WRKY转录因子作为植物特有的一类转录因子,参与调控生长发育、次级代谢、衰老以及对生物和非生物胁迫的响应等过程。本研究首先利用反转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR)方法从甘蓝型油菜(Brassica napus)中克隆了WRKY72的cDNA序列(GenBank No.KC246585),其编码蛋白含有1个保守的WRKY结构域和1个C2H2型锌指结构。利用绿色荧光蛋白进行亚细胞定位观察,结果显示BnaWRKY72定位于细胞核。双荧光素酶报告系统检测发现,BnaWRKY72对W-box元件驱动的萤火虫荧光素酶报告基因具有转录激活活性。通过多种激素、生物和非生物逆境处理,利用qRT-PCR检测BnaWRKY72表达量变化,发现该基因能够响应冷害胁迫以及核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)侵染。利用酵母双杂交和双分子荧光互补技术,筛选并验证了BnaWRKY72的多个互作蛋白,包括同亚组的BnaWRKY31、BnaWRKY42及其自身;同时,BnaWRKY72与小分子类泛素修饰蛋白(small ubiquitin-like modifier, SUMO) 3发生互作,提示SUMO化修饰可能参与其活性调节。本研究首次探讨了BnaWRKY72分子特性,为深入研究其抗逆功能及相关分子机制提供了参考依据。

鸡(Gallus gallus)卵泡膜和卵泡颗粒细胞与哺乳动物的功能不同,鸡卵泡发育过程中最重要的是小黄卵泡(small yellow follicle, SYF)的发育。为研究鸡小黄卵泡环状RNA (circular RNA, circRNA)的表达水平,丰富鸡的卵泡发育理论,本研究以京海黄鸡小黄卵泡颗粒细胞(granulosa cells of SYF, SYFG)和膜细胞(theca cells of SYF, SYFT)为实验对象,去除总RNA中的线性RNA,然后通过Illumina Hi-Seq 4000测序平台进行测序,经生物信息学分析初步筛选出差异表达的circRNAs。然后利用基因本体(Gene Ontoloty, GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)对差异表达circRNAs的母源基因进行功能注释和富集分析。结果显示,SYFG和SYFT中共鉴定出9 904个circRNAs,其中4 199个circRNAs在两种细胞中均广泛表达,在膜细胞中表达数量更高;特征分析发现,circRNAs在染色体上广泛分布,染色体越长则分布越多,circRNA长度主要分布在100~400 nt之间,平均长度为296 nt;共有625个circRNAs在两种细胞中差异表达,其中在SYFG中上调表达271个,在SYFT中上调表达354个;在SYFG中上调表达的circRNAs参与细胞增殖、细胞识别、脂肪酸合成、脂类代谢等过程,经分析得到候选基因TOX高迁移率蛋白家族成员2 (TOX high mobility group box family member 2, TOX2)、胰岛素样生长因子受体1 (insulin like growth factor 1 receptor, IGF1R)和磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚单位β (phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit β, PIK3CB);在SYFT中上调表达的circRNAs集中于核苷酸结合、粘着吸附、促性腺激素释放激素(gonadotropin releasing hormone, GnRH)等信号通路,经分析得到候选基因单胺氧化酶A(monoamine oxidase A, MAOA)、成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor 2, FGFR2)和丝裂原活化蛋白激酶1 (mitogen-activated protein kinase 1, MAPK1)。综上所述,本研究筛选出的circRNAs可能主要通过与线性转录本竞争或作为竞争性内源RNA (competing endogenous RNA, ceRNA)来发挥功能,本研究结果从circRNA角度丰富了鸡卵泡发育的基础遗传理论。

