生长素的极性运输和不对称分布主要由生长素极性输出载体PIN (PIN-FORMED)家族介导,对于植物生长发育具有重要的调控作用。本研究利用生物信息学和转录组测序等技术手段,对铁皮石斛(Dendrobium catenatum) PIN家族成员进行全基因组鉴定,并在系统进化关系、基因结构、蛋白保守基序和结构域组成、启动子顺式作用元件、组织表达谱和胁迫响应方面进行分析。结果显示,铁皮石斛有21个PIN家族成员,包括7个进化支(PIN1/2/3/5/6/8/9);在单子叶特有的PIN9进化支中,DcPIN9成员数量急剧扩增,可能与其特殊的生活方式和生存环境密切相关。DcPIN家族蛋白均含有标志性的N/C端疏水区(各含5个跨膜结构域)和中间的亲水环。DcPIN家族基因的上游启动子区域富含与激素、光、发育、逆境响应相关的顺式调控元件。转录组数据表明,DcPIN家族基因在不同组织中的表达存在明显差异,总体上可分为特异性表达和普遍性表达。不同处理下的转录组和qRT-PCR分析表明,DcPIN1a/9a/9d/9g参与对低温的响应,DcPIN9a/9f/9h参与对干旱的响应,DcPIN3a/9a/9d/9h参与对茉莉酸甲酯的响应,DcPIN1c/3a/9a参与对白绢病原翠雀小核菌(Sclerotium delphinii)侵染的响应。本研究为进一步解析铁皮石斛PIN基因家族在生长发育和环境适应中的功能提供参考依据。

卵形蛋白(ovate family proteins, OFPs)基因家族是植物特有的转录因子之一,在植物响应低温胁迫中具有重要作用。为了探究小麦(Triticum aestivum)中的OFP家族成员及其低温响应特征,本研究在小麦全基因组范围内鉴定OFP基因家族成员并进行生物信息学分析,利用RNA-seq测序数据,分析了不同组织及低温胁迫下小麦TaOFPs的表达模式。结果显示,小麦基因组中共鉴定出100个TaOFPs,在A、B和D亚基因组均匀分布;系统发育分析将小麦、水稻(Oryza sativa)及拟南芥(Arabidopsis thaliana)的OFP基因分为6组,禾本科水稻及小麦OFP基因在进化上更为保守;启动子元件分析结果表明,TaOFP家族基因启动子含有大量茉莉酸甲酯响应元件、脱落酸响应元件、低温响应元件、干旱响应元件等激素和非生物胁迫响应元件;表达模式分析表明,TaOFP家族基因呈现组织和时期特异性表达;冷冻胁迫下,25个TaOFPs基因仅在冷驯化冷冻后呈现差异表达,且TaOFP4-1D,TaOFP10-2B,TaOFP27-4D,TaOFP31-5A和TaOFP33-5D基因在冷驯化冷冻和非冷驯化冷冻后呈现相反表达模式,推测这些基因参与小麦的抗寒性调控。本研究为进一步探究TaOFP基因家族成员的功能及解析其在低温胁迫响应中的调控作用提供参考依据。

NAC (NAM/ATAF/CUC)转录因子是植物中特有且最大的转录因子家族之一,在抵抗逆境胁迫反应、调控植物生长发育、参与器官模式建成以及生长素传导、叶片凋亡等生理过程中具有重要作用。为了鉴定大白菜(Brassica campestris ssp. pekinensis)—结球甘蓝(B. oleracea var. capitata)双单倍体(double haploid, DH)易位系AT1-18中的外源甘蓝NAC086基因,同时了解该基因的功能,以AT1-18及其亲本为研究对象,通过特异性引物设计、PCR扩增片段序列分析、逆转录PCR (reverse transcription-PCR, RT-PCR)、实时定量PCR (real-time quantitative PCR, qRT-PCR)等方法,对大白菜和结球甘蓝NAC086基因进行了鉴定,同时对NAC086基因的组织表达特异性、响应外源生长素或盐水处理后的表达模式进行了研究。结果表明,基于大白菜Bra006392设计的特异性引物仅在大白菜中具有扩增产物,基于结球甘蓝基因Bol034440设计的特异性引物同时在结球甘蓝和易位系中具有扩增产物,且在易位系中扩增产物的序列和Bol034440基因CDS序列的一致性高达99%,证明了在易位系中结球甘蓝的Bol034440基因代换了大白菜的Bra006392基因。RT-PCR分析表明,Bol034440在大白菜不同组织中几乎无表达,在易位系不同组织中具有较高的表达量(依次是根>叶>蕾>花>茎, 其中根与花, 蕾, 茎差异显著)。Bra006392在易位系中除在根中有少量表达外,其他组织几乎无表达;在大白菜叶中表达量显著高于其他组织。Bra008567在大白菜和易位系不同组织中均具有一定表达量,其中在大白菜的根中表达量最高,显著高于其他组织;在易位系的叶中表达量最高,除与根差异不显著,与其他组织均达到显著差异。qRT-PCR分析表明Bol034440和Bra008567基因负向响应外源生长素处理作用,正向响应盐水处理的作用,响应时间均在处理后2 h,其中Bol034440在响应过程中占主导地位。研究结果为开展NAC086基因的功能验证和研究外源甘蓝NAC086基因在大白菜遗传背景下的互作与调控提供了依据。

