八聚体结合转录因子4 (octamer-binding transcription factor 4, OCT4)属于POU (Pit-Oct-Unc)家族转录因子,在早期胚胎、胚胎干细胞及生殖细胞中特异性表达。研究OCT4在猪(Sus scrofa)早期胚胎发育中的表达规律和功能,对于解析早期发育机制和多能性调控具有重要意义。本研究通过免疫荧光和qPCR技术对OCT4在猪早期胚胎中的分布和表达模式进行检测。结果显示,在孤雌激活胚胎、体外受精胚胎和体细胞核移植胚胎中,OCT4蛋白在体外培养的胚胎2-细胞期到桑葚期的卵裂球中广泛表达,在囊胚期的内细胞团和滋养层同时表达;OCT4在孤雌激活胚胎和体外受精胚胎中的基因表达呈现相似模式,均在2-细胞期开始下降、在8-细胞期开始升高,在囊胚的滋养层中表达;在滋养层中特异性过表达OCT4,胚胎的细胞数和直径均显著增加,滋养层发育相关基因E74样因子5 (E74-like factor 5, ELF5)下调表达、EOMES (eomesodermin)显著上调表达,成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)信号通路相关基因显著下调,极化基因PKCα (protein kinase Cα)和ERZIN显著下调,甲基化基因TET1显著上调、DNA甲基转移酶3B (DNA methyltransferases 3B, DNMT3b)显著下调。上述结果表明,OCT4在第一次谱系分化后的滋养层中持续表达,可能对滋养层增殖具有调控功能。本研究为深入探讨猪早期胚胎发育机制及猪胚胎干细胞的建立提供基础资料。

赤霉病(Fusarium head blight, FHB)严重威胁小麦(Triticum aestivum)生产,已成为影响小麦产业可持续发展的世界性难题。20世纪90年代中期以来,该病在河北省由零星出现逐渐演变成连片发生,年均发生面积26.7万hm²以上,已成为小麦主要病害之一。本研究运用MaxEnt模型对该病在河北省的发生风险区进行了预测,采用Z-score标准化法对2003~2018年河北省小麦赤霉病发生面积和发生面积比等相关数据进行标准化处理,分析其发生时空特征;基于河北省小麦赤霉病发生分布特点和环境变量数据,运用MaxEnt模型预测小麦赤霉病在河北省的发生风险,并通过接受者操作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线下面积(area under the curve, AUC)评估预测模型的精度。结果表明,河北省小麦赤霉病发生存在中等以上空间相关性;MaxEnt模型预测结果的AUC值为0.816,表明小麦赤霉病预测发生风险与其实际分布拟合度较好。小麦赤霉病发生高风险区、中等风险区面积分别占河北省总面积的14.98%、10.19%,主要集中在冀中、冀南麦区;其中,保定南部、石家庄中部和东部、衡水、邢台中部和东部、邯郸中部和东部等66县为高风险区。通过Jackknife刀切法获取的环境变量重要性分析结果表明,最暖季度平均温度(Bio 10)、最暖月最高温度(Bio 5)、最冷季度平均温度(Bio 11)、最冷月最低温度(Bio 6)对小麦赤霉病发生影响较大。其中,Bio 10相对贡献率最高,达67.9%,重要性占22.2%。河北省小麦赤霉病中高风险区面积占河北省总面积25.17%,主要集中在河北省中南部,且该病发生存在较高风险。该模型的建立可为病害预测预报和有效防控提供依据。