胰岛素样生长因子1 (insulin-like growth factor-1, IGF-1)是重要的内分泌激素,不仅调控细胞生长和分化,还参与免疫系统调节。为研究鱼类IGF-1在机体抗菌免疫中发挥的作用,探寻IGF-1对鱼类单核巨噬细胞的调控机制,本研究从香鱼(Plecoglossus altivelis)转录组数据中获得PaIGF-1的cDNA序列(GenBank No.MK005188)。序列全长929 bp,包含1个ORF,编码171个氨基酸,预测分子量为18.86 kD。PaIGF-1氨基酸序列相对保守,与大西洋鲑(Salmo salar) IGF-1具有最高的同源性(77%)。qRT-PCR分析显示,PaIGF-1主要在香鱼肝脏、体肾、头肾和肠道中表达;感染鳗弧菌(Vibrio anguillarum)后,脾脏中PaIGF-1表达在感染8 h显著上调,头肾中PaIGF-1表达在感染24 h显著上调,而在鳃和肝中的表达没有改变。利用原核表达系统诱导表达并纯化PaIGF-1重组蛋白(recombinant PaIGF-1, rPaIGF-1),以rPaIGF-1孵育单核巨噬细胞,发现rPaIGF-1可显著增强单核巨噬细胞的吞噬能力,但其杀菌作用不受影响;qRT-PCR分析显示,rPaIGF-1可显著上调单核巨噬细胞中抑炎因子白介素(interleukin, IL)-10和转化生长因子β (transforming growth factor β, TGF-β)的表达,下调促炎因子IL-1β和肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor α, TNF-α)的表达;最后,利用rPaIGF-1分别孵育单核巨噬细胞PaCXCR (C-X-C chemokine receptor) 3.1⁺和PaCXCR3.2⁺,发现rPaIGF-1促进PaCXCR3.2⁺中PaSTAT3的磷酸化,而对PaCXCR3.1⁺中PaSTAT1和PaSTAT3的磷酸化水平没有影响。以特异性siRNA抑制PaSTAT3表达,可显著下调rPaIGF-1处理的PaCXCR3.2⁺中IL-10和TGF-β的表达,表明rPaIGF-1可能通过激活PaSTAT3而抑制单核巨噬细胞的炎症水平。本研究为深入探讨香鱼IGF-1在宿主抗菌免疫中发挥作用的机制提供了基础资料。

在罗非鱼养殖过程中,无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)感染会导致罗非鱼行为异常,并严重危害罗非鱼产业的健康发展。为了研究无乳链球菌感染后吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)行为变化的生理机制,本研究采用qRT-PCR和免疫荧光的方法,以人工腹腔注射感染无乳链球菌的吉富罗非鱼为研究对象,检测感染前后吉富罗非鱼脑组织和肠道组织中无乳链球菌含量、行为变化以及5-羟色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)在其小脑、肠道和胃中的表达情况。结果表明,吉富罗非鱼脑组织和肠道组织中无乳链球菌的含量分别从人工感染后的第6和第0小时开始急剧增加,均在第18小时达到高峰,其中脑组织峰值61.2 copies/mg,肠道组织峰值1 800.5 copies/mg;实验鱼在人工感染后的第12小时出现无定向乱窜、持续旋转游动的异常行为,并且这种异常行为一直持续到实验结束或实验鱼死亡;在人工感染前和感染后的实验鱼小脑、肠道和胃中均发现5-HT阳性反应,但是小脑和肠道中5-HT的阳性反应随着病原感染时间延长呈现变弱的趋势,在实验第18小时时荧光强度分别为9.1和6.9,而胃组织中5-HT阳性反应随着病原感染时间延长呈现先升高后降低的趋势,在实验末期到达最低值3.1。因此可以推测,无乳链球菌感染罗非鱼后,通过调控脑中枢神经系统和外周消化道系统中的5-HT使罗非鱼产生无定向乱窜和持续旋转的异常行为。本研究从5-HT的角度解释无乳链球菌感染后罗非鱼的异常行为,可为研究感染病原后鱼类冲动行为的机制提供新的研究思路。

