布鲁氏菌病(Bruollosis)是对羊养殖业危害最严重的传染病之一,在山羊(Capra hircus)中,干扰素调节因子 3 (interferon regulatory factor 3, IRF3)基因调控区的突变对抵抗布鲁氏杆菌(Brucella)的感染起到一定抑制作用。绵羊与山羊的IRF3 基因高度同源,可通过基因编辑技术在绵羊(Ovis aries)中引入相同类型的IRF3 突变,获得 IRF3 基因编辑的绵羊单克隆细胞株,并为后续利用体细胞核移植技术制备具有抗布鲁氏菌病的基因修饰绵羊提供供体细胞。本研究利用CRISPR/Cas9 及先导编辑(prime editing, PE)技术对绵羊 IRF3 基因的上游开放阅读框(upstream open reading frame, uORF)进行编辑。首先根据 NCBI 数据库绵羊的IRF3 参考序列设计引物,经过IRF3 克隆和测序获得湖羊的IRF3 序列 ;在此基础上设计靶向的小向导 RNA (small guide RNA, sgRNA)及先导编辑向导 RNA (primer editing sgRNA, pegRNA)序列,并将其构建到表达载体上,结合 CRISPR/Cas9 或 PE 表达载体转染湖羊胎儿成纤维细胞株,经单克隆细胞筛选,成功利用CRISPR/Cas9 获得 2 株 IRF3-uORF 靶点位置精准缺失 10 bp的阳性单克隆细胞株。而利用PE 技术未获得 IRF3-uORF 精确编辑的单克隆细胞株。本研究为结合体细胞克隆技术在个体水平上获得抗布鲁氏菌病绵羊育种新材料和探究与 IRF3 相关抗病的机制提供新思路。

脂氧合酶(lipoxygenase, LOX)是植物体内重要的氧化还原酶,广泛参与植物生长和发育,响应生物与非生物胁迫等过程。目前,玉米(Zea mays) LOX 家族成员及其在茉莉酸(jasmonic acid, JA)信号通路中的作用均未明确。为明确玉米 LOX 家族成员及其功能,本研究利用生物信息学方法,对玉米 LOX 家族基因进行了鉴定,分析了其系统进化、保守基序、组织表达特异性以及生物与非生物胁迫下的表达规律; 利用qRT-PCR 技术,检测了玉米 LOX 家族基因在禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)侵染和茉莉酸甲酯 (methyl jasmonate, MeJA)处理下的表达规律。结果发现,玉米基因组中包含 13 条LOX 基因,可分为 9- LOX、13-LOX Type Ⅰ和13-LOX Type Ⅱ 3 类,并且全部包含保守的脂氧合酶基序;玉米 LOX 家族基因在不同组织与生物和非生物胁迫下的表达水平呈现显著差异(P<0.05);禾谷镰刀菌侵染和MeJA 处理后,13 条玉米 LOX 家族基因的表达量均显著上调(P<0.05),表明玉米 LOX 家族基因在玉米生长发育以及响应不同生物与非生物胁迫过程可能具有重要功能。本研究为深入了解玉米 LOX 家族基因的功能及其作用机制提供参考依据。

