本研究旨在利用毕赤酵母(Pichia pastoris)系统融合表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)的培养滤液蛋白10(culture filter protein 10, CFP10)和早期分泌抗原靶6蛋白(earlier secreted antigen target 6, ESAT6)，并评价其作为牛结核病外周血γ-干扰素(interferon gamma, IFN-γ)体外释放实验特异性刺激剂来诊断牛结核病的应用潜能。通过PCR扩增cfp10-esat6融合基因，构建pPICZαA-(cfp10-esat6)重组质粒，电转化毕赤酵母GS115，添加甲醇至终浓度1.0%，诱导3 d，取培养上清进行SDS-PAGE分析，镍离子金属螯合亲和层析柱纯化目的蛋白，Western blot分析重组蛋白的免疫反应性；取纯化的融合蛋白CFP10-ESAT6作为刺激剂用于牛结核病外周血IFN-γ体外释放实验，评价其牛结核病诊断价值。结果表明，目的蛋白(33 kD)被成功分泌表达，该融合蛋白与抗CFP10、ESAT6、组氨酸标签和c-Myc4种单抗均发生特异性反应，具有较好的免疫反应性。165份奶牛外周血样品的IFN-γ检测结果表明，CFP10-ESAT6融合蛋白与结核菌素纯蛋白衍生物(purified protein derivative, PPD)作为刺激剂，二者阳性符合率为82.3%，阴性符合率为78.8%。本研究利用酵母表达系统成功表达CFP10-ESAT6融合蛋白，并表现出更高的生物学活性，在牛结核病外周血IFN-γ体外释放实验中可作为候选刺激剂，并能克服混合感染导致的PPD漏检问题，从而进一步提高检测的敏感性和特异性。

转基因技术是目前具有极大应用前景的生物技术之一，利用转基因技术培育转基因动物已有30年的发展历史。任何转基因动物及其产品进入食物链之前必须经过严格的生物安全评价，其中食用安全评价是其中重要的组成部分。本文参阅部分国内外文献，结合近几年从事国家转基因生物食用安全评价方面的研究，对国内外转基因动物及产品食用安全评价的现状和发展趋势进行了综述，期望为中国转基因动物及其产品的生物安全评价体系提供参考。

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)属于雌配子异形染色体性别决定机制(ZW/ZZ)，其W染色体包含的大量重复序列阻碍了W染色体序列的精确组装。目前只有物理图谱可以有效地解决由重复序列所造成的组装难题。本研究在已有物理图谱和遗传图谱的基础上，利用3D(three-dimensional)-BAC(bacterial artificial chromosome)池构建和PCR筛选策略进行了性别连锁标记的物理定位。首先将所选44个384孔板的BAC克隆进行接种和预培养，再接种到4个96孔深孔板中。将每两个384孔微孔板的BAC克隆分别汇集获得相应的板池、行池和列池，在提取DNA后，再将相应板池的部分DNA混合得到超级池。最终构建的3D-BAC池，共包括22个超级池和440个基池，覆盖半滑舌鳎基因组4.2倍，完成一个阳性超级池的基池筛选只需24个反应(20个BAC基池和4个对照)。然后选用159个半滑舌鳎性别连锁标记对这些克隆池进行两步PCR筛选。在对超级池的筛选中，有142个标记获得阳性扩增。对这些阳性超级池进行基池筛选后，最终有100个标记得到准确定位。定位到半滑舌鳎物理图谱的84个重叠群(contigs)和20个单个克隆(singletons)上，共计1 760个克隆，包含有21 927个共享条带，物理长度为42.4 Mb，覆盖半滑舌鳎基因组约5.3%；确定一个定位关系(contig与标记之间的)平均使用了2.2个克隆。在这些标记中，有17个同时定位到了两个或两个以上的contigs上，有11个标记同时定位到contigs和singletons上。另外有19个contigs定位了2个或2个以上标记。这些性别连锁标记的物理定位将有助于半滑舌鳎性染色体基因组序列的精确组装。