B-box (BBX)转录因子在幼苗的光形态建成、开花的光周期调节、避光等生长发育过程以及对生物和非生物胁迫的响应中发挥着重要作用。本研究从野生潘那利番茄(Solanum pennellii)中获得了1个BBX蛋白基因,命名为SpBBX1 (基因ID: Sopen02g034260),对其进行了理化性质、蛋白结构、进化树分析,并观察了该转录因子的亚细胞定位,分析了原核表达及胁迫耐受性。结果显示,该基因包含1个1 173 bp的完整开放阅读框,编码390个氨基酸,定位于细胞核;进化树显示其氨基酸序列与栽培番茄(S. lycopersicum)开花期基因SlCONSTANS1 (基因ID: Solyc02g089540)及马铃薯(S. tuberosum) BBX蛋白1 (StB-box1)(基因ID: PGSC0003DMP400017796)亲缘关系最近。SDS-PAGE电泳及Western blot结果显示,SpBBX1重组蛋白的分子量约为48 kD。qRT-PCR分析发现,SpBBX1在茎、叶、花中均有表达,叶片中的表达量最高。原核重组大肠杆菌(Escherichia coli) BL21::pET-30a-SpBBX1在NaCl和甘露醇胁迫下生长显著低于对照菌(P<0.05)。本研究结果揭示了潘那利番茄SpBBX1基因可能在盐胁迫响应中具有负调控效应,为进一步研究植物BBX蛋白的功能提供理论依据。

MYB转录因子在植物生长发育和抵御胁迫中起着重要的作用。为开展烟草(Nicotiana tabacum) NtMYB4a的功能研究和新种质的创制,本研究以NtMYB4a为靶基因,根据其CDS序列在第1和第3外显子上选定两个靶标Y1和B1,分别合成Oligo二聚体后和CRISPR载体连接,转化大肠杆菌(Escherichia coil)感受态DH5α后提取质粒并测序,将测序正确的质粒Y1-1和B1-1经LguⅠ酶切后用T₄连接酶进行重组连接,成功构建了CRISPR/Cas9编辑系统的双靶标敲除载体,利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的叶盘法来转化烟草,经PCR和测序鉴定获得29株阳性植株,阳性率为24.37%,其中15株在靶点和非靶点处发生了不同程度的突变,共有4种突变类型,突变率为51.72%。初步观察发现NtMYB4a编辑T₀代植株出现不同程度的矮化和花色变异,甚至死亡。qRT-PCR分析发现T₀代植株花、茎、叶中NtMYB4a表达量不同程度下调。本研究为后续开展NtMYB4a的功能和以NtMYB4a为节点的分子调控机制研究提供了基础资料。

