农业生物技术学报

Research and Prospects for Genetically Engineered Agricultural Microorganisms

黄大昉

2003, 11(2): 111-114 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要：介绍了我国农业微生物基因工程研究现状，特别是饲料、肥料和农药用重组微生物制剂的研究成果。为争取5～10年内使我国农业微生物成为新兴的高技术支柱产业，建议进一步加强基础研究，重视资源开发利用，适时开展功能基因组学研究，从高起点切入，以加快源头创新。另建议将微生物农药、饲料和食品加工用酶制剂列为近期研究开发重点。同时也要不断革新生产工艺，改进加工剂型，调整研发结构，促进产业发展。

苜蓿根瘤菌聚羟丁酸解聚酶基因(phbD )突变体的构建及其特性

Construction and Characteristics of Poly-3-hydroxybutyrate Depolymerase Encoding Gene (phbD ) Mutant in Sinorhizobium meliloti

戴美学1 武波2 柏学亮2 张成刚1 马庆生2

2003, 11(2): 115-120 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要: 根据苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti ) Rm1021基因组中与Ralstonia eutropha phaZ基因同源部分序列设计1对引物，从S. meliloti基因组中用PCR扩增出835 bp phbD 基因片段并克隆到载体pGEM?襆-T Easy上；通过在phbD基因内插入ΩSmSp和基因置换构建了phbD突变体。该突变体可积累比野生型菌株多1.0~2.6倍的聚羟丁酶（PHB）。在YMA和TY平板上形成非粘液型菌落，而在以乙酰乙酸或3-羟丁酸为唯一碳源的M9基本培养基（M9-AA，M9-HB）上形成粘液型菌落。碱性磷酸酶测定结果表明，通过接合引入phbD突变体菌株中的exoF-phoA融合基因在YMB培养基中低量表达，而在M9-AA和M9-HB中高量表达。

含粘质沙雷氏菌几丁质酶SchiA基因的植物转化
质粒pBG1112构建和水稻遗传转化

Construction of a New Plant Transformation Vector pBG1112 with a Chitinase Gene SchiA from Serratia marcescens and Its Genetic Transformation in Rice

何迎春1 李小湘2 高必达1

2003, 11(2): 121-126 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要:将一个2.8 kb的CaMV35S启动子/SchiA编码区/Nos终止区融合基因插入到植物转化载体pCAMBIA1301的多克隆酶切位点，得到1个14.6 kb的新植物转化质粒pBG1112,用花器介导法转化水稻（Oryza sativa ），经PCR检测，初步证实已将目的基因整合到受体植物的基因组中。一部分转基因T3代潮霉素抗性阳性植株对水稻纹枯病(Rhizoctonia solani )和稻瘟病（Pyricularia oryzae）的抗性较非转化对照增强。RT-PCR表明抗病性植株为阳性，而不抗病的植株为阴性。将RT-PCR产物测序后，用BLAST软件分析序列可知，该序列为细菌几丁质酶基因核苷酸序列而不是植物几丁质酶基因的核苷酸序列。T4代转基因水稻的几丁质酶活力高于对照未转基因植株，表明转入的外源几丁质酶基因能正常表达。

乙烯受体基因LeETR1和LeETR4的克隆及在番茄果实中的表达

Cloning of Ethylene Receptor Genes LeETR1 and LeETR4 and
Their Expression in Tomato Fruit

魏绍冲朱本忠罗云波** 蔚变云

2003, 11(2): 127-130 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要：为研究野生型番茄（Lycopersicon esculentum Mill. cv . Lichun）和转反义ACS 番茄果实中乙烯受体基因LeETR1和LeETR4的表达与乙烯的关系，实验用RT-PCR方法扩增了乙烯受体基因LeETR1和LeETR4片段，用两片段作探针进行Northern 杂交。结果表明：两受体基因的表达在番茄果实成熟进程中变化不明显，LeETR4在同一时期的果实外果皮中表达水平低于其在辐射壁和中柱的表达。转反义ACS番茄果实中LeETR1和LeETR4的表达水平显著低于野生型番茄果实，外源乙烯处理转反义ACS番茄果实，促进两个受体基因的表达。可见果实中LeETR1和LeETR4的表达受乙烯调控的影响。