本研究旨在探讨草鱼(Ctenopharyngodon idellus)不同脆化阶段的肠道菌群组成结构、血清酶活性及生长性能，进而衡量脆肉鲩形成过程中的生理生化变化，以期为脆肉鲩的健康养殖提供科学数据。脆化不同阶段(30、60、90和120 d) 的草鱼，在脆化结束后转投喂人工配合饲料30 d(第150天)，鉴定整个过程中草鱼肠道菌群组成、血清酶活性和生长性能的变化。结果表明，60~150 d蚕豆组草鱼体重均低于对照组(P＜0.05, P＜0.01)，90~120 d蚕豆组草鱼头肾体指数(head kidney somatic index, HKBI)和肝体指数(hepatosomatic index, HSI)均低于对照组(P＜0.05或P＜0.01)，150 d时蚕豆组草鱼肝体指数与对照组无显著差异(P＞0.05)；蚕豆组草鱼血清碱性磷酸酶、溶菌酶和补体C3(第30天除外)活性均低于对照组的，在转投喂饲料后，3种血清酶活性均出现回升趋势；与对照组相比，蚕豆组草鱼肠道菌群多样性降低，芽胞杆菌属(Bacillus)和鲸杆菌属(Cetobacterium)等有益菌数量减少，维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)、温和气单胞菌(Aeromonas sobria)和鳗弧菌(Vibrio anguillarum)等条件致病菌数量增多。两组草鱼肠道核心菌群主要为变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和梭杆菌门(Fusobacteria)。本研究结果提示，随着脆化时间的增加，摄食蚕豆改变草鱼肠道菌群组成、抑制血清酶活性和生长性能，在转投饲料后其肠道菌群、血清酶活性及生长性能均有所改善。本研究结果对脆肉鲩的健康养殖具有重要的科学指导意义。

MYB基因家族在植物应对外界生物和非生物胁迫的过程中有重要的调控作用。本研究利用二倍体雷蒙德氏棉 (Gossypium raimondii) 基因组数据库，从陆地棉(G. hirsutum)品种鲁棉研32号中克隆到一个新的MYB转录因子GhMYB11(GenBank登录号: HQ234875.1)，cDNA全长1 001 bp，开放阅读框828 bp。通过与模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana) 和主要作物小麦(Triticum aestivum L.)、玉米(Zea mays L.)、水稻(Oryza sativa L.) MYB蛋白的氨基酸序列比对发现，GhMYB11蛋白与拟南芥中脱落酸(abscisic acid, ABA)合成和信号传导的重要基因AtMYB13/14编码的蛋白高度相似 (E 值分别为7e-83 和 1e-90)， 含两个高度保守的MYB结构域R2R3及一个转录激活结构域。实时定量PCR分析发现，GhMYB11基因在黄萎病菌(Verticillium dahliae)侵染、干旱、盐和氧化胁迫处理后的棉花幼苗叶片中表达显著上调。GhMYB11基因可能在棉花生物和非生物胁迫反应中起重要调控作用，是陆地棉品种抗逆性遗传改良的重要候选基因。本研究为利用基因工程手段提高棉花抗逆性提供了基础材料。

抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX)是清除活性氧(reactive oxygen species, ROS)的重要酶类。本研究对针刺接种黑粉菌(Sporisorium scitamineum)后的抗、感基因型甘蔗(Saccharum officinarum)进行APX活性测定。结果表明，甘蔗接种黑穗病菌48 h内，抗病品种(崖城05-179) APX活性显著高于感病品种(柳城03-182) (P＜0.05)。借助电子克隆技术，结合RT-PCR方法，从甘蔗中分离到一个APX基因，并命名为ScAPX(GenBank登录号: KJ7565501)。生物信息学分析显示，ScAPX基因全长1 171 bp，包含一个1 038 bp的完整开放阅读框，编码345个氨基酸。ScAPX编码的蛋白不含信号肽，推测其为非分泌蛋白，定位于线粒体基质和叶绿体基质中的概率分别为91.1%和88.7%。实时荧光定量PCR检测结果显示，ScAPX在甘蔗根、芽、叶、蔗皮和蔗髓中均有表达，为组成型表达基因，表达量在蔗皮中最高，叶中最低，前者是后者的19.7倍；在外源因子处理后0~48 h，ScAPX基因的表达受水杨酸(salicylic acid, SA)、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)、过氧化氢(hydrogen peroxide, H2O2)、脱落酸(abscisic acid, ABA)、氯化钠(sodium chloride, NaCl)和聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)诱导，SA、MeJA和H2O2处理后的ScAPX转录本积累量峰值较外源激素(ABA)和环境(NaCl和PEG)胁迫早。前者的ScAPX转录本变化呈现出胁迫初期积累量增加，达到峰值后又逐步下降的特点；在同样的测试时间(处理后24 h)内，ABA、NaCl和PEG处理后ScAPX转录本在达到峰值后未见下降。虽然在外源胁迫下，ScAPX表达量变化存在明显差异，但其表达均表现出正响应上述外源因子对甘蔗的胁迫。本研究为后续深入鉴定该基因的功能与进一步应用提供基础资料。

细胞色素P450 (cytochrome P450, CYP450)是高等植物中最大的酶蛋白家族之一，广泛参与植物的次生代谢和抗逆生理。本研究采用同源克隆和cDNA末端快速克隆(rapid-amplification of cDNA ends, RACE)技术，获得苦荞(Fagopyrum tataricum) CYP81家族同源基因FtP450-R4 (GenBank登录号: KM271986)。FtP450-R4 cDNA全长1 770 bp，5'-UTR为49 bp，3'-UTR为194 bp，ORF为1 527 bp，其ORF序列可编码508个氨基酸残基的蛋白。生物信息学分析表明，FtP450-R4蛋白通过N-端4~24位氨基酸残基定位于内质网，与F3'H (flavonoid 3'-hydroxylase)、I2'H (isoflavone 2'-hydroxylase)和其他CYP450的同源性在44%~46%之间；多重序列比对显示，FtP450-R4具有CYP450中经典的基序和保守序列，但不含F3'H的特征基序(GGEK)；系统进化树分析显示，FtP450-R4与拟南芥(Arabidopsis thaliana) CYP81家族和I2'H聚为一大簇，说明其可能参与苦荞黄酮类化合物的羟化或对逆境胁迫的应答。UV-B、寒冷和干旱均能引起FtP450-R4在苦荞子叶中表达量的显著变化，而在胚轴中其表达量变化不显著。利用大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)菌株对FtP450-R4蛋白进行了可溶性表达，活性鉴定表明，重组FtP450-R4蛋白能以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate, NADPH)和山奈酚为底物进行酶促反应，具有生物学活性。本研究可为了解CYP450在黄酮合成代谢中的功能，明确苦荞黄酮代谢调控的分子机制提供了基础资料。

为了解大麦(Hordeum vulgare)亲本材料遗传多样性，筛选与大麦条纹病性状相关联的SSR标记，利用100对多态性SSR引物对86个大麦品种进行分析，共检测出269个等位变异，平均每对引物为2.69个，变幅为2~5；等位基因频率为0.012~0.988；Shannon指数为0.064~1.385；遗传相似系数为0.547~0.955；多态性信息含量(polymorphic information content, PIC)为0.023~0.737，平均为0.357。群体遗传结构分析表明，供试大麦亲本材料可分为5个亚群。根据一般线性模型(general linear model, GLM)分析，共5个标记与大麦条纹病抗性性状关联，解释率在6.20%~11.15%之间，其中TACMD和MGB317达到极显著水平(P＜0.01)，解释率分别为9.24%和9.45%；根据混合线性模型(mixed linear model, MLM)分析，发现3个与大麦条纹病抗性相关的标记，解释率在4.57%~17.63%之间，标记HVM54达到极显著水平(P＜0.01)，解释率为17.63%。本研究为大麦条纹病抗病育种提供了一定理论依据。