玉米(Zea mays)生产上利用的是杂交种,利用不同遗传背景的测交群体来定位杂种当代控制品质性状的遗传位点,是对前人定位研究的有益补充。本实验以100份遗传背景丰富的玉米骨干自交系作为母本,分别以Mo17、E28、昌7-2、郑58作为测验种,按照NCⅡ设计,组配400份杂交组合,构建4个F₁群体,每个F₁群体各100份杂交组合。对4个测交群体的籽粒品质相关性状进行统计分析和全基因组关联分析(genome-wide association study, GWAS)。研究结果表明,蛋白质含量在E28和昌7-2测交群体显著高于其他群体(P<0.05);油分含量在E28测交群体显著高于其他群体(P<0.05);赖氨酸含量在Mo17测交群体显著高于其他群体(P<0.05)。Mo17测交群体在蛋白质含量、油分含量、赖氨酸含量中分别定位到2、5、17个显著关联的SNP位点,E28测交群体在蛋白质含量、油分含量、赖氨酸含量中分别定位到11、7、54个SNP位点,昌7-2测交群体在蛋白质含量、油分含量、赖氨酸含量中分别定位到8、8、6个SNP位点,郑58测交群体在蛋白质含量、油分含量、赖氨酸含量中分别定位到38、79、11个SNP位点。4个测交群体的定位结果差异很大,对4个测交群体的同一性状SNP位点进行比较,仅得到7个共位点。分别在蛋白质含量、油分含量、赖氨酸含量中定位到2、4、1个共位点,共挖掘到6个候选基因。本研究结果为玉米品质相关性状的传统连锁分析和关联分析提供了有益补充,为进一步玉米籽粒品质改良提供了参考。

植物热激转录因子(heat shock transcription factor, Hsf)在植物体响应热胁迫和其他逆境胁迫信号转导通路中发挥重要的调节作用,数量因作物不同差异较大。小麦(Triticum aestivum) Hsf家族成员数量多,包括多个亚家族,生物学特性和功能复杂多样。本研究从小麦中同源克隆了A2亚族成员TaHsfA2f(GenBank No.MK045331)的完整开放阅读框序列,序列长1 062 bp,编码353个氨基酸,蛋白质序列含DNA结合结构域(DNA-binding domain, DBD)、核定位信号序列(nuclear localization signal, NLS)(MRKELEDAMSNKRRRR)、核输出信号序列(nuclear export signal, NES)(LKRDKGLLM)和激活域(aromatic, large hydrophobic and acidic amino residues, AHA)(DDFWEDLLHE)。通过转化烟草(Nicotiana tabacum)表皮细胞发现,正常条件下TaHsfA2f蛋白质定位在细胞核。同源分析表明,TaHsfA2f与多种作物的HsfA2e蛋白相似性较高。组织特异性表达分析表明,TaHsfA2f在小麦中组成型表达。显著性分析表明,成熟根中高表达,幼茎和幼叶中较低表达(P<0.05)。叶片中TaHsfA2f的表达分别受热胁迫、水杨酸和过氧化氢处理上调(P<0.05),于处理60 min和120 min时达峰值。TaHsfA2f可不同程度提高转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)植株的基础耐热性和获得耐热性,在热胁迫条件下上调一系列热相关蛋白基因的表达。本研究为进一步解析小麦A2亚族基因特性与调控功能提供理论依据。

随着我国杨树(Populus spp.)的广泛种植,杨树的虫害问题也随之而来。如今,化学杀虫剂的应用不但不能有效地降低害虫对杨树的危害,同时还严重地破坏了生态环境。因此,通过转基因杨树与非转基因杨树嫁接繁殖的方式来提高杨树自身抗虫能力具有现实可行性。为了解嫁接转基因杨树生态安全性,本研究以杂种毛白杨和转Bt-Cry1Ac基因欧美杨107杨(Populus×euramericana cv.'Neva')抗虫株系Hb1互为接穗和砧木进行嫁接,对Cry1Ac基因的mRNA和蛋白是否在接穗和砧木之间运输以及嫁接苗叶片对美国白蛾(Hyphantria cunea)的抗虫性进行了探究。逆转录PCR (reverse transcription-PCR, RT-PCR)检测和第3代数字PCR结果表明：以杂种毛白杨为接穗或砧木的嫩枝和嫩叶中均没有检测到Cry1Ac基因的mRNA,且Cry1Ac基因的拷贝数远远低于阳性对照,表明外源Cry1Ac基因的mRNA不能在砧木与接穗间进行运输。通过酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA),在两个嫁接组合接穗和砧木的叶片、韧皮部以及木质部中均检测到了Cry1Ac蛋白的存在,证明Cry1Ac蛋白可以通过嫁接的方式在砧木和接穗间进行运输。用各嫁接处理的接穗叶片饲养美国白蛾幼虫,发现嫁接在转基因杨树上的非转基因杨树可以抑制美国白蛾幼虫的生长发育,使其发育进度明显减慢,表现出一定程度的抗虫性。本研究明确了Cry1Ac基因表达产物在转基因和非转基因组织之间的表达情况、传递规律以及抗虫性,为嫁接转基因杨树在抗虫实践中的合理利用提供理论依据和科学指导。