甘蔗(Saccharum officinarum)是重要的糖料和生物能源作物,其产量受到各种生物胁迫和非生物胁迫的影响。割手密(S. spontaneum)是甘蔗栽培育种过程中的重要亲本之一。GRAS (GAI-RGA-SCR)转录因子在植物光形态建成、种子萌发、根系生长及防御应答等过程中起重要调控作用。本研究利用GRAS 结构域的隐马尔科夫模型(Hidden Markov Model, HMM)配置文件,从割手密基因组中鉴定出 173 个 GRAS 基因家族成员,分布于割手密 30 条染色体。利用最大似然法进行系统发育分析,结果显示,173 个割手密 GRAS 家族基因可分为 8 个亚家族;基因结构分析显示,GRAS 家族基因在C 端含有至少 1 个保守的GRAS 结构域,61.2%的GRAS 家族基因存在至少 1 个内含子;GRAS 家族基因上游 2 000 bp 序列启动子顺式作用元件分析显示,所有GRAS 启动子区域存在应答生物和非生物胁迫的顺式作用元件,表明其可能涉及多种逆境胁迫的调控过程。转录组数据分析显示,割手密 GRAS 家族成员在茎和叶的不同发育时期存在较大的表达差异,qRT-PCR 验证 9 个基因在成熟茎叶组织的表达,其结果与转录组数据一致,推测 GRAS 家族成员在割手密生长发育调控中发挥不同作用;胁迫分析表明,SsPAT1.8-1 和SsDELLA6-2 受甘蔗梢腐病病原菌胁迫诱导表达;SsPAT1.8-2、 SsPAT1.9、SsPAT1.10、SsDELLA2、SsSCR2、SsDELLA1-2、SsSCL3.1-2 和SsHAM9 受甘蔗花叶病毒 (Sugarcane mosaic virus, ScMV)胁迫诱导表达;SsSCL3.2-1 受干旱胁迫诱导表达。以 ScMV 侵染抗病品种'B48',qRT-PCR检测结果显示,SsSCR2 在+1 叶中上调表达,SsHAM9 在+1 和-3 叶中均上调表达,SsLISCL11-1 在-3 叶中下调表达。上述结果提示,GRAS 家族基因可能在甘蔗对不同胁迫的响应中发挥调节功能。本研究为进一步解析甘蔗 GRAS 家族基因的功能提供基础资料,为甘蔗抗逆育种提供潜在的基因资源。

在烟叶生产中,我国烟叶的烟碱含量不同程度偏高,致使烟叶的化学成分不协调,影响了烟叶的工业可用性,造成烟叶大量库存积压。因此,有效降低烤烟烟叶中的烟碱含量已成为了烟叶生产的重要议题。本研究基于打顶等机械损伤可通过激活茉莉酸(jasmonic acid, JA)信号途径以刺激烟株烟碱的合成为切入点,探究利用水杨酸(salicylic acid, SA)和JA 在信号传导中的拮抗作用调节烟株烟碱的合成,揭示 SA 拮抗 JA 信号调节烟碱合成的可能途径。以'云烟 87' (Nicotiana tabacum cv. 'Yunyan 87')为实验材料, 待烟草生长至盛花期时,对其进行打顶、采叶等机械损伤处理,分析机械损伤处理后根施 SA 对烟碱合成相关基因的表达、烟株总氮和烟碱含量的影响;并对经 JA、SA、JA+SA 处理的烟苗根系进行转录组学分析。结果表明,多重机械损伤能够进一步诱导烟碱合成相关基因的表达,促进体内氮素向烟碱合成途径的转化 ;SA 能拮抗 JA 信号,抑制烟碱合成相关基因的表达,阻碍体内氮素向烟碱合成途径的转化,降低烟株的烟碱含量 ;转录组学的共表达网络分析中,14 个分别隶属于 bHLH、AP2-EREBP 和WRKY 家族的转录因子不仅能被 SA 显著诱导,而且其表达模式与烟碱合成相关基因呈负相关关系;启动子元件分析显示,烟碱合成相关基因的启动子区域广泛分布着能被 bHLH、AP2/ERF 和WRKY 识别的顺式作用元件,为 bHLH、AP2-EREBP 和WRKY 转录因子参与 SA 拮抗 JA 信号途径,并通过靶向结合启动子区域以抑制烟碱合成相关基因的转录提供了可能。本研究为有效调节烟碱合成、改良烟叶质量提供了参考。

卵形家族蛋白(OVATE family protein, OFP)是植物特有的一类调控植物形态建成和次生壁发育的转录因子,目前在杉木(Cunninghamia lanceolata)中尚未见该基因家族的相关报道。本研究基于全长转录组数据,鉴定杉木 OFP 基因家族成员,进行序列和进化树构建分析,并检测其在不同组织和器官中的表达模式及编码蛋白的亚细胞定位情况。结果显示,鉴定到 6 个杉木 OFP 基因,均包含典型的OVATE 结构域且不含内含子,分散于 5 个亚组中。实时荧光定量 PCR 显示,6 个 ClOFPs的表达模式不尽相同,其中ClOFP1 在杉木幼叶中的表达量最高,在茎中的表达量呈现随木质化程度提高而下降的趋势 ;ClOFP2 在雌球花中的表达量最高,ClOFP3 在根中的表达最高且 2 个基因在低木质化茎(S1)中的表达量较在其他茎中高 ;ClOFP4 在雌、雄球花和叶片中的表达量普遍较高 ;ClOFP5 在雄球花中的表达量最高,且在茎中的表达量随木质化程度提高而上升;ClOFP6 在茎段、雌球花中的表达量相对较高。此外,所有 ClOFPs 基因在叶片中的表达呈现随叶片成熟程度增加而减弱的趋势。亚细胞定位结果显示,ClOFP1 蛋白定位在细胞壁上,ClOFP2/3 蛋白定位在细胞膜上,ClOFP4/5/6 蛋白定位在细胞核中,表明杉木 ClOFPs 基因很可能具有不同的调控途径。因此,ClOFPs 基因在杉木的球花、叶和茎等器官的发育以及木质素合成方面具不同的调控作用。研究结果为深入研究杉木器官形态建成和木材形成提供理论依据,同时也为杉木分子育种提供潜在的基因资源。

