农业生物技术学报

Mechanism of Fungal Pathogenesis in Insect and
Strain Improvement by Gene Engineering

裴炎方卫国张永军

2003, 11(3): 221-226 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要：随着大量施用化学农药所造成的环境污染等问题日益突出，真菌杀虫剂的研究和开发受到了广泛的关注。由于存在击倒昆虫时间较长、对环境条件要求高等缺点，昆虫病原真菌的广泛应用受到限制。因此，有必要弄清昆虫病原真菌致病寄主过程的遗传学和分子生物学机理，找出控制毒力的主效基因。在此基础上，利用基因工程和细胞工程等技术提高菌株毒力，创造出更适合市场需要的真菌杀虫剂。文章重点介绍了近年来有关昆虫病原真菌致病机理的研究进展，包括侵染寄主过程中附着胞的形成、降解昆虫体壁的分子机理和昆虫病原真菌的毒素等。同时，还介绍了昆虫病原真菌的遗传转化方法和基因工程改良的一些新进展。

germin基因的克隆及其在烟草中的表达

Cloning of germin Gene and Its Expression in Tobacco

王冰山1 窦道龙2 张猛3 王志兴1 贾士荣1

2003, 11(3): 233-235 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要：克隆了具有草酸氧化酶活性的小麦(Triticum aestivum )Germin蛋白的基因，构建了植物表达载体并用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens )介导法转化烟草。Southern杂交和酶活性检测表明，germin基因在转基因烟草(Nicotiana tabacum )中得到整合、表达，并正确组合成具有草酸氧化酶活性的同源六聚体蛋白。离体实验表明，外源germin基因的表达提高了转基因烟草离体叶片对草酸的耐受性。

抗除草剂基因导入旱稻（Oryza sativa）栽培品种

To Transfer Anti-herbicide Gene into Upland Rice (Oryza sativa)Cultivars

腊红桂1 王化琪1** 黄大年2 华志华2 颜美仙2 高振宇2 冯秀晶1

2003, 11(3): 227-232 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要：以生产上优良旱稻（Oryza sativa L. ）新品种旱稻297、旱稻10号等的幼胚愈伤组织为转化受体材料，用基因枪法把抗Basta除草剂的bar基因导入了这些品种的愈伤组织，经两轮Basta抗性筛选和分化获得了再生植株，对再生植株进行PCR扩增和Southern杂交检测，T0和T1代Basta抗性实验表明，bar基因已整合到旱稻的基因组DNA中，并在T1代继续表达。对各品种幼胚培养的诱导、分化培养基实验表明，MB和MS培养基可作为这5个品种的愈伤组织诱导培养基，改良的RMB2、RMS2培养基可显著地提高愈伤组织的分化频率。实验所获得的转基因植株和建立的遗传转化系统，为旱稻的抗除草剂分子育种和其它基因转化奠定了初步的基础。

一个新的马铃薯patatin classⅠ基因的cDNA
在烟草中的表达及其酶活性

Expression of a Novel Potato Patatin ClassⅠ cDNA in Transgenic Tobacco and Its Lipid Acylhydrolase Activity

司怀军1 柳俊2 谢从华1**

2003, 11(3): 236-240 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要：将马铃薯(Solanum tuberosum )块茎特异蛋白patatin classⅠ基因cDNA与CaMV 35S启动子融合，构建了植物表达载体pBSSP。用电激法将表达载体导入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404，然后转化烟草(Nicotiana tabacum )叶片获得再生植株。经PCR、PCR-Southern、Northern杂交和蛋白质检测，证明patatin classⅠ基因cDNA已整合到烟草基因组中并在转基因植株中转录和表达。酯酰水解酶（lipid acylhydrolase, LAH）活性分析显示，转基因烟草植株的叶片中LAH活性明显提高。

粳稻云引抗稻瘟病基因的遗传分析及其定位

Genetic Analysis and Mapping of Blast-resistance Genes in japonica Rice
Yunyin from Yunnan Province

张建福1 王国英1 ** 谢华安2 凌忠专3

2003, 11(3): 241-244 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要：用8个稻瘟病菌[Pyricularia grisea (Cooke) Sacc.]系对稻瘟病抗性材料云引进行田间注射接种鉴定。结果表明，云引对接种的8个菌系均表现为抗病反应。用抗病材料云引和感病材料丽江新团黑谷作亲本杂交获得F1，F1自交获得F2群体，用上述8个菌系分别对亲本、F1和F2群体进行田间注射接种，鉴定结果表明云引对所有8个菌系的抗性均表现为单基因控制的分离特性（抗感分离比为3∶1）。利用微卫星标记将云引对四川-43菌系的抗性基因初步定位于水稻的第11号染色体上，与标记RM202的遗传距离为3.8 cM。