柳叶蜡梅(Chimonanthus salicifolius)是蜡梅科蜡梅属植物,在气味上主要表现为叶揉碎后极芳香,其花香气清淡。为阐明柳叶蜡梅不同部位香气差异的关键调控基因及分子调控途径,本研究选取同时期叶和花作为生物学材料开展转录组测序、拼接序列的功能注释与分类,并使用qRT-PCR技术分析香气合成相关基因的表达。利用转录组测序和生物信息学分析,从柳叶蜡梅叶和花中共获得153 059个Unigene,注释到非冗余蛋白库(Non-Redundant Protein Sequence Database, NR)、Swiss-Prot蛋白质序列数据库(Manually Annotated and Reviewed Protein Sequence Database, Swiss-Prot)、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)、蛋白质家族的集合数据库(Protein Family, Pfam)、真核生物蛋白质同源簇数据库(euKaryotic Ortholog Groups, KOG)和基因本体数据库(Gene Ontology, GO)中的Unigene分别有56 964、40 746、22 173、47 858、46 196和37 029个。通过差异表达分析发现在叶和花中共有5 517个具有差异的表达基因,其中2 104个基因上调,3 413个基因下调,分别获得314个GO注释和33个显著富集代谢通路,包括7个与香气合成相关的显著富集代谢通路,共涉及33个差异酶,其中有7个差异酶基因在叶中表达高于花,而其余26个酶基因表达量低于花,在转录组水平上筛选出柳叶蜡梅叶及花香气表观性状差异的基因及调控途径。通过qRT-PCR验证,发现丙二烯氧化物环化酶基因(allene oxide cyclase, AOC)、酪氨酸转氨酶基因(tyrosine aminotransferase, TAT)、香叶基香叶基还原酶基因(geranylgeranyl reductase, CHLP)、1-脱氧-木糖-5-磷酸合酶基因(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase, DXS)、萜品醇合成酶基因((-)-α-terpineol synthase, TES)、柠檬烯合成酶基因((R)-limonene synthase, LMS)及赤霉素3-β-双氧酶基因(gibberellin 3-beta-dioxygenase, GA3OX)在叶中表达水平高,对叶中香气成分的形成贡献度较大,可促进香气成分生物量的增加。本研究结果可为柳叶蜡梅分子生物学研究提供基因组数据库资源。

嗜乳脂蛋白(butyrophilin subfamily 1 member A1, BTN1A1)作为一种脂滴蛋白,与乳脂肪球的形成和分泌有关。为研究奶牛(Bos taurus) BTN1A1基因超表达对乳腺上皮细胞脂滴合成的影响,本研究PCR扩增了奶牛BTN1A1基因的CDS,构建Lenti-BTN1A1慢病毒重组载体,用包装好的病毒感染奶牛乳腺上皮细胞,通过嘌呤霉素筛选获得超表达BTN1A1的乳腺上皮细胞株,提取细胞DNA,对超表达细胞株进行基因型鉴定,采用qRT-PCR和Western blot分析细胞株中BTN1A1基因和蛋白的表达;用尼罗红对细胞脂滴进行荧光标记,分析BTN1A1超表达对细胞脂滴的影响,构建BTN1A1-pEGFP-N1载体,观察BTN1A1蛋白与脂滴的共定位。结果显示,克隆的BTN1A1基因CDS区序列大约1 580 bp,成功构建重组的BTN1A1慢病毒载体,用5 μg/mL嘌呤霉素筛选得到BTN1A1超表达细胞株,基因型鉴定表明细胞株基因组中成功插入BTN1A1基因;与对照组细胞相比,超表达细胞株的BTN1A1基因mRNA表达增加489倍(P<0.001),蛋白表达也明显增强;检测脂滴的荧光值发现,随着细胞培养时间的延长,BTN1A1超表达显著增加了细胞脂滴含量(P<0.01),共定位发现BTN1A1蛋白主要分布于细胞脂滴上。结果表明,超表达BTN1A1促进乳腺上皮细胞的脂滴合成。本研究为阐明奶牛乳腺上皮细胞的脂滴合成机制提供了基础数据。