赤霉素(gibberellin, GA)、脱落酸(abscisic acid, ABA)和生长素(auxin, IAA)作为植物体内的內源调节激素,对植物生长发育以及植物对逆境胁迫的响应起着重要作用。赤霉素双加氧酶(gibberellin 20-oxidase, GA20ox)是赤霉素合成途径最后阶段的关键限速酶;9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase, NCED),是脱落酸间接合成途径的关键限速酶;生长素应答蛋白(auxin/indole-3-acetic acid, AUX/IAA)可负调控IAA的合成。本研究使用酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)测定了浙贝母(Fritillaria thunbergii)鳞茎发育过程中GA、ABA、IAA的含量变化。结果显示,随着鳞茎发育,GA含量呈下降趋势,ABA含量呈上升趋势,IAA含量大致呈下降趋势。采用同源克隆结合cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术成功克隆了浙贝母的基因GA20ox (GenBank No. MW238816)、NCED (GenBank No. MW238817)和IAA (GenBank No. MW238818);生物信息学分析显示,GA20ox基因cDNA序列全长1 490 bp,开放阅读框为1 122 bp,编码373个氨基酸;NCED基因cDNA序列全长2 270 bp,开放阅读框为1 800 bp,编码599个氨基酸;IAA基因cDNA序列全长1 255 bp,开放阅读框为864 bp,编码287个氨基酸。qRT-PCR分析表明,GA20ox、NCED和IAA的组织特异性表达类似,在根、茎、叶中的表达量均高于鳞茎中的;不同发育时期鳞茎的GA20ox、NCED、IAA基因表达量与GA、ABA、IAA的相关性分析显示GA20ox、NCED与GA、ABA含量呈极显著正相关(P<0.01),IAA与IAA的含量呈极显著负相关(P<0.01)。本研究对GA20ox、NCED、IAA基因在GA、ABA、IAA代谢中的功能研究提供了理论依据,为进一步探究GA20ox、NCED、IAA基因在浙贝母鳞茎发育过程的分子机制提供参考。

热休克转录因子1 (heat shock transcription factor 1, HSF1)是启动热休克蛋白基因表达的重要转录因子,对其进行深入研究有助于阐明HSF1对热应激反应的调控机制。本研究采用反转录PCR (reverse transcription-PCR, RT-PCR)技术对中国荷斯坦奶牛(Bos taurus) HSF1基因全长CDS进行克隆,并采用生物信息学技术分析其编码蛋白的生物学特性。结果显示,奶牛HSF1基因的3种剪接体被成功克隆,即HSF1-AS1 (GenBank No. MW401766)、HSF1-AS2 (GenBank No. XM_005215151.4)和HSF1-AS3 (GenBank No. MW401767),剪接方式分别为外显子跳跃、内含子保留和可变的3'端位点。开放阅读框分析发现,HSF1的3种剪接体分别编码311、553和517个氨基酸。对本实验室前期的乳腺组织RNA-seq数据进行分析,结果显示,HSF1-AS2剪接体表达量最高(P<0.01),HSF1-AS1表达量最低(P<0.01)。qRT-PCR检测结果显示,热应激使乳腺上皮细胞HSF1-AS1和HSF1-AS2表达水平显著上调。对剪接因子结合位点进行分析,发现HSF1基因第11外显子的SNP (18959 C>T)恰巧处于一个潜在的外显子剪接增强子(exonic splicing enhancer, ESE)区域,可能与HSF1-AS3的形成有关。基因进化分析发现,牛HSF1氨基酸序列与山羊(Capra hircus)同源性较高。本研究为深入阐明HSF1基因表达调控机制提供参考依据。

牛奶中的长链脂肪酸(long chain fatty acids, LCFA)尤其是长链多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFA)有助于降低人类(Homo sapiens)患心血管疾病、癌症、二型糖尿病的风险。但目前对乳腺组织中LCFA合成、代谢的分子机制知之甚少。脂肪酸转运蛋白6 (solute carrier family 27 member 6, SLC27A6)的主要功能是促进细胞从外界摄取LCFA,进而参与细胞内的各类脂质代谢。但是目前SLC27A6与乳腺脂质代谢基因之间的调控关系尚不明确。本研究利用siRNA干扰技术干预奶牛(Bos taurus)乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells, BMECs)中SLC27A6的表达,采用荧光定量PCR分析乳腺细胞中SLC27A6和脂质代谢相关基因的表达,利用Western blot技术分析了蛋白的表达变化,并对细胞内甘油三酯含量和脂肪酸组成的变化进行分析。结果显示,与对照组相比,转染siRNA SLC27A6-Bos-915后,SLC27A6基因和蛋白质的表达量明显下降,细胞内参与脂肪酸激活和转运的关键基因长链脂肪酸乙酰辅酶A合成酶4基因(long-chain acyl-CoA synthetase 4, ACSL4)和脂肪酸转运蛋白基因CD36、脂肪氧化相关基因肉毒碱棕榈酰转移酶基因(carnitine palmitoyl transferase 1A, CPT1A)的表达量下降,过氧化物酶体增生激活受体γ (peroxisome proliferative activated receptor gamma, PPARG)、脂肪酸结合蛋白(fatty acid binding protein 3, FABP3)基因及脂肪酸去饱和酶(fatty acid desaturase 2, FADS2)基因的表达量上升。与此同时,细胞内的甘油三酯含量上升,棕榈酸(C16∶0)和硬脂酸(C18∶0)的含量降低,油酸(C18∶1cis9)和花生四烯酸(C20∶4cis5,8,11,14)的含量上升。本研究可为解析SLC27A6在调节奶牛乳腺脂质代谢中的机制提供参考,为实现乳成分的定向遗传调控,生产优质原料奶提供理论依据。