云南地方稻种资源核心种质的微卫星分析

Microsatellite Analysis of Landrace Rice Core Collection in Yunnan, China

张洪亮1 李自超1** 廖登群1 刘霞1,3 曾亚文2 申时全2 穆平1 杨忠义2 王象坤1

2003, 11(2): 131-139 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要：以来自云南地方稻(Oryza sativa L.)种资源核心种质中的113份材料为研究对象，运用36对微卫星引物，研究了籼(indica )粳( japonica )两个亚种间和云南5个稻作生态区间的遗传多样性分布趋势，并筛选了籼粳亚种、水陆生态型和不同生态区的特异指纹标记。结果表明，粳稻的遗传多样性大于籼稻，遗传分化水平较低；而5个生态区中滇西南水陆稻区遗传多样性最大，遗传分化水平较低；滇东北高原粳稻区的遗传多样性最小。这种遗传多样性的分布趋势与前人在形态和同工酶水平上对云南稻种资源多样性的考察，以及云南地方稻种资源核心种质在形态和同工酶水平上的遗传多样性分布趋势基本一致。另外，在所出现的416个指纹标记中，分别发现籼粳特异指纹标记6个，水陆特异指纹标记15个，不同生态区特异指纹标记3个。初步认为，云南地方稻种资源核心种质代表了云南省地方稻种资源的遗传多样性；从DNA水平上看，云南地方稻种资源的遗传多样性中心在云南省的西南部，粳稻的分化水平低于籼稻。微卫星标记是种质资源遗传多样性检测、分类和生态型确认以及核心种质研究中有用的工具。

草莓果实特异表达基因annfaf 在E. coli 中的表达及抗血清的制备

Expression of annfaf Gene Expressed Specifically in Strawberry
Fruit in E.coli and Preparation of Its Antiserum

王关林1 夏然1 方宏筠1 杨怀义2 那杰1

2003, 11(2): 140-143 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要：将草莓?穴Fragaria ananassa Duch. ?雪果实中特异表达的膜联蛋白基因annfaf的cDNA连接重组到pET-30a质粒中，构建了融合和非融合蛋白表达载体。annfaf 基因转化大肠杆菌(E. coli )后以包含体形式得到了高效表达，同时研究了annfaf基因表达的影响因素。实验结果表明, 最佳培养温度是37 ℃ ，培养时间为4 h，当培养液中加入利福霉素时可明显提高表达量中目的蛋白的含量。SDS-PAGE检测表明该蛋白分子量为35 kD，与目的蛋白相同。以表达的蛋白作抗原免疫家兔，制备了抗Annfaf蛋白的抗血清。ELISA检测及Western印迹表明，制备的抗血清可与其免疫抗原发生特异的免疫学反应，且具有较高的效价。该实验结果为进一步研究Annfaf蛋白在草莓果实细胞中的定位及其生理功能奠定了基础。

反义乙烯受体LeETR2基因对番茄的转化和功能分析

Transformation and Functional Analysis of Antisense Ethylene
Receptor LeETR2 Gene in Tomato

张明方1 向庆宁1 应铁进2** 杨虎清2 郑铁松3 杜荣茂2

2003, 11(2): 144-147 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要：采用根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导法将LeETR2的部分反义序列导入番茄(Lycopersicon esculentum)子叶外植体，经抗性筛选和组织培养获得再生植株。通过对转基因植株中插入序列的PCR检测和Southern杂交，证明转化番茄成功。通过对LeETR2的功能的初步研究结果表明, 转基因植株顶端优势丧失、极端矮化和番茄果实的内源乙烯合成量增加。这提示此基因在植物乙烯信号感受与转导系统中起着负调控的作用。

