农业生产上水稻(Oryza sativa)病毒病的发生大多为复合侵染,仅通过病毒病症状学的诊断往往很难准确分辨,因此开发快速精准诊断多种水稻病毒病的检测技术,对于水稻病毒病害的精准测报具有重要应用价值。基于此,本研究根据当前我国南方农业生产上常见的6种水稻病毒,即水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)、水稻草状矮化病毒(Rice grassy stunt virus, RGSV)、水稻矮缩病毒(Rice dwarf virus, RDV)、水稻锯齿叶矮缩病毒(Rice ragged stunt virus, RRSV)、水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus, RBSDV)和南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus, SRBSDV)的外壳蛋白(coat protein, CP)的基因序列,设计了特异性检测引物,建立了可同时检测6种病毒的一步法多重逆转录PCR (reverse transcription-PCR, RT-PCR)体系,其结果表明一步法多重RT-PCR检测反应体系(总体系20 μL)中,RSV上下游引物浓度为10 μmol/L的体积加量为0.6 μL、RDV为0.4 μL、RGSV为0.3 μL、RRSV为0.4 μL、RBSDV为0.6 μL、SRBSDV为0.2 μL;Onestep RT/Taq Mix的用量确认为0.75 μL,5×反应缓冲液用量为4 μL,模板量为1 μg。多重RT-PCR参数设定为RNA反转录50 ℃ 30 min;预变性94 ℃ 2 min;94 ℃变性 30 s;退火温度58 ℃,30 s;72 ℃延伸1 min,35个循环;72 ℃终延伸10 min。研究结果表明该体系可同时高效精准地检测6种水稻病毒,极大地提高了检测效率;该方法可广泛应用于实验室精准检测、田间水稻病毒病和传毒介体的检测,也为相关产品的研发提供技术支持和参考依据。

大气CO₂浓度和温度升高是未来气候变化的主要特征之一。为明确大豆(Glycine max)叶片响应大气CO₂浓度和温度升高的转录谱特征,本研究利用开顶式气室(open top chamber, OTC)模拟大气CO₂浓度和温度升高条件,对大豆鼓粒初期(R5)叶片进行RNA-Seq测序和分析。结果表明,纯净序列经筛选后共获得5 646个差异表达基因,对差异基因进行基因本体(Gene Ontology, GO)注释分析,发现注释的基因涉及46个功能组,其中关于细胞过程、细胞以及结合的富集程度较高。通过对KEGG (The Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)代谢途径富集分析发现,大气CO₂浓度升高引起14个差异表达基因上调表达,这些差异基因主要参与大豆光合作用相关代谢途径,而大气CO₂浓度与温度同时升高导致17个差异表达基因中16个表现为上调,这些差异表达基因主要参与调控脂肪酸代谢途径;单一温度升高并未引起大豆叶片基因表达发生明显变化。本研究可为深入探讨大豆对未来气候变化的分子响应机制提供参考。

磷脂酰肌醇信号系统在植物生长发育过程中起重要作用。磷酸脂酰肌醇-4-磷酸-5-激酶(phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinase, PIP5K)是该信号系统中的关键酶之一,能够催化磷脂酰肌醇-2-磷酸的合成。本研究在辣椒(Capsicum annuum)基因组数据库中共鉴定出19个CaPIP5K基因家族成员,其中14个CaPIP5Ks基因不均匀地定位于8条染色体上,其余5个CaPIP5Ks基因位于0号染色体上。所有CaPIP5K蛋白均含有PIP5K结构域,其中8个CaPIP5K蛋白还含有5~7个串联重复的MORN (membrane occupation and recognition nexus)结构域。亚细胞定位预测显示,所有CaPIP5K蛋白均定位于细胞质中。CaPIP5K基因家族成员的启动子顺式作用元件主要响应激素、防御与胁迫以及低温应答。基因表达结果表明,CaPIP5K4-1在花中的表达量远高于其他组织,并且在可育材料花蕾发育的最后阶段显著高于不育系,说明该基因不仅在花蕾中特异性表达,而且与辣椒雄性育性显著相关。本研究为进一步探讨CaPIP5K基因家族的功能及其在辣椒花粉与花药发育中的作用提供了参考依据。