密码子使用偏好性普遍存在于各种生物中，但突变和自然选择压力对每种生物密码子使用偏好性不同。WRKY基因家族是一类只存在于植物的转录因子，主要参与植物体内转录调控和信号转导过程。本研究以蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)WRKY转录因子(MtWRKY)为研究对象，揭示MtWRKY基因密码子使用偏好性形成的主要因素，并筛选最优密码子。研究结果表明，代表MtWRKY基因的点均分布在有效密码子数(effective number of codons, ENC)标准曲线以下，表明密码子受自然选择压力或突变选择压力或其他因素影响；密码子第1、2位平均GC含量(GC12)与密码子第3位GC含量(GC3)相关性分析发现，GC12与GC3呈显著正相关(r=0.34, P＜0.01)，表明突变压力导致密码子3个位点具有相似的GC含量；GC3s值分布在0.2~0.5之间，表明密码子使用偏好性主要受突变压力影响。奇偶偏好分析表明，MtWRKY基因第3位密码子CT含量＞AG含量。G和C(或者A和T)不成比例分布在密码子第3位上，表明密码子使用偏好性受到自然选择压力影响，但很可能突变压力仍起主要作用。最优密码子使用频率(frequency of optimal codons, Fop)与GC含量以及序列长度相关性分析发现，Fop与外显子GC含量呈显著正相关(r=0.57, P＜0.01)，而与内含子GC含量呈较弱正相关(r=0.09, P＞0.05)；Fop与外显子序列的长度呈正相关(r=0.28, P＜0.05)，而与内含子长度呈负相关(r=-0.01, P＞0.05)。表明MtWRKY基因外显子和内含子序列的形成受不同选择压力影响；外显子密码子使用偏好性受突变压力影响，而内含子可能是由于自然选择压力作用于突变选择形成的。确定了4个以G或C结尾的最优密码子。研究结果为WRKY转基因研究过程中密码子优化提供了理论支持。

线粒体融合蛋白2基因(mitofusin2, Mfn2)参与细胞凋亡和细胞周期调控，在卵母细胞和胎盘发育中起着重要作用。本研究旨在探讨Mfn2基因对小鼠(Mus musculus)卵母细胞体外成熟过程的影响。从小鼠卵巢中克隆Mfn2基因并构建pMfn2-Venus真核表达载体。经脂质体2000介导重组质粒pMfn2-Venus转染293T细胞(病毒包装细胞)，确认重组质粒在293T细胞内的表达及定位。将pMfn2-Venus体外转录为cRNA，并注射入小鼠卵细胞中，进行体外成熟培养，并统计卵母细胞生发泡破裂(germinalvesiclebreakdown,GVBD)发生率以及第一极体(first polarbody, PB1)排出率，荧光显微镜下观察其表达及定位。结果显示，注射了Mfn2-Venus cRNA的卵母细胞，其GVBD发生率以及PB1排出率与对照组相比显著降低(P＜0.0001, P＜0.05)。本研究首次揭示了Mfn2基因对小鼠卵母细胞体外成熟过程的影响，为卵母细胞体外成熟的研究提供了一个新方向，同时也为研究减数分裂过程中Mfn2基因提供了一个平台。