在卵巢卵泡发育过程中,卵母细胞与周围颗粒细胞之间形成缝隙连接通道,介导胞间通讯和物质转运,缝隙连接内在化可导致缝隙连接降解,是由网格蛋白介导的内吞过程(clathrin-mediated endocytosis, CME)。为了揭示CME对从江香猪(Sus scrofa)卵巢功能的调节作用,本研究以未发情期为对照,利用转录组测序技术,通过Limma、DESeq2和rMATS等软件以及逆转录PCR等技术,分析从江香猪发情期卵巢CME相关基因的表达和转录本发生的可变剪接。从江香猪卵巢中检测到8个CME基因表达,包括DAB衔接蛋白2 (DAB adaptor protein 2, DAB2),衔接蛋白复合体2亚基μ1 (adaptor related protein complex 2 subunit μ1, AP2M1), 网格蛋白轻链(clathrin light chain, CLT) A (CLTA)和B (CLTB), 动力蛋白1 (dynamin-1, DNM1), 肌球蛋白Ⅵ (myosin Ⅵ, MYO6),动力蛋白2 (dynamin-2, DNM2)和网格蛋白重链(clathrin heavy chain, CLTC),其中差异表达的基因有DAB2、AP2M1和CLTB;除了CLTB外,其余7个基因在发情和未发情卵巢之间发生差异的可变剪接,这些可变剪接产生的7个转录本是目前Ensembl数据库暂未收录的新转录本。说明可变剪接是从江香猪发情过程中卵巢功能重要的调控方式,以CME过程中产生新的转录本和蛋白的方式组建蛋白互作网络。结果表明,通过转录和转录后水平调控CME相关基因的表达和转录本的剪接,来影响缝隙连接的内在化,从而调节从江香猪卵巢的功能。本研究有助于提高对猪转录后调控过程的认识,对从转录组水平解析猪卵巢功能的分子调节机制具有重要意义。

随着蛋鸭(Anas platyrhyncha)养殖集约化程度不断提高,夏季持续高温引起的热应激问题给蛋鸭安全生产带来严峻挑战。为阐明热应激对蛋鸭肝脏蛋白表达的影响及探索差异蛋白基因的功能,本研究选取产蛋高峰期(245日龄)的绍兴鸭进行热应激处理(40 ℃),采集肝脏组织,应用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantification, iTRAQ)和液相色谱质谱串联(LC-MS/MS)技术,共鉴定到98个热应激肝脏差异表达蛋白,其中热休克蛋白60 (heat-shock protein 60, HSP60)表达极显著上调(P<0.01)。KEGG通路分析结果显示,热应激后差异蛋白显著富集于15个代谢通路,其中糖酵解和糖异生、三羧酸循环和丙酮酸等代谢途径可能与热应激反应存在相关性。GO生物学过程富集分析显示翻译延伸、葡萄糖分解、糖酵解等代谢过程相关蛋白显著富集。应用RNA干扰技术,通过筛选和优化HSP60-siRNA干扰条件,将HSP60-siRNA转染入鸭肝细胞。采用实时荧光定量PCR反应检测发现,与阴性对照组相比,处理组HSP60基因表达量降低75.69% (P<0.01),细胞色素C氧化酶基因(cytochrome C oxidase, CCO)和应激活化蛋白激酶基因(stress-activated protein kinase, SAPK)表达极显著升高(P<0.01),蛋白激酶B基因(protein kinase B, PKB)表达极显著降低(P<0.01),肿瘤坏死因子凋亡诱导因子受体基因(tumor necrosis factor-related apoptosis inducing receptors, TRAIL-Rs)表达无显著差异(P>0.05)。结果表明,急性热应激条件下蛋鸭肝脏中HSP60表达量显著增加,通过调控细胞凋亡信号通路关键基因的表达来抑制细胞凋亡。本研究初步探索了蛋鸭热应激发生机理,有助于预防控制蛋鸭热应激发生。