丙酮酸脱氢酶激酶 1 (pyruvate dehydrogenase kinase 1, PDK1) 低氧下可由缺氧诱导因子 1α (hypoxia inducible factor 1α, HIF-1α)诱导并参与调控糖酵解反应,同时可上调 HIF-1α的靶基因血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)表达,促进肺组织结构的重塑。为了揭示 PDK1、HIF-1α 及 VEGF 因子在不同年龄牦牛(Bos grunniens)肺脏中的表达分布特点,探讨其在牦牛肺脏适应高原低氧环境可能的调控作用,本研究通过采集新生、6 月龄、3 岁、6 岁健康牦牛的肺脏组织,运用苏木精-伊红 (hematoxylin-eosin, HE)染色、免疫组织化学染色、光密度分析、qRT-PCR 和蛋白免疫印迹的方法,对不同年龄组牦牛肺脏组织中PDK1、HIF-1α 及 VEGF的分布以及表达量的差异性进行研究。HE 染色结果显示,随着年龄的增长,终末细支气管管壁平滑肌增厚。免疫组化和光密度分析结果显示,PDK1、HIF-1α 及 VEGF 主要分布在不同年龄牦牛肺终末细支气管及其分支的单层纤毛柱状上皮以及伴行动脉、肺泡壁上。qRT-PCR 结果显示,PDK1 和HIF-1α 基因的相对表达量在6 岁组表达量最高,3 岁组表达次之。VEGF 基因的相对表达量在4 个年龄组均差异性不显著。Western blot 结果显示,PDK1 蛋白在6 岁组的表达量显著低于新生、6 月龄和3 岁组(P<0.05),HIF-1α 和VEGF 蛋白在6 岁组的表达量显著高于新生、6 月龄和3 岁组(P<0.05)。PDK1的蛋白表达量会随着年龄的增长先上升后下降,HIF-1α 和VEGF 则呈现升高的趋势,推测 PDK1、HIF-1α 及 VEGF 蛋白在低氧下可调节肺内葡萄糖代谢和血管重塑过程。综上,PDK1、 HIF-1α 及 VEGF 可能在牦牛肺脏发育过程中起重要作用,并参与调控牦牛适应高原低氧环境。本研究为不同年龄牦牛高原低氧适应性机制的比较研究提供了基础资料。

表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)及其受体(epithelial growth factor receptor, EGFR)可在一定程度上调节子宫内膜上皮细胞生长和存活,低氧诱导因子-2α (hypoxia inducible factor-2α, HIF-2α) 是调节子宫内部环境及动物适应低氧环境的主要因子之一,三者均可影响子宫的发育及功能的正常发挥。本研究以不同时期牦牛(Bos grunniens)子宫为研究对象,采用免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)方法对 EGF、EGFR 及 HIF-2α 在牦牛子宫内的表达进行定位检测 ;利用qPCR 和Western blot 方法检测并分析 EGF、EGFR 以及 HIF-2α 在牦牛不同时期子宫中mRNA 和蛋白水平的表达差异,探究其参与牦牛生殖发育的分子机制。IHC 结果显示,EGF、EGFR 和HIF-2α 在3 个时期子宫中均主要分布在牦牛子宫内膜上皮的胞质、子宫腺、血管内皮细胞、淋巴细胞;qPCR 结果显示,EGF 在黄体期的相对表达量显著高于卵泡期和妊娠期(P<0.05),EGFR 和HIF-2α 在卵泡期相对表达量显著高于黄体期和妊娠期(P<0.05); Western blot 结果显示,EGF、EGFR 和HIF-2α 在妊娠期相对表达量显著高于卵泡期和黄体期(P<0.05)。 综上所述,EGF、EGFR 与 HIF-2α 在子宫中广泛分布,且三者在不同时期的表达存在差异,提示其可能在牦牛生殖过程中子宫的生理活动中发挥着重要作用。本研究进一步阐明 EGF、EGFR 和HIF-2α 从发情到妊娠过程中在牦牛子宫中的表达变化,为研究其在低氧环境下牦牛繁殖周期不同阶段子宫内膜发育机制中的作用提供了基础资料。