microRNA(miRNA) 是一类内源性的非编码RNA，广泛参与细胞的生长发育、分化、增殖和凋亡等生物学过程。为了研究miR-let-7a对猪(Sus scrofa)甲状腺的生长发育及甲状腺细胞凋亡的调控作用，本研究利用免疫荧光技术鉴定了大白猪的甲状腺组织及体外培养的甲状腺细胞，利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测了miR-let-7a在不同生长阶段大白猪甲状腺组织中的表达量变化，通过转染miR-let-7a mimics并利用流式细胞术检测了转染组与未转染组的甲状腺细胞凋亡率的差异性，同时预测了miR-let-7a与细胞凋亡相关基因的靶向关系。结果发现，甲状腺组织和细胞中的甲状腺球蛋白(thyroglobulin,TG)发出绿色荧光，表明体外培养的甲状腺细胞功能正常。qRT-PCR结果显示，胚胎期随着胚龄的增加，miR-let-7a 表达量逐渐增加。出生后miR-let-7a 表达量下降，于60日龄达生长期最小值，之后有所上升，至90日龄后其表达量再次下降，120日龄后随日龄的增加let-7a表达量呈现逐渐增加的趋势。凋亡结果发现，和对照组相比，转染组细胞凋亡率明显升高(P＜0.05)。根据研究结果推测，miR-let-7a的表达直接或间接影响了甲状腺细胞凋亡的调控过程。研究结果为深入研究猪甲状腺miR-let-7a 的功能机制提供了有益的线索。

诱导细胞凋亡的DFF45样效应因子c (cell death-inducing DFFA-like effector c, CIDEC)与脂肪分化密切相关，具有促进脂肪沉积的作用。本研究利用PCR技术克隆了绵羊(Ovis aries) CIDEC基因，并对其序列进行生物信息学分析；采用半定量RT-PCR方法检测了该基因在绵羊主要组织中的表达；同时利用实时荧光定量PCR技术检测了持续饥饿与充足采食状态下阿勒泰羊尾脂CIDEC的差异表达情况。研究结果表明，获得了绵羊CIDEC基因的cDNA序列(GenBank登录号: KM199684)，其中编码区(coding sequences, CDS)全长714 bp，编码237个氨基酸。经预测CIDEC蛋白存在多个磷酸化位点和蛋白激酶C磷酸化位点。半定量RT-PCR结果显示，CIDEC仅在阿勒泰羊脂肪组织中表达，其中在尾脂中高丰度表达，而在肠系膜脂肪中表达丰度较低。经过持续4周的完全禁食后，CIDEC在阿勒泰羊尾脂组织中表达急剧下降，表达量极显著低于正常充足采食状态(P＜0.01)。表明该基因在阿勒泰羊尾脂沉积过程中具有一定的调控作用。研究结果为进一步揭示CIDEC基因在绵羊尾脂组织中的功能提供了参考资料。

钙调磷酸酶催化亚基A(protein phosphatase 3 catalytic A, PPP3CA)是PPP3C在骨骼肌中的主要亚型，在肌纤维分化中起重要作用。为研究PPP3CA基因在不同品种鸭(Anas platyrhynchos domestica) 发育早期肌肉中的表达规律及其与肌纤维特性的相关性，本研究选用生长速度差异较大的金定鸭和高邮鸭，采用实时荧光定量PCR检测鸭13、17、21、25和27胚龄及7日龄胸肌和腿肌中PPP3CA mRNA的表达水平。结果表明，两鸭种同一肌肉组织中PPP3CA mRNA的表达表现出显著的时间特异性，而品种和性别效应并不显著。两鸭品种胸肌和腿肌中PPP3CA mRNA的表达模式虽不同，但均是在13胚龄(13 embryonic day, E13 d)时最高，且在出雏后7日龄时极显著高于27胚龄(出雏前)(P＜0.01)。胸肌中PPP3CA mRNA在21胚龄时显著低于其他各胚龄或日龄(P＜0.01)；腿肌中PPP3CA mRNA在21胚龄时表达量较高，27胚龄时降到最低，且极显著低于其他各胚龄或日龄(P＜0.01)。相关性分析结果显示，两鸭品种腿肌PPP3CA mRNA表达量与本研究前期检测的肌纤维类型、直径、面积和密度等肌纤维特性呈现不同程度的线性相关；两鸭品种胸肌和腿肌PPP3CA mRNA表达量与均与本研究前期检测的类胰岛素生长因子(insulin-like grow factor-Ⅰ, IGF-Ⅰ)mRNA表达量呈显著的正相关(P＜0.05或P＜0.01)。初步推测鸭发育早期骨骼肌中PPP3与肌纤维类型和肌纤维生长发育密切相关，与IGF-Ⅰ可能共同参与了对骨骼肌生长发育的调节。本研究结果将有助于了解PPP3在鸭肌肉早期发育中的作用，并为改良鸭肉品质提供理论依据。