种子相关性状是作物重要的农艺性状,对甜瓜(Cucumis melo)遗传育种及其相关分子生物学研究具有重要意义。本研究选择薄皮甜瓜小粒种子品系'P5'为母本、厚皮甜瓜大粒种子品系'P10'为父本,配置杂交组合,获得F₁、F₂群体,利用450个F₂单株开展种子相关性状遗传分析,结果显示,种子形状和种皮颜色符合3∶1的分离比例(χ²=0.26和0.07),两者均为1对等位基因控制的质量性状;种子长度、种子宽度和种子百粒重均呈单峰正态分布,为典型的数量性状。利用127个F₂单株开展特异性位点扩增片段测序(specific-locus amplified fragment sequencing, SLAF-seq)并构建高饱和甜瓜遗传图谱,对种子相关性状开展QTL初步分析。构建的甜瓜遗传图谱包含12个连锁群,获得了3 716个上图标记,总图距为1 356.49 cM,标记间平均遗传距离为0.37 cM;将控制甜瓜种子形状(seed shape, SS)的位点SS3.1定位在甜瓜3号染色体31 470 843~31 659 961 bp,表型贡献率为26.45%;将控制甜瓜种皮颜色(seed color, SC)的位点SC12.1定位在甜瓜12号染色体12 785 226~15 029 452 bp,表型贡献率为14.07%;检测到控制甜瓜种子百粒重(hundred of seed weight, HSW)的2个QTL位点(HSW6.1和HSW7.1),HSW6.1位于甜瓜6号染色体1 082 887~1 206 028 bp,表型贡献率为13.97%,HSW7.1位于甜瓜7号染色体458 518~1 212 963 bp,表型贡献率为9.76%;检测到1个控制甜瓜种子长度(seed length, SL)的QTL位点(SL3.1),位于甜瓜3号染色体31 430 517~31 553 644 bp,表型贡献率为27.43%;检测到2个控制甜瓜种子宽度(seed width, SW)的QTL位点(SW3.1和SW12.1),SW3.1位于甜瓜3号染色体31 447 562~31 470 545 bp,表型贡献率为16.03%,SW12.1位于甜瓜12号染色体1 254 239~1 313 909 bp,表型贡献率为12.88%。研究结果为进一步克隆甜瓜种子相关性状的基因挖掘与功能分析提供理论依据。

脂肪量和肥胖相关基因(fat mass and obesity associated gene, FTO)属于非血红素加双氧酶超家族成员,在哺乳动物脂肪发育中具有重要作用。本研究以青海大通牦牛(Bos grunniens)为研究对象,利用RT-PCR扩增获得FTO基因CDS区,运用生物信息学在线软件对其功能和结构进行预测;同时采用qPCR技术对FTO基因在牦牛不同时期(18和30月龄)、不同组织(心, 肝, 脾, 肺, 肾, 背最长肌, 皮下脂肪)以及牦牛前体脂肪细胞诱导分化不同时期(0, 4, 8 和12 d)的表达规律进行分析。结果显示,牦牛FTO基因CDS (GenBank No. OM640141)全长为1 518 bp,编码505个氨基酸。FTO蛋白主要由α-螺旋(44.36%)、无规则卷曲(38.42%)、延伸链(10.89%)以及β-转角(6.34%)组成,无跨膜结构和信号肽,属于不稳定的亲水性蛋白。系统进化树结果显示,大通牦牛FTO氨基酸序列与普通牛的同源性为99.80%,遗传距离最近;与瘤牛(Bos indicus)和野牦牛(Bos mutus)的亲缘性较近,与马(Equus przewalskii)亲缘性最远。qPCR结果显示,FTO在牦牛心脏和皮下脂肪组织中的基因表达量最高,在脾脏中最低;FTO在30月龄皮下脂肪中的基因表达量极显著高于18月龄(P<0.05);在牦牛肾周脂肪细胞诱导分化的不同时期,FTO基因表达量在4、8和12 d均显著下降(P<0.05);Western blot检测结果显示,FTO蛋白表达的变化趋势与基因表达结果一致。本研究可为深入探讨FTO基因在牦牛脂肪发育中的生物学功能提供基础资料。