DNA 结合抑制因子 1 (inhibitor of DNA binding 1, ID1)在机体内广泛存在,影响细胞的增殖和凋亡。为揭示转录因子 ID1 在绵羊(Ovis aries)卵泡颗粒细胞增殖和凋亡过程中的作用,本研究构建了真核过表达载体 pcDNA3.1-ID1,设计合成了 ID1 RNA 干扰片段(siID1),将分离培养的绵羊卵泡颗粒细胞进行卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone, FSH)处理,24 h 后利用qRT-PCR 检测 ID1 基因表达。结果显示, FSH 处理细胞后,ID1 基因表达量极显著降低(P<0.01)。进一步将 pcDNA3.1、pcDNA3.1-ID1、siID1 和siNC (siID1的阴性对照)转染颗粒细胞,采用CCK-8 法检测转染 5 d 内颗粒细胞的增殖,转染 48 h 后,采用JC-1 试剂盒检测颗粒细胞的凋亡,并利用qRT-PCR 检测增殖与凋亡相关基因的表达变化。结果显示,过表达 ID1的颗粒细胞存活率降低,JC-1 绿色荧光增强,增殖相关基因周期蛋白依赖性激酶 2 (cyclin dependent kinase 2, CDK2)、周期蛋白依赖性激酶 4 (cyclin dependent kinase 4, CDK4) 和细胞周期素 D2 (cyclin D2 , CCND2)的表达量显著降低(P<0.05),凋亡相关基因B 淋巴细胞瘤-2 基因(B-cell lymphoma-2, Bcl2)的表达量显著降低(P<0.05),Bcl2 相关 X 蛋白(Bcl2-associated X protein, Bax)基因表达量显著升高 (P<0.05),胱天蛋白酶 3 (caspase-3, Casp3)基因表达量极显著升高(P<0.01);抑制 ID1 表达颗粒细胞存活率升高,JC-1 绿色荧光减弱,增殖相关基因CDK2 和CCND2的表达量极显著升高(P<0.01),CDK4 基因表达量显著升高(P<0.05),凋亡相关基因Bcl2的表达量极显著升高(P<0.01),Bax 基因表达量显著降低(P<0.05)。 综上所述,转录因子 ID1 抑制了绵羊颗粒细胞的增殖且促进了颗粒细胞的凋亡,本研究结果为探讨 ID1 在卵泡颗粒细胞中的生物学功能及揭示其在卵泡发育中的作用提供了基础资料。

糖蛋白 2 (glycoprotein 2, GP2)是由粘液腺和分泌细胞产生的一种糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白 (glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins, GPI-APs),能够摄取肠腔内的病原菌,对维持机体的稳态具有重要意义。为获得抗双峰驼(Camelus bactrianus) GP2的抗体并研究 GP2 在双峰驼回肠中的表达情况,将双峰驼 GP2 基因(GenBank No. XM_045521202.1)连接至 pET-28a,构建重组质粒 pET-28a-GP2,再转入大肠杆菌(Escherichia coli) 感受态细胞 BL21(DE3) 中诱导表达,优化诱导条件后,通过SDS-PAGE 和Western blot 验证。用已获得目的蛋白制备兔抗双峰驼 GP2 多克隆抗体,并通过ELISA 和Western blot 检测效价及其特异性,最后采用免疫组织化学染色方法了解其在回肠中的表达情况。结果表明,GP2 蛋白的大小约为 65 kD,最佳诱导条件为 0.5 mmol/L 异丙基- β -D- 硫代半乳糖苷 (isopropyl-beta-D- thiogalactopyranoside, IPTG) 6 h,主要以包涵体的形式表达。经 ELISA 和Western blot 检测,抗体效价为1∶2.56×105,能特异性识别重组蛋白 GP2。免疫组织化学染色结果显示,GP2 主要在回肠的滤泡相关上皮表达,并且在微皱褶细胞的细胞膜上表达。本研究为 GP2的后续研究提供了参考,同时丰富了黏膜免疫的相关理论,解决了目前市场上没有商品化抗体的问题,为开发新型药物提供抗体支撑。