类萌发素蛋白(germin-like proteins, GLPs)是一类在植物中普遍存在的防御应答相关蛋白,在植物应答病原微生物侵染及非生物胁迫过程中发挥着重要作用。然而,该蛋白家族在玉米(Zea mays)全基因组中的鉴定及其能否响应玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)的侵染过程尚未见报道。本研究利用生物信息学手段、在全基因组水平上对玉米GLPs家族基因(ZmGLPs)进行了鉴定,并对其序列特征、染色体定位、基因重复关系、保守基序和进化关系等进行了分析,同时利用转录组数据初步分析了其在响应玉米大斑病菌侵染过程中的表达水平变化。结果发现,玉米基因组中共包含57个GLPs家族基因,不同成员编码氨基酸数目为113~671个,差异较大;其中52个ZmGLPs不均匀分布于玉米的10条染色体上,其他5个ZmGLPs位于核外ctg150。根据系统发育分析可将ZmGLPs分为6类,其中clade1中不包含其他物种GLPs。基于本课题组前期获得的转录组数据分析发现,有43个ZmGLPs在大斑病菌侵染玉米过程中表达,根据基因在3个不同时间点(0, 24和72 h)的表达水平将其分为6类,其中表达水平出现显著差异的有27个。本研究不仅明确了玉米全基因组中ZmGLPs基因的数量、特征及其响应大斑病菌侵染的表达,也为深入揭示玉米抵御病原真菌侵染的分子机制提供了理论依据。

抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX)是一种清除活性氧的关键酶,可催化H₂O₂转变为H₂O,在植物逆境胁迫中发挥重要作用。课题组前期通过棉花(Gossypium hirsutum)根部蛋白质组双向电泳筛选到在抗旱和敏旱材料间差异表达且存在序列变异的APX基因。为了探索棉花APX基因的抗旱功能,本研究从陆地棉基因组中鉴定出18个GhAPXs基因,命名为GhAPX01~GhAPX18。系统进化树分析发现,GhAPX家族成员聚为4个亚组;顺式作用元件分析发现,大部分APX家族基因启动子区含有响应脱落酸、水杨酸、赤霉素的顺式作用元件;转录组热图及qPCR结果显示,GhAPX07和GhAPX16在干旱胁迫条件下诱导表达,且在抗旱和敏旱棉花材料中差异表达,推测这两个基因可能在棉花干旱胁迫应答过程中发挥重要作用。上述结果为进一步研究GhAPX基因的抗旱功能及分子机制提供参考依据。

大豆(Glycine max)是我国主要的粮食和油料作物,盐碱和干旱等逆境会对大豆的产量与品质产生严重影响。钙调磷酸酶B样蛋白(calcineurin B-like protein, CBL)是一类钙离子受体,在植物逆境胁迫响应中起重要作用。本课题组前期对大豆CBL基因家族表达模式分析的结果表明,大豆GmCBL7可被高盐和干旱诱导表达。为进一步研究GmCBL7基因与耐盐性和抗旱性的关系,本研究利用反转录PCR (reverse transcription-PCR, RT-PCR)技术从大豆中克隆得到了GmCBL7 (GenBank No. XM 006578843.3)基因。该基因CDS全长672 bp,编码223个氨基酸,蛋白质的分子量为25.8 kD,理论等电点为4.81,属酸性蛋白,具有典型的EF-hand结构域,无信号肽,是非分泌性蛋白。分析系统进化表明,GmCBL7与豆科植物中的同源蛋白处于同一个进化分支,且与野生大豆(Clycine soja)中同源蛋白的亲缘关系最近。构建植物表达载体pCPB-GmCBL7对烟草(Nicotiana tabacum)进行遗传转化,并对转GmCBL7基因烟草的抗逆性生理功能进行分析,结果表明,在高盐(200 mmol/L NaCl)和干旱(20% PEG6000)胁迫处理6和12 h后,转基因烟草植株的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)和过氧化物酶(peroxidase, POD)活性和脯氨酸含量均显著高于野生型(P<0.05),丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量显著低于野生型(P<0.05),说明过表达GmCBL7基因能够提高转基因烟草的耐盐性和抗旱性。本研究为进一步探讨GmCBL7基因的功能提供了依据,并为大豆抗逆育种提供了新的基因。