半番鸭(Cairina moschata)为番鸭和家鸭(Anas plalyrhynchas var. domestica)的属间杂交后代,具有很强的杂种优势,但无实际种用价值。在实际生产中需要饲养半番鸭父母本,并借助于人工授精技术进行繁殖,过程繁琐且饲养管理成本高,严重限制了半番鸭生产的发展。由于半番鸭不育性状的特殊性,其与母本北京鸭卵巢组织差异表达基因的分析尚未有报道,GenBank序列数据库中相关基因的信息也相对匮乏,其不育遗传基础需进一步深入研究。转录组测序(RNA-Seq)技术不仅可用于病毒感染后组织变化分析,还可用于基因挖掘及功能注释。为了探究半番鸭卵巢发育不全相关基因与不育的分子机制,本研究利用转录组高通量测序技术筛选半番鸭和北京鸭卵巢组织分化发育相关的差异表达基因,并进行基因本体(Gene Ontology, GO)和KEGG功能注释,再利用qRT-PCR技术对差异表达基因进行验证。本次测序共获得43.84 Gb高质量测序标签(clean data)和193 535条Unigene。两种类型鸭间共发现89个包括与卵巢发育、性激素合成及生殖细胞分化发育相关的差异表达基因,其中72个基因在半番鸭中上调表达,17个基因下调表达,GO功能注释差异基因富集到591个GO条目(term)中,其中显著富集的钙介导的信号传导与分化发育相关。KEGG通路(pathway)分析结果显示,差异表达基因共富集到15条信号通路中,包括与性激素合成、分泌相关的糖苷脂类生物合成-神经节系列、类固醇激素生物合成通路和酪氨酸代谢。qRT-PCR结果显示半番鸭中上调、下调基因的表达趋势与转录组测序结果一致,表明转录组测序数据较为可靠。本研究为探究半番鸭特殊的生殖系统分化机理提供理论参考依据。

CRISPR/Cas9是对靶向基因进行特定DNA修饰的基因编辑技术。基于其设计简单、成本较低和效率较高等优点,在哺乳动物中已被广泛应用于基因功能研究。在鱼类中,CRISPR/Cas9技术多用于模式鱼及淡水鱼类中基因的敲除,从而对基因的功能进行研究,而在海水鱼类特别是鲆鲽鱼类中相关研究还较少。牙鲆(Paralichthys olivaceus)是我国重要的海水养殖鱼类,具有较高的经济价值。本研究首先在低浓度条件下(Cas9 message RNA (mRNA)和向导RNA (guide RNA, gRNA)浓度分别为250和100 ng/μL)对牙鲆肌肉发育相关基因肌分化因子(myogenic differentiation, myod)和性腺分化与发育相关基因接头相关蛋白复合物3 (adaptor-related protein complex 3, ap3)、脊椎蛋白1 (R-spondin 1, rspo1)及轴丝动力蛋白轻中链1 (dynein axonemal light intermediate chain 1, dnali1)(dnali1-part A和dnali1-part B)基因进行编辑,其中,dnali1-part A和dnali1-part B各设计2个gRNA位点,其余基因均设计1个。结果显示,rspo1、myod及dnali1-part A编辑实验鱼苗中均未检测到突变体,ap3基因突变率小于14.3%,而dnali1-part B突变率约为42.9%~45%。提高注射浓度至Cas9 mRNA 1 500 ng/μL和gRNA 1 000 ng/μL后,dnali1-part B突变率提高至65%。同时,单个个体检测的突变率也由10%~20%提升至80%~90%。进一步用高浓度条件对牙鲆原始生殖细胞(primordial germ cells, PGCs)标志基因dead end (dnd)、两性mab-3转录因子1 (doublesex and mab-3 related transcription factor 1, dmrt1)和17β羟类固醇脱氢酶1 (hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 1, 17β-Hsd1)基因(2个gRNA)进行编辑,初孵仔鱼检测的各基因突变效率均为60%~80%。研究结果表明,低浓度条件下1个gRNA位点的基因编辑效率较低,仅为14.3%~45%,而高浓度下2个gRNA位点的基因编辑效率明显提高,可达60%~80%。本研究初步建立了牙鲆CRISPR/Cas9基因编辑方法,并为其在鲆鲽鱼类中的应用提供参考。