氧化应激介导的鹅(Anser cygnoides)卵泡颗粒细胞(granulosa cells, GCs)凋亡影响鹅产蛋性能。 本研究旨在探讨抗氧化剂维生素 E (vitamin E, VE)对鹅卵泡 GCs 凋亡的缓解作用。通过添加 H2O2 (100 μmol/L)建立鹅卵泡 GCs 氧化应激模型,并在体外检测氧化应激对鹅卵泡 GCs 凋亡的影响。在该模型中分别添加 4 种不同浓度的原花青素、白藜芦醇、没食子酸和VE,筛选出最佳缓解剂及最适浓度。进一步采用ELISA、qPCR 和免疫荧光检测等技术探讨最佳缓解剂 VE 对氧化应激介导的鹅卵泡 GCs 凋亡的作用。结果表明,100 μmol/L H2O2 处理 12 h 极显著促进鹅卵泡 GCs 凋亡(P<0.01) ;4 种不同抗氧化剂中,40 μmol/L VE 对氧化应激模型的缓解 作用最佳 (P<0.01),添加后可减少细胞乳酸脱氢酶 (lactate dehydrogenase, LDH)的释放量(P<0.05),降低氧化应激相关基因超氧化物歧化酶 1 (superoxide dismutase 1, SOD-1)、SOD-2、过氧化氢酶 (catalase, CAT) 表达量 、环氧化酶 2 (cyclooxygenase, COX-2)和活性氧 (reactive oxygen species, ROS)含量(P<0.05);细胞增殖活力显著上升(P<0.05)且呈剂量依赖性,抗凋亡基因B 细胞淋巴瘤/白血病-2 (B-cell lymphoma/leukemia-2, Bcl-2)的表达量显著上升(P<0.05),促凋亡基因半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶 3 (cysteinyl aspartate specific proteinase 3, Caspase3)、Caspase9 和肿瘤抑制基因肿瘤蛋白 p53 (tumor protein p53, p53)的表达量显著下降(P<0.05),细胞凋亡数显著降低(P<0.05)。本研究表明,在氧化应激诱导条件下,鹅卵泡 GCs 存在明显的凋亡,添加 VE 可抑制氧化应激缓解鹅卵泡GCs 凋亡,本研究可为提高鹅的产蛋性能提供参考。

环状 RNAs (circular RNAs, circRNAs)作为高效竞争性内源 RNA (competing endogenous RNA, ceRNA),通过miRNA 海绵效应调节细胞分化、增殖、凋亡和能量代谢等参与调控低氧诱导的细胞生物过程。 黑果枸杞(Lycium ruthenicum)富含花青素(anthocyanins)。花青素具有较强的抗氧化能力,可以有效缓解心肌细胞缺氧损伤。本研究利用RNA-seq 技术和生物信息学方法筛选差异表达的circRNA、miRNA 和mRNA, 构建 circRNA-miRNA-mRNA 调控网络,利用qRT-PCR 筛选可能参与黑果枸杞花青素对低氧诱导的H9c2 大鼠(Rattus norvegicus)心肌细胞调控的ceRNA 关系对。结果显示,差异表达的1 570 个 mRNAs、5 个 miRNAs 和4 个 circRNAs 是低氧相关分子,可能参与黑果枸杞花青素对低氧诱导的H9c2 大鼠心肌细胞的调控。 基于皮尔逊相关性分析和靶关系预测,成功构建 ceRNA 网络,并利用qRT-PCR 筛选到 2 个候选的circRNA-miRNA-mRNA 关系对。本研究为深入探讨 circRNA 及其靶基因参与调控黑果枸杞花青素对心肌细胞保护作用的机制提供基础资料。