细胞凋亡是维持免疫器官稳态及发挥功能的重要方式,有利于山羊(Capra hircus)在运输应激下维持体内平衡。本研究旨在探讨运输应激对山羊免疫器官细胞凋亡及B细胞淋巴瘤-2 (B-cell lymphoma-2, Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(B-cell lymphoma-2 associated X protein, Bax)表达的影响。将12头健康赣西公山羊随机分为3组：对照组(不运输)、运输2 h组、运输6 h组。运输完成后采集山羊的免疫器官(脾脏, 肠系膜淋巴结),采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法(terminal dexynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)观察免疫器官细胞凋亡的情况,用免疫组织化学、Western blot和qPCR方法在蛋白和基因水平上进行定位和检测。TUNEL分析结果显示,运输2和6 h组的脾脏和淋巴结细胞凋亡率极显著高于对照组(P<0.01);免疫组化结果显示,运输前后Bax和Bcl-2在脾脏的脾小结及其边缘区和淋巴结的淋巴小结及其周围弥散淋巴组织都有阳性表达,但3组间表达强度不同。Western blot结果显示,脾脏和淋巴结的Bax、Bcl-2蛋白表达量及其比率Bax/Bcl-2在3组间并无统计学差异(P>0.05)。qPCR结果显示,与对照组相比,运输2和6 h组脾脏的Bax和Bcl-2基因表达量与运输6 h组Bax/Bcl-2的比率均极显著升高(P<0.01),在淋巴结中,运输2 h组Bax和Bcl-2基因表达量极显著降低(P<0.01),而运输6 h组Bcl-2基因表达量极显著升高(P<0.01),运输2和6 h组Bax/Bcl-2的比率极显著降低(P<0.01)。本研究结果表明,运输应激会导致免疫器官的细胞凋亡增加,且Bax和Bcl-2基因发生显著变化。本研究为防治运输应激对山羊造成的影响提供了一定的理论依据。

输卵管上皮细胞(oviduct epithelial cells, OECs)能够提供理想的生理生化环境、支持胚胎发育,但其体外增殖能力较弱,无法满足实验研究与应用需求。本研究将外源性端粒逆转录酶基因(telomerase reverse transcriptase, TERT)转入蒙古羊(Ovis aries)输卵管上皮细胞(sheep OCEs, SOECs)并观察TERT基因修饰的蒙古羊输卵管上皮细胞(TERT-SOECs)的体外增殖能力。首先经酶消化法建立了SOECs系,将重组质粒pCI-neo-TERT以脂质体法转染至原代SOECs;经G418抗性筛选,得到稳定表达TERT基因的SOECs,qPCR检测了TERT基因在细胞中的表达;免疫荧光法检测上皮细胞特异性标志物角蛋白18 (cytokeratin18, CK18)并对TERT-SOECs进行生长曲线拟合和活性测定。结果显示,成功将TERT基因导入了SOECs,PCR检测表明细胞表达了276 bp的TERT基因片段,TERT基因表达量极显著高于未转染和转染pCI-neo空载体的SOECs (P<0.001);转染后的细胞仍保留了SOECs的生物学特性,P₅ TERT-SOECs倍增时间为46.61 h,而P₅ SEOCs倍增时间为65.03 h,TERT-SOECs体外增殖速度明显高于SOECs。综上,本研究成功建立了有较强体外增殖能力的TERT-SOECs系,为种质资源细胞库提供了种子细胞。

烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide, NMN)具备多种生物学功能,对心脑疾病、老年退行性疾病、神经退行性疾病、抗衰老等具有治疗作用。经NMN处理后的骨骼肌对衰老相关的转录变化有显著的预防作用,但NMN对骨骼肌增殖分化有何作用尚不明确。为深入了解NMN对细胞成肌分化的影响、丰富肌肉生长发育的机制,本研究以小鼠(Mus musculus)成肌细胞(mouse myoblasts) C2C12为模型,将不同浓度的NMN (0, 0.1, 1和2 μg/mL)应用于2%马血清(horse serum, HS)诱导分化的C2C12。采用CCK-8 (Cell Counting Kit-8)法检测NMN处理后C2C12细胞的活力;通过2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(2',7'-dichlorodi-hydrofluorescein diacetate, DCFH-DA)和四氯四乙基苯并咪唑碳菁碘(5,5',6,6'-tetrechloro-1,1',3,3'-tetraethyl benzimidazol carbocyanine iodide, JC-1)两种荧光探针,分别对细胞进行染色,检测NMN对C2C12细胞线粒体膜电位和活性氧(reactive oxygen species, ROS)的影响;利用Western blot及免疫荧光技术检测肌细胞分化标记因子肌生成素(myogenin, MyoG)、肌分化因子1 (myogenic differentiation 1, MyoD1)表达和肌球蛋白重链(myosin heavy chain, MYH)的蛋白表达水平。结果显示,0、0.1、1和2 μg/mL的NMN对C2C12细胞没有毒性作用,并且一定浓度的NMN在一定时间内可以促进细胞活力,提高线粒体膜电位,上调成肌分化相关蛋白MyoG、MyoD1和MYH的表达。上述研究结果表明,一定浓度的NMN在一定时间内可以促进C2C12细胞成肌分化。本研究丰富了NMN的生理作用,为后续NMN在畜牧产业的应用提供新的参考基础。

miR-458b-5p介导Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路来调节鸡(Gallus gallus)卵巢卵泡发育,从而影响家禽产蛋水平。pri-miR-458b的SNP影响miR-458b的加工过程。为探究pri-miR-458b基因多态性与产蛋性状的关系,本研究通过直接测序法检测了pri-miR-458b基因的SNP,并将检测到的SNP与济宁百日鸡的产蛋性状进行关联分析。结果表明,pri-miR-458b基因在鸡群中共检测出30个SNP,有10个位点与产蛋性状相关,其中的rs316393825、rs734005133、rs737338503、rs733344248、rs740622221和rs733777709 6个位点连锁不平衡,其联合基因型对42~49周产蛋数和产蛋总数有显著影响;单倍型AGCGCG可使42~49周产蛋数增加3.29枚,产蛋总数增加8.08枚。相较于AGCGCG型的自由能,GGCGCG型的自由能降低了3.3 kcal/mol,而GTTAAA型的自由能升高了5.3 kcal/mol。GGCGCG型的二级结构稳定性最高,AGCGCG型次之,GTTAAA型最低。本研究可为济宁百日鸡产蛋性状辅助选择提供有利用价值的分子遗传标记。

鸡肉占肉质消费品首位,过多的脂质沉积会降低肉质。研究表明自噬参与肝脏脂质代谢,改善脂质沉积,从而调控禽类脂质代谢。本研究旨在探究自噬相关基因5 (autophagy related gene 5, Atg5)对鸡(Gallus gallus)成纤维细胞系DF-1细胞内的脂质代谢相关基因的影响。根据NCBI数据库中鸡ATG5蛋白(NP_001006409.1)氨基酸序列,利用ExPASy数据库对鸡ATG5蛋白进行理化特性分析;利用qPCR技术检测鸡各组织中Atg5基因的表达情况;构建过表达重组质粒pcDNA3.1-Atg5,并且利用RNAi技术干扰Atg5表达;最后,检测干扰和过表达Atg5后相关脂代谢基因：载脂蛋白B (apolipoprotein, ApoB)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FASN)、乙酰辅酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase, ACACA)、过氧化物酶体增殖物激活受体-α (peroxisome proliferator-activated receptor-α, PPARα)、叉头转录因子-1 (forkhead box protein-1, Foxo1)、脂肪酸结合蛋白7 (fatty acid-binding protein 7, FABP7)、分拣蛋白1 (sortilin 1, Sort1)的表达情况;结果表明：鸡ATG5蛋白是相对分子质量为32.478 kD的不稳定蛋白质,Atg5在各组织中均有表达,其中以胸肌组织中表达量最高;此外,成功构建过表达载体pcDNA3.1-Atg5,筛选出最优干扰siRNA—siRNA-330,过表达或干扰Atg5基因对其他脂代谢相关基因的表达情况均有影响;其中,过表达Atg5后,ApoB的表达量显著降低,Sort1的表达量显著增加,FABP7变化不显著;干扰Atg5后,FABP7和ApoB的表达量显著提高,Sort1变化不显著,推测三者与Atg5可能存在潜在联系。本研究为进一步研究鸡Atg5基因的功能提供参考依据。