杏自交不亲和相关S-RNase基因的克隆及表达

Cloning and Expression of Self-incompatibility Related S-RNase Gene in Apricot

齐洁1,2 顾曼如1　束怀瑞1

2003, 11(2): 148-153 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要: 从巴旦水杏(Prunus aremeniaca L. cv. Badanshui)、红玉杏(P. aremeniaca L. cv. Hongyu)和凯特杏(P. aremeniaca L. cv.Katy)3个品种中通过RT-PCR和RACE克隆出3个S-RNase片段，分别被定名为PA1、PA2、PA3，片段大小分别为576、601和591 bp。3个基因的氨基酸的相似性达80.6%。将这3个基因与蔷薇科中其它树种的S- RNase比较表明，蔷薇科S-RNase的氨基酸序列变异很大，亚科内的相似性高于亚科间的，在所编码的187个氨基酸中只有14个氨基酸残基是完全保守的，高度变异（RHV）区PA1有H、M两个残基和PA3有N、S、A　3个残基不同于其它的S-RNase，这表明不同的残基可能起着S-等位基因专一性识别的作用。从蔷薇科、茄科及一些S-like RNase 的系统树分析可看出，苹果和梨分属于苹果亚科类，樱桃、扁桃和杏分属于李亚科类，同时也证明了实验中所得到的3个氨基酸序列是S-RNase的一个分支而不是S-like RNase的分支。 Northern 杂交分析表明凯特杏表达的PA3只在花柱中专一表达，在根、茎和叶中未表达，杂交斑的分子量为0.9 kb。序列分析及在基因库中搜索结果证明，本研究所得到的3个基因是S-RNase表达的基因。

月季切花衰老相关基因的差异显示及其序列分析

Differential Display and Sequence Analysis of Senescence-associated
Genes in Cut Roses

白双义1 刘青林1* 欧阳青2 蔡文启2

2003, 11(2): 154-157 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要：通过对不同瓶插寿命切花月季（Rosa hybrida）品种的DDRT-PCR方法，从长寿命的Pavarotti花瓣中扩增出22条cDNA特异片段，共得到9个cDNA片段的克隆，分别命名为b21、b32（b33）、b43、b51（b52、b814）、b618（b101、b108、b813）、b624、b131、b134和b186。序列测定和同源性检索的结果表明，来自b6的2个克隆b618和b624的序列不同，其中一个片段b618为439 bp，其氨基酸序列与拟南芥（Arabisopsis thaliana）、柑橘（Citrus sinensis）、萝卜（Raphanus sativus）、苹果（Malus sp.）、葡萄（Vitis vinifera）和胡颓子（Elaeagnus umbellata）等查尔硐异构酶(CHI)相应区域的同源性为71%~79%；另一个片段b624为440 bp,其氨基酸序列与拟南芥、豌豆（Pisum sativum）、欧洲油菜（Brassica napus）等的磷酸乙酰胆碱胞苷转移酶(CPCT)相应区域的同源性高达86%~90%。RT-PCR验证表明这2条cDNA片段为阳性结果。CHI涉及类黄酮色素的生物合成途径，CPCT参与胞苷二磷酸胆碱的合成途径，二者均与衰老进程相关。

三个野生种群马氏珠母贝遗传多样性的RAPD分析

Genetic Diversity Analyses of Three Wild Populations of Pinctada martensii
( Dunker.) Using RAPD Technique

王爱民1,2 阎冰1 叶力1 邓凤娇3 张锡元3 武波4

2003, 11(2): 163-168 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要：为了解野生种群马氏珠母贝（Pimctada martensii (Dunker.)）的遗传结构背景和开展遗传改良育种，运用RAPD技术分析了海南三亚（SW）、广东大亚湾（DW）和广西北海（BW）3个野生种群的遗传多样性。采用了18个10碱基的随机引物对3个野生种群进行分析，其中6个引物能扩增出清晰的多态带谱，扩增的DNA片段大小在含0.2~3.0 kb之间。SW、DW和BW 3个种群内的遗传相似性指数分别为0.642、0.672和0.688，Shannon多样性值分别为0.266、0.211和0.174。马氏珠母贝3个野生种群的遗传相似性依次为SW< DW < BW，而遗传多样性依次是SW > DW> BW。DW和SW相对遗传距离为0.104；DW和BW相对遗传距离为0.094；SW和BW相对遗传距离为0.212。讨论了马氏珠母贝野生种群遗传多样性差异的可能原因、种群间杂交子代的杂交优势预测及人工养殖对野生种群遗传结构的可能影响。