植物扩展蛋白是一种植物细胞壁蛋白,在植物生长发育过程中发挥重要作用。本课题组前期对甘薯(Ipomoea batatas)块根发育进行了转录组学研究,鉴定到一个扩展蛋白(Ipomoea batatas expansin-A4-like, IbEXPA4)基因在甘薯块根膨大中期显著上调表达。本研究以甘薯品种'桂经薯8号'和'桂紫薯1号'为材料,对扩展蛋白基因IbEXPA4进行克隆和表达分析。结果表明,该基因包含771 bp (GenBank No. MW361490.1)的完整开放阅读框,编码256个氨基酸。生物信息学分析显示,IbEXPA4蛋白的相对分子量为27.53 kD,理论等电点为8.8,不稳定系数为37.96,平均疏水性为-0.117,脂肪系数为65.62,属于稳定亲水蛋白。二级、三级结构预测显示该蛋白主要含有无规则卷曲。对IbEXPA4蛋白的结构进行分析,显示该蛋白在N端具有一段信号肽,不具有跨膜域,含有DPBB_1和 Pollen_allerg_1两个保守结构域。亚细胞定位预测其定位在细胞壁中。进化树分析表明,IbEXPA4基因与三裂叶薯expansin-A4-like基因的同源性最高,为99.22%。荧光定量PCR显示IbEXPA4在'桂经薯8号'和'桂紫薯1号'块根中优先表达,均呈先升高后降低的趋势,均在移栽60 d后的块根中表达量最高,分别为对照(20 d的纤维根)的3.09倍和9.23倍;在茎、叶中表达水平较低。IbEXPA4基因在2个品种块根中的表达量变化比较分析,IbEXPA4基因在'桂紫薯1号'中变化更显著。两个品种的农艺性状分析,发现'桂经薯8号'的块根长显著高于'桂紫薯1号',而'桂紫薯1号'块根直径在60和90 d时显著高于'桂经薯8号'。相关性分析发现IbEXPA4基因在块根中的表达与块根直径、块根长度呈极显著正相关。这些结果说明,IbEXPA4 基因促进块根的纵向生长和横向生长,参与了甘薯块根的生长调节,为阐明甘薯块根膨大的分子机理提供了理论依据。

在改善种子的营养品质和利用种子生物反应器(seed-based bioreactor)生产有工业或药用价值的蛋白质等基因工程实践中,需要使用种子特异性启动子驱动外源基因的转录。种子贮藏蛋白(seed storage proteins, SSPs)为高等植物种子成熟过程中合成并贮存的大量贮藏蛋白质的总称,其基因的启动子是种子特异性启动子的重要来源。为发掘蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)的种子特异性启动子,本研究克隆其主要贮藏蛋白豆球蛋白基因Mt1g072600编码区上游2 075 bp启动子序列(命名为: PMt1g072600),利用网站PLACE和PlantCARE预测顺式作用元件(cis-acting elements),发现其含有E-box、A/T rich element、P-box等多个种子特异性启动子相关顺式作用元件。构建其驱动β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase, GUS)基因的植物表达载体并进行拟南芥(Arabidopsis thaliana)的遗传转化,转基因拟南芥种子中GUS表达情况分析发现,Mt1g072600基因启动子PMt1g072600驱动GUS的表达量极显著地高于PCaMV35S,转基因拟南芥各组织/器官的组织化学染色结果表明PMt1g072600驱动GUS表现出种子表达的特异性。本研究克隆的蒺藜苜蓿来源的种子特异性启动子PMt1g072600,可用于驱动外源基因在转基因植物种子中特异性转录,为植物基因工程领域种子特异性启动子的选择和使用提供参考。