黑番鸭(Cairna moschata)是优良的瘦肉型肉鸭,耐旱、耐粗饲,在养禽业中具有重要价值和特殊地位;但是就巢性强、繁殖力低,严重制约其产业发展。本研究分别采集就巢期和产蛋期各3只黑番鸭的卵巢组织,以TRIzol法提取卵巢组织总RNA,构建文库并分析2组miRNA的差异表达;随后对miRNA进行靶基因预测,并对靶基因进行GO和KEGG分析;最后通过qPCR验证高通量测序结果的可靠性。结果显示,测序产出的原始数据(raw reads)均超过11 099 443条,过滤后序列所占比例均高于96.15%,可用于后续分析;经比对鉴定获得344个miRNAs,包括275个已知miRNAs和69个新发现的miRNAs;与产蛋期比较,就巢期黑番鸭卵巢组织中筛选到16个差异miRNA,其中5个上调、11个下调,并预测到440个靶基因,其中生长激素促分泌素受体(growth hormone secretagogue receptor, GHSR)、卵泡抑素(follistatin, FST)等靶基因与繁殖及卵巢发育相关,推测其对应的gga-miR-16c-5p、gga-miR-146a-3p、novel_247、novel_325等miRNAs可能与黑番鸭就巢性状相关;GO富集分析表明,与繁殖发育相关的过程有染色体组织(chromosome organization)、核染色体(nuclear chromosome)、纺锤体微管(spindle microtubule)、核酸结合(DNA binding)和核苷酸激酶活性(nucleotide kinase activity)等;KEGG通路注释结果显示,234个靶基因注释到101个信号通路上,包括Wnt和胰岛素信号通路等可能与生殖细胞增殖分化及发育相关的通路。qPCR验证结果显示,上调和下调miRNAs的相对表达量变化趋势均与高通量测序结果一致。本研究筛选了黑番鸭就巢性状关键miRNAs,为从转录或转录后调控层面分析黑番鸭就巢机制、加快高产新品系的选育提供基础资料。

小瓜虫病病原体为多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifiliis),具有高发病率和高死亡率,且缺乏有效的治疗手段,对水产养殖业构成了巨大威胁。本研究旨在观察虹鳟(Oncorhynchus mykiss)感染多子小瓜虫后鳃和皮肤的组织病理学变化,并揭示虹鳟Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)信号通路在多子小瓜虫感染后的免疫作用。通过组织切片和扫描电镜对感染多子小瓜虫的虹鳟(处理组)和健康虹鳟(对照组)的鳃和皮肤进行观察,并采用qPCR检测TLR信号通路中TLR2、TLR3、TLR4基因以及肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白介素-1β (interleukin-1β, IL-1β)、干扰素-γ (interferon-γ, IFN-γ)基因在鳃、皮肤、肝脏、头肾、脾脏、肠道中的表达动态。结果表明,小瓜虫寄生严重损伤皮肤和鳃的结构,皮肤表面有大量不规则分泌物,表皮与真皮层出现空隙,空隙间寄生了大小不等的小瓜虫滋养体;鳃丝受损脱落,鳃小片变形扭曲,鳃丝小骨肿胀变形;与对照组相比,处理组TLR2在鳃和皮肤中表达量显著升高,分别是对照组的17.19倍和30.57倍(P<0.05),在脾脏中表达量显著降低(P<0.05),是对照组的0.65倍,在其他组织中无显著性差异;TLR3基因在鳃、皮肤、脾脏和肠道中表达量显著升高(P<0.05),分别是对照组的3.8倍、14.09倍、1.66倍和1.89倍,在肝脏和头肾中无显著性差异(P>0.05);TLR4基因在皮肤中表达量显著升高(P<0.05),为对照组的2.24倍,在肝脏和鳃中的表达量显著降低(P<0.05),是对照组的0.36倍和0.22倍,在其他组织中无显著性差异(P>0.05)。与对照组相比,处理组TNF-α基因在鳃、皮肤和头肾中表达量显著升高(P<0.05),IL-1β和IFN-γ基因在本研究所有组织中均显著升高(P<0.05),TNF-α在皮肤中的表达量最高为对照组的8.22倍,IL-1β在头肾中的表达量最高为对照组的14.6倍,IFN-γ在肠道中的表达量最高为对照组的5.1倍。小瓜虫感染对鳃和皮肤造成了严重损伤,TLR信号通路参与了虹鳟感染小瓜虫后的防御机制,且该通路上基因表达存在组织特异性,虹鳟感染小瓜虫后建立了全身免疫机制,产生了多种免疫应答。本研究揭示了虹鳟感染小瓜虫后组织病理学变化及TLR信号通路在抵抗小瓜虫感染上的作用,为虹鳟小瓜虫病的防治提供了理论参考。