一种新的精子膜蛋白sp18基因的克隆及其在E.coli 中的表达

Cloning of a New Sperm Membrane Protein sp18 Gene and Its Expression in E. coli

柏家林1 苟克勉1,2 安晓荣1,2 李瑞国1 侯健1,2 陈永福1,2**

2003, 11(3): 268-272 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要：利用sp18 mAb筛选小鼠睾丸λgt11-cDNA表达文库，命名为sp18（GenBank登录号：AF129872）的阳性克隆由 1 468 bp组成，开放阅读框（open reading frame， ORF）长约429 bp，编码142个氨基酸。起始密码ATG位于第694 bp,终止密码位于第1 122 bp，polyA位于1 245~1 250 bp。核苷酸同源性分析表明，sp18 cDNA的10~651 bp与人视神经Hr44的532~ 1 173 bp、sp18 cDNA的10~816 bp、864~1 444 bp与牛视神经Hr44的1 408~2 208 bp、2 250~2 309 bp的cDNA序列有很高的同源性, 高达98%。推测sp18基因可能是生殖系统存在的一种新基因。sp18编码蛋白的理论分子量约为15.7 kD，有8个N-糖基化位点和12个O-糖基化位点，亲水性分析表明sp18多肽是一种精子跨膜蛋白，跨膜区位于第17~33氨基酸处。将sp18 cDNA亚克隆到原核表达载体pET-30a(+)，在E. coli BL21（DE3）中得到诱导表达，其表观分子量约为16.5 kD，表达量约占菌体总蛋白的32%。Western blot分析表明sp18 mAb能识别重组的sp18膜蛋白，表明重组蛋白具有免疫原性，为进一步研究sp18基因的功能打下了基础。

稗内脐蠕孢菌（Drechslera monoceras）原生质体制备和再生

Preparation and Regenaration of Drechslera monoceras Protoplast

段桂芳黄世文** 颜秋生余柳青

2003, 11(3): 245-248 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要：研究了菌龄、酶浓度、渗透压稳定剂、缓冲液pH值以及酶解温度和时间等因子对稗内脐蠕孢菌（Drechslera monoceras）原生质体形成的影响。将培养42 h的菌丝，以0.7 mol/L KCl作为渗透压稳定剂，在30 ℃, pH 4.4～5.8条件下，经2%溶壁酶和2%纤维素酶混合酶液酶解4 h，静止条件下原生质体最大释放量达1×106/mL,再生率为0.15%。

影响人参发根皂苷含量基因rolC的克隆与序列分析

Impact of TL-DNA on Content of Ginsenosides in Ginseng Hairy Roots and Cloning and Sequence Analysis of rolC Gene

赵寿经1 李昌禹2 钱延春1 石晶1 刘庆昌3

2003, 11(3): 249-252 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要：通过发根农杆菌?穴Agrobacterium rhizogenes ?雪与人参?穴Panax ginseng C. A. Mey?雪根外植体共培养，用直接接菌方法诱导出人参发根。培养4周后人参发根的总皂苷含量达到栽培3年生人参皂苷含量的水平，单体皂苷Rb1含量明显提高，说明TL-DNA具有影响人参皂苷生物合成的能力。根据Slightom等RiA4TL-DNA序列分析结果，利用PCR方法从人参发根中扩增并克隆了影响人参皂苷合成的基因rolC。与已发表序列相比较，核苷酸序列的同源性为99.9%。

氮源比例和不同碳源对珠美海棠离体叶片再生不定芽的影响

Influences of Nitrogen Ratio and Carbon Sources on Adventitious Shoots Regeneration of Malus zumi Leaves In Vitro

