以悬铃木方翅网蝽雌雄成虫触角为材料,利用高通量测序平台Illumina HiSeqTM 4000进行转录组测序,并进行生物信息学分析。得到平均长度为1 036 bp,N50为1 809 bp,共65 943条单基因簇(Unigenes)。通过同源性比对,成功注释16 600条Unigenes,其中,在NCBI蛋白数据库(NCBI Non-redundant Protein Sequences, Nr)注释的Unigenes与内华达古白蚁(Zootermopsis nevadensis)Unigenes的相似基因序列最多,为14.40%。与基因本体数据库(gene ontology, GO)比对发现,6 435条Unigenes,根据其功能大致可分为细胞组分、分子功能和生物过程3大类52亚类,与代谢进程、细胞进程、催化活性和结合相关的Unigenes较多。基因表达分析发现,一共得到1 116个差异表达基因,其中有1 096个基因上调,有20个基因下调。京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)富集分析表明,6 309条Unigenes归属于255个通路,有346个差异表达基因,参与碳代谢的基因最多(20个)。进一步筛选获得194个嗅觉相关基因,包括77个气味受体基因(odorant receptor, OR),64个气味降解酶基因(odorant degrading enzyme, ODE),26个气味结合蛋白基因(odorant binding protein, OBP),11个离子型受体基因(ionotropic receptor, IR),14个化学感受蛋白基因(chemosensory protein, CSP)和2个感觉神经元膜蛋白基因(sensory neuron membrane protein, SNMP),并用FPKM (fragments per kilobase per million reads)值对基因表达量进行评估。本研究初步阐明悬铃木方翅网蝽成虫触角转录组的整体表达模式,为进一步研究悬铃木方翅网蝽嗅觉调控机理提供了资料基础。
嗜虫耶尔森氏菌Ye1-8的分离鉴定及其对红棕象甲的杀虫活性
Isolation and Identification of Yersinia entomophaga Strain Ye1-8 and Its Toxicity to the Red Palm Weevil (Rhynchophorus ferrugineus)
郭雅洁 韩红 廖启炓 林倩男 牟亚妮 翁小倩 邹双全 张飞萍 吴松青
2018, 26(12): 2121-2131  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (3039 KB)  ( 328 )
摘要
红棕象甲(Rhynchophorus ferrugineus)是14种全国林业检疫性有害生物之一,其为害椰子树(Cocos nucifera)等棕榈科(Arecaceae)植物。本研究从患败血症的红棕象甲的体内分离出1株对红棕象甲幼虫具有杀虫活性的菌株Yel-8,通过形态学、16S rDNA、生理生化测定及药敏分析对该菌株进行鉴定。结果表明该菌株属于嗜虫耶尔森氏菌(Yersinia entomophaga)的一个新的菌株,其在L-阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、蔗糖、七叶灵、纤二糖各项特征的分析中与嗜虫耶尔森氏菌的特征相同,仅在山梨醇的利用方面与嗜虫耶尔森氏菌相反,呈阴性。利用菌株Ye1-8进行生物测定表现出对红棕象甲具较好的杀虫活性(饲喂法和注射法的的半致死浓度(median lethal concentration, LC50)分别为3.184×108和5.1295×106 CFU/mg)。从菌株Ye1-8中分别克隆并表达了几丁质酶1(chitinase 1, chi1)基因和几丁质酶2 (chitinase 2, chi2)基因,结果表明Chi1和Chi2蛋白对于红棕象甲无杀虫活性,因此菌株Yel-8需要完整的毒素复合体才能发挥毒性。本研究为构建红棕象甲生防工程菌提供了新的材料。
研究资源与技术改进
玉米根尖组织原生质体的分离和流式分析
Isolation and Flow Analysis of Protoplasts from Maize (Zea mays) Root Tip
孔瑶 冯娇娇 张政权 李思璐 宋志伟 郭东伟
2018, 26(12): 2160-2167  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (3056 KB)  ( 414 )
摘要
为探究基因表达对根尖细胞命运决定的影响,需将根部不同类型细胞分群,以进行更深入的分析。本研究通过酶解法获取玉米(Zea mays)幼嫩根尖组织的原生质体,利用荧光染色和流式细胞术进行分析和分选。实验结果显示,对于4~5 d的幼嫩玉米根尖组织,酶解获取原生质体的最优方案为:酶处理组合为1.0%纤维素酶和0.3%果胶酶,最适渗透压条件为10%甘露醇,最适酶解时间为4 h,最适pH值为5.8。对于上述最佳条件下提取的原生质体进行纯化,原生质体悬浮液中的细胞碎片等杂质得到有效清除。以荧光染料碘化丙啶(propidium iodide, PI)和荧光素双醋酸酯(fluorescein diacetate, FDA)对纯化的原生质体进行染色,荧光显微镜下观察显示,原生质体活性较高;为了进一步进行流式分选,对于不同荧光染料进行染色效果分析显示,Hoechst33342对活性原生质体的染色效果优于4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI),可使体系中大部分原生质体染色,且分辨率高;同时,Hoechst33342最佳染色温度为38 ℃,最佳染色pH值为11.59。本研究为深入探讨植物根尖细胞的相关研究提供了实验依据。
基于单核苷酸多态性鉴别小梅山猪及其制品