光照强度是水产养殖的一个重要环境因子,可影响养殖品种的生理行为和新陈代谢。本研究以中等光强(约250 lx)为对照组,用低光强(10 lx)和高光强(1250 lx)对卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)进行急性胁迫(36 h),利用液相色谱-质谱联用(LC/MS)的代谢组学技术,结合主成分分析(principal component analysis, PCA)和正交偏最小二乘判别法(orthogonal projections to latent structures discriminant analysis, OPLS-DA)等统计方法对卵形鲳鲹的肝脏差异代谢物进行筛选和鉴定,并利用MetaboAnalyst数据库进一步分析相关代谢通路。结果显示,与对照组相比,10 lx组有102种代谢产物的含量发生显著变化,富集在39条代谢通路中,主要包括β-丙氨酸代谢(β-alanine metabolism)、酪氨酸代谢(tyrosine metabolism)、L-谷氨酸代谢(L-glutamate metabolism)、不饱和脂肪酸的合成(biosynthesis of unsaturated fatty acids)等。1 250 lx组有55种代谢产物的含量发生显著变化,富集在27条代谢通路中,主要包括葡萄糖代谢(glucose metabolism)、生物素代谢(biotin metabolism)、硫铵代谢(thiamine metabolism)、丙酮酸代谢(pyruvate metabolism)、牛磺酸及次牛磺酸代谢(metabolism of taurine and hypotaurine)等。通路分析表明低光胁迫抑制了卵形鲳鲹的氨基酸代谢和脂肪酸合成,鱼体通过降低运动量、增强免疫功能和抗氧化能力等方式适应低光环境;高光胁迫促进了卵形鲳鲹的葡萄糖生成,抑制了丙酮酸代谢和牛磺酸合成,在一定程度上影响了鱼体的营养代谢和免疫功能。本研究为卵形鲳鲹养殖参数的设定提供了参考数据。

bZIP (basic leucine zipper, bZIP)转录因子广泛存在于植物病原真菌中,在病菌的形态建成和侵染过程中起着重要的调控作用。灰葡萄孢(Botrytis cinerea) bZIP转录因子家族的系统研究少有报道。本研究利用生物信息学方法,在全基因组水平上对灰葡萄孢bZIP家族基因进行鉴定,并对其蛋白理化性质、系统进化关系、保守结构域及其在病菌分生孢子发育时期和侵染时期的表达规律进行分析。同时,利用qPCR技术,检测灰葡萄孢bZIP家族基因在NaCl、H₂O₂处理后的表达情况。结果发现,灰葡萄孢基因组中共包含16个bZIP家族基因,系统进化分析将其分为4个亚家族;灰葡萄孢bZIP家族基因均含有bZIP家族典型的BRLZ结构域,部分基因在分生孢子的不同发育和侵染时期上调表达,在NaCl和H₂O₂处理后显著下调表达,表明灰葡萄孢bZIP家族基因在病菌生长发育、侵染过程以及响应盐胁迫和氧化胁迫方面发挥重要的作用,本研究为阐明灰葡萄孢bZIP家族基因的功能及其作用机制提供了理论依据。