丙烯酰胺(acrylamide, ACR)广泛用于土壤稳定化、水处理、工业产品和某些食品中,是重要的环境胁迫因子之一,其毒性正在引起全球关注。本研究以3日龄斑马鱼(Danio rerio)仔鱼和实验室自主培养的斑马鱼肠细胞(zebrafish intestine cells, ZFI)为研究对象,利用凝集素荧光标记技术和qRT-PCR对氧化应激反应代表基因谷胱甘肽硫还原酶(glutathione-disulfide reductase, GSR)、内质网应激反应代表基因X盒结合蛋白1 (X-box binding protein 1, xbp1u)、渗透压应激反应代表基因水通道蛋白4重组蛋白(recombinant aquaporin 4, aqp4)和应激信号通路结合蛋白钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ (calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ γ2, CaMK2g2)进行表达检测。结果表明,凝集素点印迹显示,与0 mmol/L ACR耐受情况相比,12.5、25.0 mmol/L ACR耐受浓度下怀槐凝集素Ⅱ (maackia amurensis lectin Ⅱ, MAL-Ⅱ)、小麦胚芽凝集素(wheat germ agglutini, WGA)和花生凝集素(peanut agglutinin, PNA)的条带均在斑马鱼仔鱼及ZFI的45~60 kD中出现不同程度的变浅,其中ZFI在25.0 mmol/L耐受浓度下的凝集素条带改变更为明显。此外,在25.0 mmol/L ACR浓度下,ACR毒性对机体(18 h)和细胞(5 h)的损伤最大,qRT-PCR结果表明与上述应激反应相关的4个基因有所关联：对ZFI而言,aqp4、xbp1u表达量极显著上调(P<0.01),CaMK2g2、GSR表达量显著上调(P<0.05);对斑马鱼仔鱼而言,aqp4的表达量显著性升高(P<0.05),xbp1u、GSR表达量极显著性上调(P<0.01),CaMK2g2表达量无显著性改变(P>0.05)。上述结果表明：ACR毒性对细胞造成损伤的同时兼具全身性,并且其毒性作用机制与非生物性胁迫应激响应机制高度相关。本研究揭示了鱼体对ACR胁迫应激响应机制,有利于保护鱼类等水生生物免受ACR毒性侵扰。

堇叶碎米荠(Cardamine violifolia)是我国学者发现的一种药食同源高聚硒植物,能够将无机态硒转化成有机态硒代胱氨酸,并在植物体内聚积。微生物能够转化硒的形态,可能有助于堇叶碎米荠硒元素的吸收与聚积。然而,有关堇叶碎米荠内生菌的研究较少,未见系统的内生细菌和真菌分离鉴定的报道。本研究从堇叶碎米荠中纯化得到6株内生细菌,其中4株可将0.01 mol/L亚硒酸钠转化为纳米硒;其中内生细菌SX-18的硒耐受浓度可达0.20 mol/L,经鉴定为肠杆菌属(Enterobacter sp.),可将0.02 mol/L亚硒酸钠转化为纳米硒,24 h的转化率为46.96%。内生真菌纯化得到5株,对亚硒酸钠均有耐受能力;其中内生真菌SZ-5对亚硒酸钠的耐受浓度可达0.16 mol/L,经鉴定为毛盘孢属(Colletotrichum sp.),可将0.02 mol/L亚硒酸钠转化为纳米硒,48 h的转化率为19.34%。本研究丰富了堇叶碎米荠的内生菌种资源,为后续研究内生菌与富硒植物的互作以及硒污染场地的生物修复提供了研究材料。

AP2/ERF家族的BBM(BABY BOOM)转录因子是调控植物细胞全能性的关键基因,最新的研究发现该基因是植物‘孤雌生殖’的标记基因,在成功构建水稻(Oryza sativa)的无融合生殖体系中发挥了重要作用。本文总结了BBM基因的主要生物学功能,重点探讨了草地早熟禾(Poa pratensis)无融合生殖遗传机制的研究进展及BBM基因在草地早熟禾无融合生殖中的应用前景,以期为利用无融合生殖培育草坪草新品种,缩短其种子国产化进程提供参考。