李宝韩振海**

2003, 11(3): 253-258 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要：以珠美海棠（Malus zumi Mats）苗叶片为试材，对影响离体叶片再生的因素进行了研究。结果表明：培养基的成分可以显著地影响叶片再生。在激素组合中，BA浓度变化对再生影响较小，而NAA浓度的变化影响较大。MS培养基氮源中，NO3-与NH4+比例以2∶1最好（2∶1MS，即常规MS），3∶1MS和4∶1MS次之，1∶1MS最差。4种碳源（果糖、蔗糖、葡萄糖、山梨醇）中，果糖明显优于其它3种。适宜的培养基组成为：MS盐、维生素，BA（2.5 mg/L）+NAA（0.25 mg/L），果糖（30 g/L），琼脂8 g/L，pH 5.8。叶片再生率为97%，平均再生芽数为5.6个。对碳源影响再生的可能原因进行了讨论。

AS-PCR技术检测鸡EX-FABP基因型方法的建立

Establishment of the Method for Identifying the
Extracellular Fatty Acid Binding Protein Genotypes with Allele-specific-PCR

赵春江李宁* 邓学梅

2003, 11(3): 273-275 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要：鸡(Gallus gallus )胞外脂肪酸结合蛋白(extracelluar fatty acid binding protein, EX-FABP)基因型与鸡腹脂量的积累密切相关。尝试了用等位基因特异性PCR(allele-Specific PCR, AS-PCR) 技术检测EX-FABP基因型的方法，确定了检测的参数和方案, 对AS-PCR检验单碱基突变的方法和策略进行了讨论,并在此基础上对该技术进行了改进，建立了等位基因特异性片段长度差异PCR（allele-specific and length-different PCR, ASLD PCR）技术。

培养马氏珠母贝外套膜上皮细胞分泌物的分析

Analysis of the Secreted Materials from Epithelial Cells Cultured on Mantle of Pearl Oyster（Pinctada martensii）

王爱民1 阎冰2 苏琼2 叶力2 陈文广2

2003, 11(3): 285-290 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要：利用本实验室建立的组织培养技术，成功地培养了马氏珠母贝（Pinctada martensii）外套膜组织，其上皮细胞能够保持旺盛的分泌功能。用偏光显微镜、扫描电镜及X-射线能谱分析仪对上皮细胞分泌物观察。结果表明：培养的外套膜上皮细胞分泌的珍珠质是由碳酸钙结晶形成的片层叠加而成，其间有有机膜粘结；碳酸钙片层由扁平块构成；随着培养时间的延长，上皮细胞分泌的珍珠质数量不断增加，颗粒不断变大；最初形成的珍珠质中有机物成分较多，可能与珍珠质的核化有关。该研究为进一步探索体外培养珍珠，实现“试管珍珠”提供了实验依据。

半夏的组织培养及其成分比较

Tissue Culture and Component Analysis of Pinellia ternata

郭余龙贾永芳杨星勇* 李名扬裴炎

2003, 11(3): 259-262 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要：三叶半夏(Pinellia ternata Breit. )叶柄切段在含BA 0.5~2.0 mg/L和NAA 0.2 mg/L的MS培养基上，诱导小块茎的频率最高可达100%，小块茎用BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L的MS培养基增殖，3周内增殖频率达16.9倍，小块茎易于生根移栽。应用组织培养技术大批量生产优质半夏种苗是可行的。组织培养和野生的块茎分别用80%甲醇、0.2 mol/L硫酸、去离子水提取内含物，经HPLC分析，比较其图谱表明, 组织培养块茎中各成分的总含量高于野生块茎，二者的主成分构成相似。

猪胚胎干细胞培养、分离和传代

Culture , Isolation and Passage of Porcine Embryonic Stem Cells

董晓1,3 冯书堂1** 王占贺1,2 王端云1 郑行3

2003, 11(3): 263-267 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要:利用五指山小型猪近交系不同发育阶段的早期胚胎为材料，探索猪胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES)培养、分离、传代的影响因素，以选择猪胚胎干细胞建系的适宜条件。收集五指山猪第5～10 d胚胎(配种当天记为0 d)，以 STO细胞[STO细胞是来自SIM小鼠(S)胚胎对硫代鸟嘌呤(thioguanine,T)和乌本苷(ouabain,O)有抗性的成纤维细胞系]为饲养层，分别采用两种培养液: 杜氏培养液(Dulbecco's modified eagle medium ，DMEM) + 10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）+ 10 %新生牛血清（newborn bovine serum，NBS）+1 000 IU/mL白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）+ 30 ng/mL干细胞生长因子（stem cell growth factor , SCF）+20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor ，bFGF)或DMEM + 10% NBS + 10% FBS + 1 000 IU/mL LIF + 30 ng/mL SCF。比较发现，培养液中是否加入bFGF对胚胎干细胞的培养无显著影响；实验共收集胚胎124枚，其中D5～6胚胎18枚，胚胎贴壁率为68.8% ，内细胞团出现率为6.3% ，未能传代；收集D7孵化囊胚27枚，贴壁率为100% ，内细胞团出现率为38.9% ，传代1次失败；D9胚胎18枚，贴壁率为100%，传代后ES细胞生长较缓慢；收集D10胚胎52枚，胚胎贴壁率为100%，传代率为100%，传代后可出现ES细胞克隆点；实验过程中比较了胚径对干细胞培养的影响，发现胚径越大，培养效果越好，胚径大于100μm,分离ICM后出现干细胞集落成功率达100%，并得到了AP染色呈阳性的传4代的ES细胞集落。