胸椎数性状是生产中一类重要的经济性状，在绵羊(Ovis aries)上已确定的候选基因很少。本研究旨在研究脊椎发育相关基因(vertnin， VRTN)及核受体辅抑制子1基因(nuclear receptor subfamily 6 group A member 1, NR6A1)多态性与苏尼特羊胸椎数变异之间的联系及两个基因的组织表达水平。研究利用PCR研究了苏尼特羊VRTN和NR6A1基因的多态性及两个基因的SNP位点与多胸椎数性状的相关性，利用qRT-PCR技术检测了VRTN和NR6A1基因在不同胸椎数(胸椎数14根为T14组；胸椎数13根为T13组)苏尼特羊部分组织中的表达。结果表明，VRTN基因g.82533904C>T位点、NR6A1基因g.11206763T>C位点和g.11210075T>C位点与苏尼特羊胸椎数之间无显著关联(P＞0.05)，VRTN基因g.82533661C>A位点与苏尼特羊胸椎数之间存在极显著关联(P＜0.01)。NR6A1基因在不同胸椎数(T14组；T13组)苏尼特羊的心、肝、脾、肺、肾、肌肉和脂肪组织中均有表达，NR6A1基因在2种不同胸椎数苏尼特羊的心脏、肺脏、肾脏、肌肉和脂肪组织中的表达差异不显著(P＞0.05)，在脾脏组织中T13组与T14组之间表达差异处于显著水平(P＜0.05)，在肝脏组织中T13组与T14组之间表达差异处于极显著水平(P＜0.01)；VRTN基因在苏尼特羊的心、肝、脾、肺、肾、肌肉和脂肪组织中均有表达，在T14组中表达量高于T13组，T14组肌肉中表达量显著高于T13组(P＜0.05)，其他组织在不同胸椎数苏尼特羊之间的表达差异不显著(P＞0.05)。NR6A1基因在两种不同胸椎数苏尼特羊的组织中表达没有明显的规律，以上实验结果表明，绵羊VRTN基因g.82533661C>A位点对于选育多胸椎的苏尼特羊群体有一定指导意义，同时，NR6A1基因与苏尼特羊胸椎数性状之间没有明显关系，而VRTN基因可能是影响苏尼特羊胸椎数的重要基因之一。确定绵羊胸椎数候选基因有利于选育多胸椎数绵羊群体，能够有效提高肉羊产业的经济效益。

脂肪肥胖相关基因(fat mass and obesity associated gene, FTO)是通过全基因组扫描技术发现的肥胖易感基因。FTO通过转录因子及转运蛋白调节脂肪酸转运和脂肪代谢相关基因的表达,参与脂肪组织的发育、维持及沉积。黔北麻羊(Capra hircus)是贵州省三大地方品种之一,产肉性能良好,肉质鲜美。本研究以黔北麻羊为研究对象,探究FTO基因外显子多态性与脂代谢相关的血清生理生化指标的关联性。首先采用混合DNA池结合PCR直接测序技术筛选SNPs,然后单个样本直接测序确定突变位点的基因型,运用SPSS 17.0对FTO基因各突变位点不同基因型与血清瘦素、激素敏感脂肪酶(hormone-sensitive lipase, HSL)、脂联素、总胆固醇、甘油三脂、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase, AST)进行分析。结果显示,在受试群体中共发现9个SNPs,分别为：g.C10943T、g.G109518T、g.T125300A、g.C125357T、g.G125405T、gT125417C、g.T426229C、g.C426244G和g.G426347A,其中g.G109518T和g.G426347A位点突变分别位于第二和第九内含子区域。卡方分析显示,各突变位点都属于中度多态性(0.5<PIC<0.2)且均未偏离Hardy-Weinberg平衡状态。各突变位点均存在3种基因型,关联性分析得到g.T125300A和g.G426347A位点处AST和ALT含量在不同基因型之间差异极显著(P<0.01);g.G125405T和g.T125417C位点处血清AST及ALT含量差异显著(P<0.05);g.T426229C位点处AST差异显著(P<0.05),而ALT含量差异极显著(P<0.01)。血清HSL含量在g.T426229C和g.G426347A位点处不同基因型间差异显著(P<0.05)。由此推断FTO基因g.T125300A、g.G125405T、g.T125417C、g.T426229C和g.G426347A位点与黔北麻羊脂质代谢具有一定的相关性,为筛选山羊脂肪沉积及肉质调控的辅助选择标记提供了理论参考。