三基序蛋白 25 (tripartite motif containing 25, TRIM25)是宿主抗病毒免疫应答中发挥重要作用的TRIM 蛋白家族成员之一。为了解虹鳟(Oncorhynchus mykiss) TRIM25 基因分子特征及其在感染传染性造血器官坏死病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus, IHNV)过程中的表达变化,本研究采用cDNA 末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术获得虹鳟 TRIM25 基因cDNA 全长序列(GenBank No. OL692831),并对其进行生物信息学分析,同时利用qPCR 技术检测 TRIM25 基因在健康虹鳟不同组织及感染 IHNV 后不同时间点(0, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120 和144 h)肠道、肝脏、脾脏、皮肤、头肾和鳃中的表达变化。结果显示,虹鳟 TRIM25 基因cDNA 全长序列 4 745 bp,其开放阅读框 2 028 bp,编码 675 个氨基酸。生物信息学分析表明,TRIM25 蛋白分子量为 76.04 kD,理论等电点为 8.79,不稳定系数为 49.2,平均亲水系数为-0.591,属于不稳定亲水蛋白。对 TRIM25 蛋白结构域分析发现,该蛋白包含 RING、B-boxes、 B-Box C-terminal domain 和PRY-SPRY 结构域。 同源比对及系统进化树分析表明,虹鳟与大马哈鱼 (Oncorhynchus keta)同源性最高(94.96%)且亲缘关系最近,与哺乳动物和两栖动物同源性较低。qPCR 检测发现,TRIM25 基因在健康虹鳟各组织中均有表达,其在肝脏中的表达量最高,头肾和脑中的表达量次之,皮肤中的表达量最低。感染 IHNV 后,TRIM25 基因在肝脏、头肾、脾脏、肠道和皮肤的表达量均在48 h 达到峰值,鳃在96 h 表达量达到峰值,各组织在峰值时的表达量与对照组相比差异极显著(P<0.01),其中以头肾和脾脏表达变化较显著,分别为对照组的5.72 和4.33 倍。上述结果表明,TRIM25 基因可能在虹鳟抗 IHNV 感染的免疫应答中发挥着重要作用。本研究为深入研究 TRIM25 基因在鱼类抗病毒免疫调控中的作用提供了基础资料。

宽体金线蛭(Whitmania pigra)的人工养殖过程中,存在着饵料种类单一和供应不足等问题,限制了其养殖业的发展,因此,开发多样化的宽体金线蛭饵料已十分迫切。本研究的目的是揭示小球藻 (Chlorella vulgaris)和方形环棱螺(Sinotaia quadrata)共同投喂对宽体金线蛭生长、消化、免疫和药用品质的影响。将健康的宽体金线蛭(初始体质量为(3.512±0.002) g)随机分为 3 组,每组设置 3 个重复,分别投喂小球藻(藻组, CV 组)、小球藻加方形环棱螺(藻螺共投组, CV+SQ 组)和方形环棱螺(螺组, SQ 组) 30 d。结果表明,藻螺共投组的宽体金线蛭终末体质量(final body weight, FBW)、增重(weight gain, WG)和摄食量 (feed intake, FI)均显著高于其他两组(P＜0.05),且特定生长率(specific growth rate, SGR)和饲料系数(feed conversion ratio, FCR)显著优于藻组(P＜0.05)。不同组别间的宽体金线蛭氨基酸成分存在着显著差异, 其中藻螺共投组的亮氨酸和赖氨酸含量显著高于螺组(P＜0.05),但是天冬氨酸显著低于螺组(P＜0.05)。 藻螺共投组的宽体金线蛭消化道 α-淀粉酶活性和抗凝血酶活性显著高于其他两组(P＜0.05),脂肪酶和蛋白酶活性显著高于藻组(P＜0.05),超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和过氧化氢酶(catalase, CAT)活性显著高于螺组(P＜0.05)。此外,SDS-PAGE 电泳发现藻螺共投组宽体金线蛭粉的分子量约为30 kD的多肽条带浓于其他两组。 藻螺共投组宽体金线蛭消化道的胰岛素样生长因子 (insulin-like growth factors-1, IGF-1)、无机焦磷酸酶(inorganic pyrophosphatase, PPase)、α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase, α- GLU)、SOD、CAT、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)和水蛭素基因(hirudin, WP)的表达量显著高于螺组(P＜0.05)。综上所述,小球藻和方形环棱螺共同投喂可促进宽体金线蛭生长,提高消化能力和药用品质,增强免疫力。本研究为优化宽体金线蛭人工养殖投喂策略提供理论依据。

鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus, AngHV)是鳗鲡(Anguilla)的一种重要病毒性病原,可引起养殖鳗鲡暴发“脱黏败血综合征”,给养殖者造成巨大的经济损失。开展 AngHV的免疫原性蛋白研究对于开发AngHV的免疫学诊断技术及亚单位疫苗具有重要意义。为了获得鳗鲡疱疹病毒的免疫原性蛋白, 本研究通过质谱分析 AngHV 病毒粒子结构蛋白,筛选到 ORF36,对其氨基酸序列进行生物信息学分析, 克隆至原核表达载体进行诱导表达 ;用纯化的重组表达蛋白制备兔抗多克隆抗体,评价该抗体检测 AngHV的特异性、灵敏性以及病毒中和效果,并对 ORF36 进行病毒粒子结构定位。结果显示,通过质谱鉴定出病毒的主要免疫原性蛋白 ORF36;序列分析显示,ORF36 无跨膜结构域,不含有信号肽,具有 13 个B 细胞抗原表位,免疫原性良好 ;克隆 ORF36 至原核表达载体 pET-30a,实现了其在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中的高效表达,重组表达蛋白大小约为 40 kD;ELISA 检测显示,制备的兔抗 ORF36 多克隆抗体效价为 1∶8 000;Western blot 结果显示,该抗体能特异性识别感染 AngHV的鳗鲡卵巢细胞系(eel ovary cell line, EO)及鳗鲡组织,最低可检测的内脏组织的病毒量为 1 000 PFU;抗体中和试验表明,制备的兔抗 ORF36 多克隆抗体具有中和作用,能显著降低 AngHV的病毒滴度 ;ORF36的病毒粒子定位分析表明,ORF36 是病毒粒子的结构蛋白且定位于核衣壳上。 本研究鉴定出病毒的主要免疫原性蛋白ORF36,制备了具有病毒中和作用的ORF36 多克隆抗体,明确了 ORF36 为 AngHV 核衣壳结构蛋白,为阐明 ORF36 在AngHV 侵染过程中的作用及开发病毒亚单位疫苗提供了参考。

类胡萝卜素及其裂解产物在果实的呈色和特征香气形成、植物抗氧化和抗非生物胁迫能力、提高人体免疫力和延缓衰老等方面起着重要作用。甘薯(Ipomoea batatas)是我国第四大粮食作物,研究甘薯类胡萝卜素及其裂解产物的代谢调控机制,将有助于培育高营养品质、高“颜值”和适应性广的保健型优质甘薯品种。甘薯存在自交不相容和部分交叉不相容的复杂性,传统杂交育种方法在甘薯品种改良育种方面存在一定的局限性。本文描述了不同薯肉颜色甘薯块根中类胡萝卜素的含量和种类;汇总了采用分子生物学技术调控甘薯块根中类胡萝卜素代谢相关基因的研究进展;阐述了当前甘薯类胡萝卜素代谢研究可能存在的问题以及建议。本文为今后培育富含类胡萝卜素的生物强化型甘薯、抗逆性提高的甘薯新品种提供新思路。

CRISPR/Cas 系统的出现使植物基因组编辑进入了基因精准编辑的新时代。CRISPR/Cas 系统已成功应用于多个果树物种。育种研究统计发现,研究者利用CRISPR/Cas 基因组编辑技术编辑了大约45 个果树基因,主要用于增强抗病性、延长货架期、提早开花、树形矮化体和增加分枝数等方面的研究。 目前,果树基因组编辑大多为 CRISPR/Cas9 系统产生的插入/缺失突变,导入方式主要为农杆菌 (Agrobacterium)介导的稳定转化方式,外源基因的瞬时转化体系少有研究,主要是因为大多数果树中转化效率低限制了其应用。本文概述 CRISPR/Cas 系统及其相关技术,介绍 CRISPR/Cas 表达载体系统进入植物基因组中的导入方法,并综述 CRISPR/Cas 系统在果树研究中的应用情况,分析了存在的问题并对其应用前景进行了展望。本文为果树基因功能研究及分子育种研究工作提供参考。