细胞色素P450(cytochrome P450, CYP)涉及许多昆虫生理功能，包括对信号分子的代谢、宿主植物的适应性及杀虫剂的抗性等。鳞翅目(Lepidoptera)昆虫的种类仅次于鞘翅目(Coleoptera)，包含了大量的农业害虫。根据鳞翅目烟草天蛾(Manduca sexta L.)的基因组数据，开展CYPs的全基因组学分析，在该基因组中发现了110个可能的CYPs，可分为29个家族，其中有大量CYPs以串联重复形式排列。将分析所得序列与蝶类昆虫黑脉金斑蝶(Danaus plexippus L.)和模式昆虫家蚕(Bombyx mori L.)的CYPs进行比较基因组学分析，结果表明，在CYP2与线粒体集团(clan)中存在12对CYPs直向同源基因，而CYP3与CYP4集团的CYPs呈现种属特异性扩增趋势。通过比较分析鳞翅目昆虫与其他非鳞翅目昆虫的CYPs发现，鳞翅目昆虫之间不仅存在更多的直向同源基因对，而且鉴别出的直向同源基因群也更多，但出现新的家族与亚家族数量相对较少。不同鳞翅目昆虫基因组中的CYPs存在相当广泛的线性保守现象。这些不同昆虫间的比较基因组学分析将促进鳞翅目昆虫CYPs的研究，也有助于害虫治理新靶标的选择。

猪传染性胃肠炎(swine transmissble gastroenteritis, TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Swine transmissible gastroenteritis virus, TGEV)引起的一种高度传染性的猪病毒性疾病。为探讨朱砂七(Polygonum cillinerve)多糖对TGEV的体外抑制作用，本研究以猪(Sus scrofa)睾丸(swine testis, ST)细胞为实验材料，通过先加药后接毒、先接毒后加药及药物与病毒混合感作3种给药方式，采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐法MTT法)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测不同浓度的朱砂七多糖对TGEV在ST细胞的体外抗吸附、直接杀灭和抑制增殖作用。MTT法结果显示，朱砂七多糖对ST细胞的最大无毒浓度(TC0)为20 μg/mL；最大安全浓度(20 μg/mL)时，对TGEV的抗吸附作用最好，抑制率达85.2%；对体外增殖的抑制率达78.4%；直接灭活作用抑制率达74.4%，且抑制率与浓度呈正相关。qRT-PCR检测结果表明，朱砂七多糖在3种给药方式下均能在转录水平显著降低TGEV N mRNA相对表达量，与病毒对照组相比差异极显著(P＜0.01)，并存在一定的剂量依赖性。研究结果表明，朱砂七多糖对TGEV在ST细胞上增殖有抑制作用，不同给药方式有所差异，其中以先加药后接毒给药方式的预防作用效果最佳。本研究初步证实了朱砂七多糖的体外抗TGEV作用，为朱砂七资源的开发和综合利用提供了依据。

小型猪近交系是中国农业科学院北京畜牧兽医研究所以2头五指山猪(Sus scrofa)为系祖，历时15年，采用“近亲交配”、提高营养水平、同期发情以及笼架等饲养技术，逐步克服后代畸形率高、弱仔率高、成活率低等3大阶段性难题，育成国际上首个近交系猪。本文介绍小型猪近交系的培育过程、近交系研究鉴定、新遗传资源种质特性，以及开发利用。该研究成果填补了国内外近交系猪的研究空白，为大型哺乳近交系动物培育理论和应用研究提供了新的视角。