GI (GIGANTEA)是节律相关基因,在植物控制节律输出和开花调控中具有重要作用。为探索GI基因在高羊茅(Festuca arundinacea)中的生物学功能,本研究运用cDNA末端快速扩增法(rapid amplification of cDNA ends, RACE)克隆和染色体步移法扩增得到该基因序列和启动子序列,并对其进行生物信息学分析。序列分析表明,FaGI基因(GenBank No. MZ540915)序列全长3 869 bp,其开放阅读框为3 447 bp,编码1 149个氨基酸。启动子序列2 371 bp,有CURECORECR、GT1CONSENSUS、LTRE1HVBLT49和MYB识别位点多个顺式作用元件。系统进化树表明,FaGI基因编码的蛋白与草甸羊茅(Festuca pratensis)、黑麦草(Lolium perenne)、黑麦(Secale cereale)和小麦(Triticum aestivum)等禾本科植物同源蛋白的进化关系比较近。亚细胞定位显示其定位在细胞核,说明该蛋白可能在细胞核中发挥作用。荧光定量分析不同光照处理和不同发育阶段下的表达模式。结果显示,FaGI基因的表达受光周期和生物钟的调控,不同发育时期其表达量不同,苗期的表达量最高,进入生殖生长阶段其表达量下降。构建p1300-FaGI过表达载体转化拟南芥(Arabidopsis thaliana),结果显示,FaGI过表达拟南芥能上调AtCCA1 (CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1)和AtTOC1 (TIMING OF CAB EXPRESSION 1)表达,下调AtFT (FLOWERING LOCUS T)和AtCO (CONSTANS)表达。该研究结果为后续验证高羊茅FaGI基因功能提供理论依据。

前列腺素E合成酶(prostaglandin E synthase, PTGES)是生物合成前列腺素E2 (prostaglandin E2, PGE2)过程中的末端限速酶,前列腺素E可与其受体特异性结合,参与包括动物生殖在内的多种生理过程。为探索PTGES在高原特种经济动物牦牛(Bos grunniens)生殖系统中的表达,预测其潜在生殖功能,本研究以卵泡期、黄体期和妊娠期的牦牛子宫、卵巢及输卵管为实验材料,构建载体,克隆牦牛PTGES基因并进行生物信息学分析;利用qPCR方法检测牦牛PTGES基因在子宫、卵巢和输卵管中的相对表达量;利用免疫组织化学方法检测PTGES蛋白在子宫、卵巢和输卵管的分布。研究成功克隆了牦牛PTGES基因(GenBank No. MW030282),生物信息学分析预测其编码的蛋白质为亲水性非跨膜蛋白。qPCR检测结果显示,PTGES基因在牦牛输卵管、卵巢和子宫中均有表达,但在黄体期卵巢上的表达量显著高于卵泡期卵巢和妊娠期卵巢(P<0.05);在卵泡期输卵管上表达量显著高于黄体期输卵管和妊娠期输卵管(P<0.05);在卵泡期子宫上的表达量显著高于黄体期子宫和妊娠期子宫(P<0.05)。免疫组织化学结果显示：PTGES在输卵管黏膜上皮,卵巢卵泡膜、颗粒层、黄体细胞、生殖上皮,子宫内膜、子宫腺体和子宫浆膜均有表达。结果表明,牦牛发情周期卵巢、输卵管和子宫生理变化过程中PTGES可能发挥着相应的生理功能,对探索牦牛在高寒低氧环境中特殊生理机制具有重要意义。

本研究旨在探索肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)在奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells, bMECs)中的表达定位及RAS对损伤的调节作用。用不同浓度脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)处理bMECs后,CCK-8(Cell Counting Kit-8)法检测细胞活性,qPCR检测IL-1β、IL-6、 IL-8、TNF-α、ACE2、ACE、MasR和AT1R基因表达水平,酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测上清中AngⅡ和Ang 1-7含量;采用Western blot和细胞免疫荧光测定ACE2蛋白在bMECs中的表达和位置。实验结果表明,ACE2在bMECs中有表达,且定位于胞膜和胞浆;LPS处理bMECs 24 h后产生明显炎性损伤,IL-1β、IL-6、 IL-8、TNF-α、ACE、AT1R基因和Ang Ⅱ蛋白的表达随LPS浓度升高而增加,ACE2和MasR基因的表达随LPS浓度增加而先升高后降低,Ang 1-7蛋白的表达随LPS浓度增加而下降。本研究表明bMECs中存在ACE2、ACE、MasR、AT1R、AngⅡ和Ang1-7等RAS成员,且ACE2/MasR/Ang 1-7和ACE/AngⅡ/AT1R通路参与了LPS诱导的bMECs炎性损伤调控。本实验为研究RAS在乳腺炎中的调控作用及发掘抗炎药物作用新靶点奠定了基础。

牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)感染引起牛病毒性腹泻/黏膜病(Bovine viral diarrhea/Mucosal disease, BVD/MD),会造成犊牛持续性感染和腹泻黏膜病,其中粘膜病的病死率高达100%,对规模化养殖和生物制品安全造成严重威胁。本课题组前期使用Turbo ID系统筛选出UDP-葡萄糖糖蛋白糖基转移酶1 (UDP-glucose glycoprotein glucosyltransferase 1, UGGT1)等多个BVDV感染后的差异基因。为探索UGGT1基因对牛病毒性腹泻病毒复制的影响,本研究利用CRISPR/Cas9技术敲低胎牛肾(Madin-Darby bovine kidney, MDBK)细胞的UGGT1基因,Western blot检测UGGT1基因敲低情况;显微镜观察细胞形态变化,并统计细胞增殖情况;BVDV分离株TC感染UGGT1敲低细胞和阴性对照组Scramble细胞,使用免疫荧光染色、qPCR、致细胞病变效应(cytopathic effects, CPE)及病毒滴度变化检测UGGT1基因对BVDV复制的影响。结果显示,成功敲低MDBK细胞的UGGT1基因;且UGGT1敲低细胞、Scramble细胞与野生型MDBK细胞的形态及生长速度没有差异;与Scramble相比,BVDV感染UGGT1敲低细胞36 h后标记双链RNA (double strand RNA, dsRNA)的绿色荧光明显减少;感染24 h后5'UTR RNA水平显著降低(P<0.05),48 h时具有极显著性差异(P<0.01);BVDV感染36 h后,滴度显著降低(P<0.05);感染36 h后Scramble中大量细胞病变后脱落,UGGT1敲低细胞病变情况明显低于阴性对照。本研究表明敲低UGGT1基因能够抑制BVDV的复制,为防控BVDV新方法的建立提供了重要依据。

矮小鸡(Gallus domesticus)由于其体型小,节约养殖空间等优点常被用于鸡配套系生产。本研究为明确矮小体型芦花鸡的生长激素受体(growth hormone receptor, GHR)基因突变类型,探究正常体型芦花鸡和矮小体型芦花鸡间的生长发育差异,针对矮小体型芦花鸡GHR基因常见的4种突变位点设计引物,以矮小体型芦花鸡的基因组DNA为模板进行PCR扩增,分析其遗传变异类型。同时比较分析了正常体型芦花鸡与矮小体型芦花鸡体重和胫长的发育特点,使用Logistic、Gompertz和Von Bertalanffy 3种数学模型拟合分析了其最适模型和拟合参数。结果显示,与正常体型芦花鸡相比,矮小体型芦花鸡GHR基因缺失了1 781 bp的碱基序列。正常体型芦花鸡与矮小体型芦花鸡在1~13周龄期间发育差异明显,尤其在体重和胫长2个性状对比明显。Logistic是正常体型芦花鸡与矮小体型芦花鸡体重的最优拟合模型(R²>0.990)。对于胫长而言,在雄性芦花鸡中,正常体型芦花鸡的最佳拟合模型为Logistic,矮小体型芦花鸡的最适拟合模型为Von Bertalanffy。在雌性芦花鸡中,正常体型芦花鸡和矮小体型芦花鸡的最佳拟合模型均为Von Bertalanffy。本研究为芦花鸡精细饲养管理和矮小芦花鸡的分子标记辅助育种提供了参考依据。