Identification of Small Meishan Pig (Sus scrofa) and Its Products Based on Single Nucleotide Polymorphism
岳阳 张哲 徐忠 孙浩 刘登英 赵伟 马裴裴 张向喆 王起山 潘玉春
2018, 26(12): 2168-2175  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (1294 KB)  ( 114 )
摘要
小梅山猪(Sus scrofa)是太湖流域独特的地方猪品种,具有肉质鲜美等特点,市场上存在小梅山猪及其肉制品的假冒问题,而传统鉴别技术在实际应用中具有一定的局限性。本研究利用第3代分子标记—单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)开发小梅山猪及其制品的分子标记鉴定方法,将小梅山猪与太湖流域其他6个品种及常见西方品种猪进行鉴别区分。对于太湖流域7个品种(品系)(中梅山猪、小梅山猪、二花脸猪、米猪、嘉兴黑猪、枫泾猪和沙乌头猪)和西方5个引进猪品种(杜洛克、长白猪、大白猪、皮特兰、巴克夏)进行简化基因组测序(genotyping by genome reducing and sequencing, GGRS),筛选出小梅山猪与其他猪种具有差异的5个SNP位点,采用Sanger测序进行验证。结果表明,上述5个SNPs在小梅山猪中存在较高等位基因突变率,利用5个候选位点的组合可达到鉴定概率99.35%、准确率100%,无假阳性错判。本研究为小梅山猪遗传资源保护、假冒伪劣品种辨别提供了参考依据。
镉离子大肠杆菌生物传感器的构建及低温诱导灵敏度分析
Construction of an Escherichia coli Biosensor for Cd2+ and Sensitivity Analysis by Low-temperature Induction
伍贤军 杨红 盛怡 李萍萍
2018, 26(12): 2176-2184  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (2619 KB)  ( 266 )
摘要
微生物全细胞传感器被广泛用于评估有毒元素的生物可利用度和风险。但由于较低的灵敏度和较弱的选择性,其在环境中的使用仍然有限。本研究利用大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)作为传感器底盘菌株,pETDuet-1作为载体骨架,O/P-cadC (由cad操纵子的启动子元件和cadC基因构成) 作为传感模块,绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)基因gfp作为报告基因,构建对镉离子(Cd2+)响应的大肠杆菌全细胞传感器;通过荧光发射光谱和荧光显微镜检测传感器细胞在Cd2+诱导下的荧光强度;降低诱导温度,分析传感器灵敏度的变化。结果显示:成功构建一种以GFP为报告模块的大肠杆菌生物传感器E. coli BL21(DE3)_pO/P-cadC::gfp,在Cd2+诱导下发射强烈的荧光,且荧光强度依赖于Cd2+浓度;该传感器在37 ℃的诱导条件下最低检出浓度为1 mmol/L,但是在25和15 ℃的诱导条件下,最低检出浓度降为1 μmol/L和10 nmol/L,传感器灵敏度明显提高。该研究表明,诱导温度对传感器荧光强度有重要影响,低温下传感器灵敏度显著提高,这为利用微生物全细胞传感器检测生物可利用性Cd2+提供参考。
研究评述与展望
家畜脊椎数性状相关基因研究进展
Advances in Genes Associated with Vertebral Number Trait in Livestock
孙庆 贺小云 周梅 李青 田志龙 狄冉 胡文萍 王翔宇 刘秋月 储明星
2018, 26(12): 2142-2149  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (1127 KB)  ( 287 )
摘要
脊椎数性状是家畜的一个重要经济性状,多脊椎现象指家畜的胸腰椎数目增多。脊椎数目的增多会使动物的体型加长,产肉量、产毛量和皮肤面积增加,适应性增强,饲料利用率也有所提升。因为脊椎数性状遗传力较高,所以可以进行定向选择并培育多脊椎数的家畜品种。猪(Sus scrofa)脊椎数性状的研究目前取得了较多成果,而绵羊(Ovis aries)、黄牛(Bos taurus)、牦牛(Bos grunniens)等家畜脊椎数性状的研究成果相对较少,文章概述了家畜脊椎数性状基因定位的研究进展,并简要阐述了高通量测序为家畜脊椎数数性状相关基因定位研究带来的新机遇,以期为选育多脊椎家畜群体提供参考。
哺乳动物卵母细胞减数分裂纺锤体装配研究进展
Progress in Spindle Assembly in Meiosis of Mammalian Oocytes
张俊玉 吕珊 王丽丽 雷安民
2018, 26(12): 2150-2159  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (2152 KB)  ( 267 )
摘要
哺乳动物卵母细胞和早期胚胎发育过程中,染色体错误分离导致胚胎非整倍性并致使妊娠终止。在有丝分裂中,中心体作为主要的微管组织中心(microtubule organizing centers, MTOCs)来起始微管的成核及纺锤体的两极化。而哺乳动物卵母细胞在进行减数分裂之前中心体被降解,纺锤体的装配需要替补途径(包括RanGTP途径, Augmin, CPC途径, aMTOC途径等)来起始微管的成核及后续的组装过程。本文综述了在哺乳动物卵母细胞中不依赖于中心体的纺锤体装配及相关过程,讨论不同哺乳动物卵母细胞中纺锤体装配过程的差异及与非整倍体的关系,以期从为哺乳动物非整倍体形成及染色体错误分离机制的研究提供借鉴。
 
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