由辣椒疫霉(Phytophthora capsici)引起的辣椒疫病是一种毁灭性土传病害,在世界各大辣椒(Capsicum annuum)产区均有发生,严重威胁辣椒生产。本研究通过平板对峙法对枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis) BS193菌株的拮抗活性进行测定,结果表明,其对6种植物病原卵菌具有显著抑制作用,其中对辣椒疫霉的抑制率达到66.70%。离体叶片接种实验结果显示,菌株BS193能够有效抑制辣椒疫霉菌的侵染,其防效达到63.50%;室内盆栽实验发现,菌液灌根浓度为1×10⁸ cfu/mL、接种3 d时防病效果最好,高达89.52%。用20 mL浓度为1×10⁸ cfu/mL的BS193菌株发酵液对辣椒幼苗灌根处理30 d后,其株高、根长、鲜重和干重分别增加48.16%~73.27%,表明BS193具有良好的促生作用。该菌株无菌发酵滤液能够抑制辣椒疫霉菌丝生长,导致菌丝分枝增多、畸形皱缩,并抑制孢子囊的产生、游动孢子释放及休止孢萌发,抑制率可达到90%以上。采用固体培养基培养和透明圈检测等方法检测BS193生防相关因子,发现其可以形成生物膜,并且具备产生蛋白酶和纤维素酶的能力。综上,菌株BS193对辣椒疫霉具有显著的拮抗活性,并具有良好的促生作用,本研究为辣椒疫病的有效防控提供了极具应用开发潜力的生防菌株。

无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)表面免疫原性蛋白(surface immunogenic protein, Sip)是罗非鱼(Oreochromis niloticus)抗无乳链球菌病的疫苗抗原开发靶点。为提高重组Sip蛋白的表达量,本文进行了Sip蛋白的密码子优化,并探讨了其优化前后的表达量及免疫原性。根据大肠杆菌(Escherichia coli)的密码子偏好性对Sip基因进行密码子优化,将优化后基因经双酶切后插入到表达载体pCzn1中。将构建的重组质粒pCzn1-Sip转染至大肠杆菌BL21 (Plys)感受态细胞中进行原核表达,经过超声波裂解和Ni柱纯化后,获得Sip上清重组蛋白。通过SDS-PAGE和Western blot方法检测重组蛋白Sip的原核表达效果及特异性。结果显示,PCR扩增得到1 299 bp的Sip优化基因片段,构建的重组质粒pCzn1-Sip经双酶切获得2条分别约为4 400 bp和1 299 bp的片段。测序分析显示,优化后Sip基因的碱基序列与预期一致,氨基酸序列则优化前后一致。SDS-PAGE结果显示成功表达相对分子质量约为53 kD的Sip重组蛋白。蛋白免疫印迹显示优化后Sip重组蛋白具有无乳链球菌抗原反应原性。通过Ni柱纯化、BCA检测后发现,优化后Sip蛋白上清表达量约是优化前的4倍。同时,优化后的Sip重组蛋白对罗非鱼抗无乳链球菌感染表现出69.23%~74.35%的相对免疫保护率。这些结果表明,依据表达菌株大肠杆菌密码子偏好性进行优化Sip蛋白,可有效提高其原核表达量,同时优化表达的Sip蛋白仍具有免疫原性。本研究为罗非鱼链球菌病基因工程疫苗的研发和制备提供了基础数据。

基因编辑技术是对目标基因进行稳定、精准改造的现代育种技术。CRISPR/Cas9（clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9）系统是当下应用最广泛的基因编辑技术,主要是在目标基因的靶位点断开DNA的双链结构,激活DNA损伤修复途径,进而达到准确的基因编辑的目的。近年来,CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑技术在玉米(Zea mays)、水稻(Oryza sativa)和花生(Arachis hypogaea)等重要农作物上应用广泛,在小麦(Triticum aestivum)、棉花(Gossypium hirsutum)和四倍体大豆(Glycine max)等多倍体作物上也实现了基因编辑。本文系统阐述了CRISPR/Cas9基因编辑系统的工作原理,初步明确了其在多倍体作物上的应用及存在的困难和问题,同时对提高多倍体作物基因编辑效率方面提出建议,以期为后续研究提供思路。