目前关于鸭(Anas platyrhynchos)中肌细胞增强因子2C基因(myocyte enhancer factor 2C, MEF2C)剪切体的表达尚未开展深入研究。为了解MEF2C基因2个剪切体在组织中的表达差异,本研究运用RT-PCR技术克隆兴义鸭MEF2C基因的全长CDS;运用qPCR技术,检测MEF2C基因在兴义鸭(公和母) 5个不同发育时期的组织表达。结果显示,克隆获得鸭MEF2C基因2个剪切体MEF2C-a (GenBank No. MZ497418)和MEF2C-b (GenBank No. MZ497419);2个剪切体所编码的氨基酸序列与原鸽(Columba livia)、鹌鹑(Coturnix japonica)、原鸡(Gallus gallus)等物种的同源性高达95%以上,说明MEF2C基因在进化过程中具有较高的保守性。qPCR结果显示,MEF2C-a和MEF2C-b在公鸭和母鸭组织中均有表达,在脑、心肌、腿肌和胸肌组织中高表达;2个剪切体在母鸭和公鸭组织中的表达规律不同,在公鸭多数组织中MEF2C-a表达量高于MEF2C-b,在母鸭中则相反;2个剪切体在腿肌和胸肌中的表达不随日龄的增加而升高。本研究结果为进一步探讨MEF2C基因不同剪切体在鸭肌肉发育过程中的作用机制提供基础资料。

枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)菌株Z-5对多种植物病原真菌具有显著的拮抗效果。本研究通过对峙培养法检测菌株Z-5对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的拮抗作用,通过透明圈法检测无菌滤液蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶及嗜铁素活性,利用酸沉淀法提取抑菌物质并采用抑菌圈法检测提取物对尖孢镰刀菌的拮抗效果,利用高效液相色谱(HPLC)对提取物进行分离,通过抑菌圈法对分离的组分进行活性检测,并通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)和二级质谱(mass spectrometry/mass spectrometry, MS/MS)对抑菌物质结构进行鉴定。结果表明,菌株Z-5对尖孢镰刀菌呈现显著的拮抗活性,无菌滤液具有显著的蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶活性及嗜铁素活性。提取物对尖孢镰刀菌呈现显著的拮抗效果并获得3个抑菌活性组分,经鉴定为脂肽类抗生素C14伊枯草菌素A (iturin A)、C15伊枯草菌素A和C14-C18芬芥素A (fengycin A)。枯草芽胞杆菌菌株Z-5合成抑菌物质检测为研究其抑菌机制及生防菌株的有效利用提供了参考依据。

伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)感染猪(Sus scrofa)可引起烈性接触性传染病,即伪狂犬病(Pseudorabies, PR),临床上主要通过疫苗免疫进行防控。PRV变异株(PRVⅡ型)的流行使传统疫苗失去有效保护。近年来出现PRV跨宿主感染人(Homo sapiens)的案例,更使PRV成为全球公共卫生威胁,但其感染致病机制仍不完全清楚。为从分子水平上全面了解PRV感染宿主细胞引起的变化,本研究以PRV Ⅱ型毒株PRV-DX感染猪肾细胞PK-15,通过高通量测序获得PRV感染后全部的细胞差异转录组数据,并对差异表达基因进行功能富集。结果表明,PRV-DX感染PK-15可引起3 595条基因表达上调、3 604条基因表达下调。通过qPCR验证随机选择的12条差异表达基因,其变化趋势与转录组数据一致。GO注释和KEGG信号通路富集将差异表达基因聚焦在代谢、基因表达、免疫等信号通路。本研究为深入解析PRV感染的致病机制提供了重要基础数据及研究方向。

随着恒温扩增技术的快速发展,扩增产物的检测成为限制该技术快速推广和应用的关键。本文结合环介导恒温扩增技术(loop mediated isothermal amplification, LAMP)特点以及传统检测方法,探究了近几年发展起来的新型产物检测方法,如基于反应体系中副产物生成分析的方法、多重靶标检测为目标的方法,以及利用CRISPR/Cas等的序列特异性的可视化检测方法的原理和应用现状,解析了LAMP产物检测面临的机遇和挑战,旨在为核酸分析产业以及基于核酸扩增分析的应用提供支撑。