提高PCR产物T-A克隆效率的研究

Studies on Improving T-A Cloning Efficiency of the PCR Products

李瑞国安晓荣苟克勉柏家林侯健陈永福**

2003, 11(2): 158-162 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要：比较了3种T-A克隆法对于4个不同长度PCR产物的克隆效率。结果表明，对于较短的PCR产物（500 bp左右），采用常规的T-A克隆法即可得到较高的克隆效率；对于中等长度的PCR产物(3 000 bp左右)，用温度循环T-A克隆法可获得较高的克隆效率；对于较长的PCR产物（6 000 bp左右），用二次重组T-A克隆法可以提高克隆效率。

家蚕胞质肌动蛋白基因启动子的克隆及
piggyBac转座子表达载体的构建

Cloning of Bombyx mori Cytoplasimic Actin Gene Promoter and Construction of piggyBac Transposon Expression Vector

李维1 王宇1 张世英1 朱玲巧1 黄敏1 刘辉芬2

2003, 11(2): 173-178 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要: 利用PCR方法从家蚕（Bombyx mori）总DNA中克隆到细胞质肌动蛋白基因（cytoplasmic actin）启动子片段，序列分析表明，该片段中含有典型的组成型表达的细胞质肌动蛋白基因A3（BmA3）调控序列：SRE元件（serum response element）和ActE1元件(active element 1)。该序列的核苷酸序列与来自欧洲的一个家蚕品种的序列同源性为94%。通过多次重组，将A3启动子片段(不含信号肽序列)与转座子 piggyBac的转座酶编码区融合构建成辅助质粒；将其(含信号肽序列和部分编码区)与报告基因多管水母绿色荧光蛋白基因gfp融合，插入到人工合成的转座子piggyBac两反向重复末端序列之间，进而构建成基于转座子piggyBac的转基因载体。研究中构建的转座子转基因载体仅6.4 kb，并在两反向重复末端序列之间设计了1个多克隆位点区，便于目的基因的插入。

猪基因组AFLP指纹图谱的构建

AFLP Markers for Pig Genomic DNA Fingerprinting

任军1 黄路生1** Gary Evens2 高军1 艾华水1 陈克飞 1 丁能水1 邓素华1

2003, 11(2): 179-182 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要：对猪（Sus scrofa）基因组AFLP指纹图谱构建的各项条件进行了优化，包括双酶切消化、接头连接、预扩增和选择性扩增、凝胶电泳银染技术及荧光标记检测法等，建立了稳定的猪基因组DNA的AFLP指纹图谱构建方法，采用E32/T32引物组合在45个猪种基因组混合DNA中检测到28个多态标记。

人胰腺激肽释放酶cDNA的克隆、序列分析和原核表达

Cloning, Sequence analysis and Prokaryotic Expression of
Human Pancreas Kallikrein cDNA

施伟庆张磊孙怀昌**

2003, 11(2): 169-172 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要: 为了研制人激肽释放酶（KLK1）特异单克隆抗体和进行重组酶的鉴定及纯化，根据已发表的人KLK1序列设计引物，用PCR扩增法从人胰腺单链cDNA库中特异地扩增出KLK1 cDNA。将其克隆入pGEM-T载体中,对5个重组质粒进行了序列测定，其中1个cDNA克隆的核苷酸序列与已发表的人肾/胰/唾液腺KLK1 cDNAs序列完全相同或有3个核苷酸差异。将去除信号肽序列的KLK1 cDNA以正确阅读框插入表达载体pGEX-4T-3,构建成重组质粒pGEX-KLK1。此重组质粒转化的E.coli 经IPTG诱导后表达分子量为48 kDGST-KLK1融合蛋白，表达产物主要以不溶性包涵体形式存在，可溶性部分能被Glutathione Sepharose 4B特异吸附，两者都能被GST特异单克隆抗体识别。用SDS-PAGE分离纯化的融合蛋白免疫小鼠，获得的抗血清的ELISA效价为1∶1600。结果表明，克隆的人KLK1 cDNA及其表达产物是正确的，可以用于人KLK1单克隆抗体的制备。