动物毛干纤维物种来源鉴定是纺织品检测工作的重要内容之一,具有较大的技术需求。本研究利用物种间线粒体DNA特异性,设计毛绒制品常见动物源包括牦牛(Bos grunniens)、单峰驼(Camelus dromedarius)、双峰驼(Camelus bactrianus)、绵羊(Ovis aries)、山羊(Capra hircus)、普通牛(Bos taurus)及家猪(Sus scrofa)等多个物种的通用引物,同时设计牦牛、骆驼、绵羊、山羊的特异性引物以及绵羊、山羊通用引物。通过对比动物纤维DNA提取方法,建立了从动物毛干中高效提取DNA的实验流程,利用设计的多物种通用引物扩增测序,实现对样本保存状况及混杂程度等进行准确、快速判定,利用设计的各物种特异引物扩增电泳检测,进一步实现快速、低成本的鉴别动物毛干纤维的物种来源。本研究建立了一种准确、快速、简便区别动物毛干纤维物种来源的分子鉴定体系,为动物纺织产品的质量控制提供了技术参考。

肝核因子3β (hepatocyte nuclear factor 3β, HNF 3β)作为一个重要的转录调控因子,参与哺乳动物的前肠胚和肝脏发育以及成体肝内的能量代谢,而HNF 3β在鸡(Gallus gallus)中的功能还不清楚。为研究鸡HNF 3β在肝内糖脂代谢中的作用提供有效的抗体,本研究优化合成了鸡Hnf 3β基因编码区片段,以pET 30a表达载体在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行重组蛋白HNF 3β的表达,用6 mol/L尿素变性包涵体,Ni²⁺对重组蛋白进行亲和层析,并以快速稀释法复性重组蛋白,以离心超滤法收集、浓缩目的蛋白;取纯化的HNF 3β重组蛋白和弗氏佐剂乳化后免疫兔(Oryctolagus cuniculus),制备鸡HNF 3β的抗血清,以酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)测定抗血清效价后,用Protein A法纯化抗体;通过检测鸡肝癌细胞系(leghorn male hepatoma, LMH)中HNF 3β蛋白的表达情况验证所制备抗体的效果。结果表明,优化合成的Hnf 3β基因片段在大肠杆菌中实现了重组蛋白的高效表达;在6 mol/L尿素的变性条件下,Ni²⁺亲和层析一步法获得纯度大于95%的重组蛋白,结合快速稀释法获得了可溶性的重组蛋白HNF 3β;经重组蛋白4次免疫后,抗血清效价超过1∶64 000;免疫印迹结果显示,制备的抗体能特异性的检测出LMH细胞中HNF 3β蛋白的表达。综上所述,本研究利用制备的高纯度重组蛋白HNF 3β免疫兔获得了高特异性和高效价的多克隆抗体,可以为检测鸡HNF 3β蛋白分子及研究其功能提供可靠的抗体。

鸭星状病毒3型(Duck astrovirus-3, DAstV-3)是近年来危害我国养鸭业的新发病原。本研究根据前期从樱桃谷鸭(Anas platyrhynchos domestica)胚中分离鉴定的DAstV-3分离株及已报道毒株的RNA依赖性的核糖核酸聚合酶基因(RNA-dependent RNA polymerase, RDRP)特征设计特异性引物,建立检测DAstV-3的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果表明,该方法的标准曲线循环域值(Ct)与标准品模板浓度在1.15×10¹~1.15×10⁷拷贝/μL间线性关系良好,相关系数R²和扩增效率分别为0.999和2.08;该方法特异性强,仅可检出DAstV-3,而对鸭常见疫病病原(DAstV-1, DAstV-2, 禽流感病毒H9 (H9 subtype Avian influenza virus), 禽坦布苏病毒(Avian tambusu virus), 鸭呼肠孤病毒(Duck reovirus), 番鸭细小病毒(Muscovy parvovirus))检测均为阴性;灵敏度高,其最低检测下限为23拷贝;并且重复性好,批内和批间重复试验变异系数分别为0.14%~0.65%和0.53%~0.94%,均低于1%。利用该方法对2018年6月至2021年3月的209份疑似DAstV-3感染病例样品进行检测,DAstV-3的阳性检出率为56.5% (118/209)。综上结果表明,本研究所建立的方法特异性强、灵敏度高、稳定性好,为DAstV-3感染的快速诊断和流行病学监测提供了有力的技术支持。