突变型抑癌基因p53在蛋鸡J亚群禽白血病中的表达

Expression of Mutant Tumor Suppressor Gene p53 in Egg-type Chicken
Infected with Avian Leukosis Viruse Subgroup J

徐镔蕊1 董卫星2 何召庆1 余春明1 李宁1 冯小宇1 L.F.Lee3 Maoxiang Li3

2003, 11(3): 276-279 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要: 蛋鸡J亚群禽白血病是病毒引起的肿瘤性传染病。为了探讨J亚群禽白血病病毒的致癌分子机理, 观察蛋用型鸡发生J亚群禽白血病时p53抑癌基因在各脏器中的表达, 应用链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物免疫组化（SABC）法，研究了蛋用型鸡J亚群禽白血病自然病例的肝脏、肾脏、腺胃、肿瘤、输卵管、心脏、胰脏、骨髓、脾脏、肺脏、十二指肠、胸腺和法氏囊。结果表明：突变型p53在肝脏、肾脏、腺胃、肿瘤、输卵管中表达量最高，心脏、胰脏、骨髓、脾脏、肺脏、十二指肠、胸腺及法氏囊均可检出中等量的表达。这一结果提示突变型抑癌基因p53的表达参与蛋鸡J亚群禽白血病发生、发展过程。

利用转基因小鼠表达法氏囊病毒A片段的研究

Study on Expressing A Segment of Infectious Bursal
Deasease Virus to Milk in Transgenic Mice

林爱星周云胡宏宇侯建安晓荣陈永福**

2003, 11(3): 280-284 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要：将法氏囊病毒(IBDV)A片段定向连于乳腺特异性表达载体p7GMB53, 用于转基因实验, 用PCR和Southern杂交对阳性小鼠及其后代进行检测。共注射了879枚小鼠受精卵, 移植受体26只, 产仔39只。经PCR检测阳性6只（其中2只死胎），Southern杂交检测确定了2只阳性小鼠(1公1母)。外源基因整合的拷贝数分别为3拷贝（公）和9拷贝（母）。将两只阳性小鼠进行了传代，实验表明二者分别为种系纯合体及种系嵌合体。 ELISA 及Western blot检测认为阳性母鼠表达了IBDV 衣壳蛋白。初步验证了先前构建的含基质附着区序列（MARs）的乳腺表达载体能克服转基因的位置效应，实现转入目的基因的表达，提高乳腺反应器的制备效率。

NO合酶抑制剂 L-NAME和NO前体L-Arg
对小鼠体内卵母细胞成熟的影响

Effects of L-NAME and L-Arg on Meiotic Maturation of Mouse Oocyte in Vivo

卜淑敏1,2 夏国良1** 王松波1 汪建红1,3

2003, 11(3): 291-294 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要: 采用腹腔单独注射L-NAME(左旋硝基精氨酸甲基酯)或联合注射L-NAME和L-Arg, 取出卵母细胞体外观察，研究了NO对小鼠卵母细胞体内成熟的影响。结果表明,（1）单独注射5、10、20 mg / kg体重L-NAME均能显著抑制卵母细胞第一极体的释放(P <0.01)，尤以10 mg / kg 体重L-NAME组作用最为明显, 各剂量组对生发泡的破裂均无影响(P >0.05)；（2）10 mg / kg 体重L-NAME对卵母细胞成熟的抑制作用能被同时注射的100 mg / kg 或200 mg /kg 体重L-Arg逆转，其中以200 mg / kg体重作用最为明显;（3）L-NAME对卵母细胞畸形率的影响和培养时间有关，而对卵母细胞的存活率没有统计学影响。实验结果证明NO参与了小鼠卵母细胞的体内成熟调控。