美洲商陆抗病毒蛋白真核表达载体的构建及在毕赤酵母中的表达

A Secreted Expression Vector Construction of Pokeweed Antiviral Protein Gene and Its Expression in Pachia pastoris　

陈定虎王锡锋李莉周广和**

2003, 11(2): 183-186 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要：从美洲商陆（Phytolacca americana）叶片中通过异硫氰酸胍法提取出了总RNA,经RT-PCR扩增出缺失突变型抗病毒蛋白PAP基因，将该基因克隆于分泌型真核表达载体pPIC9K，然后导入毕赤酵母(Pachia pastoris )菌株GS115细胞。在甲醇的诱导下，经过酵母高密度发酵进行PAP的表达，经SDS-PAGE分析。结果表明，在培养基上清液中含有一明显的特异性蛋白条带，大小为34 kD，经Western-blotting分析，该蛋白与法国PAP抗血清有特异性反应，体外活性检测表明该蛋白对病毒的侵染性具有高度的抑制性，表明该基因在毕赤酵母GS115中得到了表达。

水稻草矮病毒基因组vRNA3 NS3基因的克隆、序列分析及原核表达

Cloning, Sequence Analysis and Prokaryotic Expression of the vRNA3
NS3 Gene in Rice Grassy Stunt Virus Shaxian Isolate

林丽明吴祖建谢联辉** 林奇英

2003, 11(2): 187-191 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要: 根据RGSV(rice grassy stunt virus )-IR分离物的RNA3序列设计引物，采用RT-PCR技术扩增出RGSV-SX分离物的NS3基因，并进行序列测定及原核表达。结果表明，NS3基因由588个核苷酸组成，编码22.9 kD蛋白。构建了可在E. coli DH5α中表达的质粒pGTNS3，经IPTG诱导，SDS-PAGE分离纯化得到分子量为49.0 kD的GST-NS3融合蛋白，并制备抗血清。应用Western blot 分析寄主水稻(Oryza sativa)和介体昆虫体内NS3基因表达产物，仅在感病水稻植株中检测到NS3蛋白，而在提纯病毒、介体昆虫体内则未检测到。

水稻白叶枯病菌蛋白质激发子HarpinXoo诱导植物的防卫反应

Defense Response in Plants Induced by HarpinXoo，An Elicitor of Hypersensitive Response From Xanthomonas oryzae pv. oryzae

闻伟刚邵敏陈功友王金生**

2003, 11(2): 192-197 | doi: | Full text (HTML) (1 KB) |

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摘要

摘要：含质粒pHRF4的表达菌株BLHR4在培养基中经IPTG诱导，16 h Harpin表达接近最高量。用不同浓度的HarpinXoo喷雾处理烟草(Nicotiana tabacum L.)、油菜(Brassica campestris L.)和番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)，对烟草花叶病毒(TMV)、油菜菌核病(Sclerotinia sclerotiorum (lib.) de Bary)和番茄灰霉病(Botrytis cinerea Pers.)均表现较好的诱导抗病效果。以浓度为100μg/mL的HarpinXoo处理烟草后，分别测定叶片中与防卫反应相关的一些生理指标的变化，结果表明，处理叶片中苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（PO）和多酚氧化酶（PPO）活性都有不同程度的增强。三种酶活性高峰分别在处理后24、12和3 h出现，分别比清水对照增加110.1%、211.2%和273.0%；同时，两个病程相关蛋白（pathogenesis-related protein，PR）基因PR-1b和PR-1a在HarpinXoo处理24 h后被诱导显著表达，36 h时达到最高表达水平。这表明HarpinXoo与HarpinEa一样能够诱导烟草不同抗病信号通路的启动，从而使植株获得抗病性。