多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)是一种可以在单个反应中同时对50个靶基因进行定性和半定量分析的检测方法。其主要步骤包括靶序列DNA变性、探针和靶序列DNA杂交、连接酶连接探针、PCR扩增、毛细管电泳及数据分析。多重连接探针扩增技术已广泛应用于肿瘤的诊断与预后、遗传性疾病的基因检测、产前检测等领域。鉴于混合感染现象增加,敏感、特异和高通量检测方法是当前动物疾病检测中的急需,多重连接探针扩增技术在病原微生物的高通量检测领域显示出良好的应用前景。本文从多重连接探针扩增技术的原理和步骤、在病原微生物检测、肿瘤诊断和遗传性疾病诊断中的应用、优势和不足以及应用前景展望等方面进行综述,以期为MLPA技术在动物病原检测和疾病诊断中的应用和改良提供参考。

猪繁殖与呼吸综合征是世界规模化猪场的主要疫病之一,主要由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起。本研究旨在构建PRRSV高致病性毒株HN07-1反向操作系统。通过将基因组进行分段克隆和测序的方法获得HN07-1毒株全长基因组序列。运用反向遗传学技术将全基因组分段克隆至载体上,构建含有全长HN07-1毒株cDNA的感染性克隆pcDNA3.2-rHN07-1,并以此为骨架,构建在PRRSV基因组ORF1b和ORF2a间插入增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)的重组克隆pcDNA3.2-rHN07-1-EGFP;将构建的质粒转染Marc-145细胞拯救病毒。采用免疫荧光实验(immune fluorescence assay, IFA)和Western blot进行表达鉴定并对重组病毒进行滴度测定与分析。结果表明,PRRSV毒株HN07-1基因组全长15 345 nt,转染Marc-145细胞盲传一代后培养48 h出现典型的细胞病变效应,IFA和Western blot检测结果表明,拯救病毒与亲本毒株HN07-1一致,都能检测到PRRSV N蛋白表达。并且拯救病毒与亲本毒株具有相似的生长动力特性。综上所述,本研究成功构建了HN07-1感染性克隆,可用于反向遗传操作,为PRRSV致病机制研究及疫苗研发提供了参考。

伪狂犬病的暴发为其防控带来巨大挑战,建立一种新的特异性高与敏感性强的诊断方法,以及获得有病毒中和效果的抗体,对于该病的防控、治疗至关重要。本研究旨在原核表达出可溶性的抗猪(Sus scrofa) 伪狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV) gE (envelope glycoprotein E)蛋白纳米抗体,并对抗猪伪狂犬病毒gE蛋白纳米抗体在猪伪狂犬病毒的诊断和治疗中的应用进行了初步探索。设计并合成了抗猪伪狂犬gE蛋白纳米抗体基因序列,命名为PRVgENb;将PRVgENb与pET21b载体构建后用大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统进行融合蛋白的原核表达,经Ni²⁺纯化后获得单一纳米抗体PRVgENb;将制备的纳米抗体PRVgENb进行HRP标记后,和PRV毒株用作直接ELISA (direct ELISA)试验和病毒中和试验。结果表明,原核表达与纯化后获得了纯度较高的融合蛋白PRVgENb;直接ELISA结果表明,在抗原浓度一定的条件下,纳米抗体PRVgENb能与特异性抗原在较低浓度条件下结合,具有较高活性,而在抗体浓度一定的条件下,其能敏感的识别低浓度到高浓度区间的特异性抗原;病毒中和试验结果表明,纳米抗体PRVgENb能抑制PRV的复制,有一定的中和活性。本研究建立了稳定获得纳米抗体PRVgENb的方法,并初步探索了其在直接ELISA中的使用,同时证明其能抑制PRV的复制。纳米抗体PRVgENb为PRV的诊断、治疗及后续研究奠定了实验基础。