氮素是影响水稻(Oryza sativa)产量和品质最重要的元素。在水稻氮高效育种过程中,针对目的基因进行分子标记辅助选择有助于高效、便捷地筛选氮高效水稻品种。 转录因子 TCP (TEOSINTE BRANCHED1, CYCLOIDEA, PROLIFERATING CELL FACTORS)参与多种发育过程的调控。OsTCP19 是新近报道的氮高效基因,其启动子区存在29 bp的缺失。本研究设计 Pro TCP19-F/R 引物进行分子标记开发,从而对水稻材料进行鉴定。对 33 个参考基因组材料的OsTCP19 基因启动子区域进行比对分析,发现'Tumba'、'CG14'、'IR64'、'N22'、'蜀恢 548'、'Basmati'和'ZH11'共7 个品种中存在OsTCP19 启动子区域的29 bp 缺失。针对该缺失序列设计引物,以'蜀恢 548'为阳性对照,对 23 个水稻育种亲本材料、测配 F1 代及其父本以及'西科恢 646'混合株系的OsTCP19 基因型进行鉴定,结果显示,亲本材料'西科恢 1288'、'Kasalath'、'IRAT109'与'蜀恢 548'条带一致,缺失 29 bp,鉴定为 ostcp19 突变基因型;'西科恢 1288'和'西科恢 646'的测配组合 F1 代含有双条带,鉴定为杂合型;'西科恢 646'单株鉴定能鉴定出 2 种基因型。因此,该标记鉴定方法可高效、准确地对 OsTCP19 基因型及种子纯度进行鉴定,鉴定方法简单、快捷、成本低廉,在水稻育种中具有潜在的推广价值。

茭白是由菰黑粉菌(Ustilago esculenta)侵染菰(Zizania latifolia)的茎部后形成的可食用肉质茎,在田间生产中常出现灰茭,严重影响茭白的产量和质量。T 型菰黑粉菌菌株侵染增殖是引起灰茭的主要因素,正常茭是由 MT 型菌株侵染形成的,而长期无性繁殖育种使得茭白种苗中T 型菌株与 MT 型菌株共存。因此对茭白种苗中的菌株进行纯化、剔除 T 型菌株、从而从源头上控制灰茭的产生对茭白产业的发展十分重要。本研究建立了一种 T 型菌株特异性检测方法,检出限为 0.008 8 ng/µL。通过不同育苗方式下种苗中T 型菌株的相对含量检测,明确了“带茭”苗的壳里苗为初期纯化的最佳方式,而薹管上段育苗为种苗扩繁的最佳方式。基于 T 型菌株对逆境的适应力远高于 MT 型菌株,最终本研究通过对茭白种苗进行5 年的逆境处理,结合 T 型菰黑粉菌检测,获得了一批不产灰茭的纯化茭白种苗。以上结果对茭白种苗的繁育具有理论和实践指导意义。

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, HPS)是引起猪(Sus scrofa)革拉泽氏病(Glasser's disease)的病原,是临床上危害猪群健康的最为严重的细菌性病原之一。副猪嗜血杆菌血清型众多,其中4型是分离比例最高的血清型,也是危害较为严重的血清型。crp是编码环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)受体蛋白(cAMP receptor protein, crp)的基因,crp是最重要的系统调控因子之一,在细菌感染过程中适应环境变化具有重要作用。为了研究crp基因对4型副猪嗜血杆菌生长、抗性和毒力等生物学特性的影响,本研究采用自然转化法构建了4型副猪嗜血杆菌临床分离株HPS4的crp基因缺失株Δ^crp,对 HPS4 及Δ^crp的形态、生长特性、生物膜形成、压力耐受、血清杀菌活性、铁利用率和小鼠 (Mus musculus)毒力等进行了研究。结果表明,本研究成功构建了4型副猪嗜血杆菌临床分离株HPS4的crp缺失株Δ^crp,HPS4的crp基因缺失后,生长显著减慢,生物膜形成能力明显减弱,对渗透压、氧化应激和热应激的耐受能力降低,在血清中的存活能力下降,对铁的利用能力降低,对小鼠的毒力降低。研究结果表明,crp基因对 HPS4的生长、抗性和毒力有明显的影响。本研究为进一步探究crp基因的功能,筛选 HPS4弱毒株提供基础资料。