在猪链球菌2型江苏分离株中发现新的orf2毒力相关基因

Detection of a New Virulence Associated Gene in Streptococcus suis
Type 2 Jiangsu Isolate

李干武姚火春陆承平**

2003, 11(3): 295-298 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要：根据文献报道的猪链球菌（Streptococcus suis ）2型一种新的毒力基因相关序列，设计和合成一对引物，以猪链球菌2型江苏分离株HA9801的DNA为模板，扩增推导的毒力基因的完整阅读框，并定向克隆到质粒载体pET-32a（+）中，经测序表明，与国外推测的毒力基因完全同源。此外，以猪链球菌和其它链球菌猪源的国内分离株的基因组DNA为模板，通过PCR技术，检测这一推测毒力基因的出现率。该基因在猪链球菌2型的阳性率为7/8，在其它猪源链球菌的阳性率为9/23，在猪源链球菌的总检出率为51.6%（16/31）。

激发子隐地蛋白基因介导的烟草抗病性研究

Studies on Tobacco Disease Resistances Mediated by Elicitor
Gene of Cryptogein fromPhytophthora cryptogea

蒋冬花1,2 郭泽建1 陈旭君1 程志强1 郑重1

2003, 11(3): 299-304 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要：从隐地疫霉（Phytophthora cryptogea）中克隆cryptogein（Crypt）激发子基因。针对病原菌侵染和Crypt基因的特点，选用能在根、茎、叶等的表皮细胞中特异性表达的、弱组成型并受病原菌诱导的水稻(Oryza sativa )苯丙氨酸解氨酶基因（PAL）的启动子；同时为了使表达的cryptogein蛋白能分泌到细胞外，更好地与植物细胞膜受体互作，在Crypt基因前还融合了病程相关蛋白PR1b的信号肽; 然后将此融合基因构建于植物表达载体CHF3中。通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefancens)介导的叶盘转化法转入烟草(Nicotiana tabacum )。经卡那霉素抗性筛选获22株再生植株，PCR检测都为阳性，部分植株的Southern杂交结果表明,Crypt基因已以低拷贝（1～2个）整合到烟草基因组中。抗病性测定结果表明,转化植株对烟草黑胫病菌(P. parasitica var. nicotianae )、赤星病菌(Alternaria alternata )和野火病菌(Pseudomonas syringae pv. tabaci )的抗性均有提高。

聂庆华张细权杨关福

2003, 11(3): 305-312 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要：神经内分泌生长轴，又称脑垂体生长轴，在动物的生长发育过程中发挥重要的调节作用。下丘脑分泌的生长抑素(somatostatin, SS)和生长激素释放激素(growth hormone releasing hormone, GHRH)、垂体分泌的鸡生长激素(chicken growth hormone, cGH )、靶器官（如肝脏）分泌的鸡生长激素受体(chicken growth hormone receptor, cGHR)和胰岛素样生长因子-Ⅰ(insulin-like growth factor-Ⅰ, IGF-Ⅰ)，以及下丘脑-垂体-靶器官作用通路构成了鸡生长轴的基本内容。介绍了近几年来鸡生长轴的各激素（因子）及其受体的基因研究，以及相互间的作用机制，以进一步探索家禽的生长调控机理。

家畜类腔前卵泡的体外分离方法和培养体系研究进展

Advances of the Research on Isolation and Culture for the Domestic Preantral Follicles In Vitro

刘瑞华1 李明1,2 焦丽红1 郑行2 王红1* *

2003, 11(3): 313-317 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要：在哺乳动物体内，启动卵泡生长的机制还不完全清楚，卵泡的体外培养遇到较大困难；由于不同物种卵泡的成熟时间和调节机理有较大差异，因此它们的体外培养技术还不能通用。在过去的几年，不同动物的卵泡体外培养体系的建立均有一定程度的发展，而且对卵泡的发育过程也有了很好地了解，但是获得高质量的成熟卵母细胞还有相当的距离。在目前的技术条件下，啮齿类的腔前卵泡已能经体外培养发育至有腔卵泡期，而且从有腔卵泡分离的卵母细胞经体外成熟、体外受精后已能产生新的个体。但家畜类腔前卵泡的体外培养体系还处于早期研究阶段，探讨早期卵泡的发育特征，建立成功的体外分离方法和培养体系是开发家畜类卵巢资源的基础。