植物病原微生物严重威胁农作物的产量和品质,建立高效准确的病原诊断技术是病害防控的重要措施。基于二代测序(next generation sequencing, NGS)平台的宏基因组测序技术是植物病害鉴定的重要工具。然而由于其检测成本高,实验周期长,设备笨重以及依赖生物信息学技术等缺点,制约了NGS在植物病原快速检测中的应用。牛津纳米孔技术公司(英国, 牛津)研发的纳米孔测序技术是一种新型的测序平台,与传统二代测序平台相比,具有成本低、实验周期短、使用方便等优势,适合于现场快速检测。本文介绍了纳米孔测序的技术原理,概述了近年来此技术在植物病原检测领域的应用与挑战,以期为该技术在植物病原检测中的进一步应用与改进提供参考。

转基因油菜(Brassica napus) NS-B50027-4是由澳大利亚-新西兰食品标准局批准的含有高比例的ω3脂肪酸和LC-ω3脂肪酸油菜新品种,到目前为止尚无文献报道对该转基因油菜新品种的检测方法,因此需要建立针对该品种的定性定量检测方法。本研究根据油菜内参基因HMG (high mobile group protein)和转基因油菜NS-B50027-4的A02染色体分别设计了引物和探针,利用普通PCR和实时荧光定量PCR技术分别测定引物和探针的特异性、灵敏度、准确性,从而确定该检测方法的检测限。实验结果表明,设计的两种引物都只能扩增出靶标,hmg引物的检测限能达到5 copies/μL,A02dn2引物的检测限达到1 copies/μL。因此,建立的转基因油菜NS-B50027-4的定性定量检测方法具有高度的特异性和选择性,优异的灵敏度和准确性。该研究结果为转基因油菜NS-B50027-4的定性定量检测提供了技术支持。

由尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f. sp. niveum, FON)引起的西瓜枯萎病(Fusarium wilt of watermelon)是西瓜(Citrullus lanatus)上的主要病害,在我国西瓜种植区均有发生,建立西瓜枯萎病菌的快速检测方法对该病的诊断和防控十分重要。FON是造成西瓜枯萎病的主要病原真菌。本研究以FON的特异DNA片段为靶标,设计了一套灵敏、特异的快速环介导等温技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)引物,并结合DNA快速提取方法,建立了西瓜枯萎病菌的LAMP检测体系。引物特异性实验结果显示,唯有FON-0、FON-1、FON-2的LAMP检测结果呈现黄绿色,且LAMP产物琼脂糖凝胶电泳结果呈现梯形条带,说明引物具有较高特异性。灵敏度检测结果表明,此LAMP体系对FON-1基因组DNA的检测下限为10 pg/μL,对植物带菌量的检测下限为5×10²孢子/g。盆栽实验结果表明,以根部组织为样品,此体系能对西瓜幼苗是否被FON侵染作出正确判断。该体系从DNA提取到获得检测结果仅需90 min左右,且病原菌菌丝和植物组织均可作为检测材料。反应结果肉眼可辨,具有操作简单、特异性强、灵敏度高、稳定性强、应用性广的特点。本检测体系可为田间西瓜枯萎病菌的快速诊断提供技术支撑。

奶牛乳腺炎(bovine mastitis)是奶牛(Bos taurus)养殖场危害最大的常见疾病,严重影响奶牛业的健康发展,细菌感染是导致奶牛乳腺炎发生的主要原因。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是引起牛乳腺炎的主要致病菌之一,针对金黄色葡萄球菌的快速检测方法对实现奶牛乳腺炎的早期预防具有重要意义。环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术是一种可以在等温条件下快速检测靶标DNA的新型核酸扩增方法。本研究根据金黄色葡萄球菌nuc基因(GenBank No. DQ507379.1)设计了6条LAMP特异性引物,通过优化反应体系成功建立了一种金黄色葡萄球菌LAMP检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度及临床检测效果进行了评价。结果表明,所建立的金黄色葡萄球菌LAMP检测方法特异性良好、最低检测限为2.7×10¹ copies/μL,其灵敏度是普通PCR方法的100倍。该方法操作简单、反应快速、特异性强且灵敏度高,可用于奶牛养殖场金黄色葡萄球菌的快速检测,也可为其他病原菌感染引发的奶牛乳腺炎早期诊断方法提供参考。