miRNAs (microRNAs)能够在多种生理和病理过程中发挥作用,通过相应的靶基因发挥其生物学功能,通过生物信息学预测和实验验证相结合的方法,可以快速、有效地筛选miRNA靶基因。本课题组前期通过高通量测序发现,ssc-miR-339-3p在仔猪(Sus scrofa)感染C型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens type C)对照组和攻毒组之间发生差异表达,推测其可能在感染过程中发挥了重要作用。本研究旨在对ssc-miR-339-3p的靶基因进行生物信息学预测和分析,并对ssc-miR-339-3p和预测所得部分靶基因进行验证,探索其影响和调控仔猪腹泻的可能作用机制。利用miRBase、Ensemble、NCBI、miRTarBase等数据库和PITA、RNAhybrid、miRanda、Promoter Scan、Alibaba2.1、DAVID、Cytoscape等生物信息学软件对ssc-miR-339-3p进行转录因子结合位点分析预测、不同物种间保守性分析、靶基因预测、基因本体论(Gene Ontology, GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)信号通路富集分析;运用qRT-PCR方法对ssc-miR-339-3p和部分靶基因mRNA表达量进行验证。结果表明,miR-339-3p在各物种间高度保守;ssc-miR-339-3p启动子区域有Sp1、AP-1、C/EBPα、NF-κB、SRF、USF等多个转录因子结合位点;获得的160个靶基因显著富集于正调控MAP激酶活性、正调控细胞凋亡、负调控RNA聚合酶Ⅱ启动子转录、细胞凋亡信号通路等多个生物学过程及NF-κB、PI3K-Akt、FoxO、Toll样受体等信号转导通路。qRT-PCR结果显示,ssc-miR-339-3p表达量在耐受组(resistance groups, IR)和易感组(sensitive groups, IS)显著低于对照组(control groups, IC)(P<0.05),此结果与高通量测序结果基本一致;靶基因NFKB1和CD40的表达量在IR和IS组极显著高于IC组(P<0.01);TRAF3和IRAK1的表达量在三组之间差异不显著(P>0.05)。由此推测,ssc-miR-339-3p受到Sp1、NF-κB、USF等多种转录因子的调控,其可能通过激活NF-κB、PI3K-Akt、FoxO、Toll样受体信号通路中的靶基因NFKB1、TRAF3、IRAK1、CD40等参与仔猪腹泻的调控。本研究预测和初步验证所得靶基因,可为今后miR-339-3p在仔猪抵抗C型产气荚膜梭菌感染过程中的功能和调控机制提供一定的实验基础和理论依据,对进一步筛选仔猪抵抗C型产气荚膜梭菌病有效的分子遗传标记提供科学依据。

马铃薯疮痂病(potato common scab)在内蒙古西部种植区发生严重,是马铃薯(Solanum tuberosum)生产的主要障碍。为明确内蒙古武川县马铃薯疮痂病病原菌种类和生物学特性,本研究采用稀释分离法对病原菌进行了分离,得到1株分离物PS1。以马铃薯片法和盆栽接种进行致病性测定,并利用特异性引物检测了分离物的致病基因,结果表明,该菌株能在马铃薯片上定殖并使薯片产生褐色坏死,使新生块茎产生典型的疮痂病症状,并检测到该菌株中含有毒素合成基因(thaxtomin A and B, txtAB)、致病性因子基因(tomatinase, tomA)和诱导坏死蛋白基因(necrosis-inducing protein, nec1)3个毒素致病基因。通过形态学特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析进行鉴定,该菌株为加利利链霉菌(Streptomyces galilaeus)。生物学特性研究结果显示,该菌株的生长最适培养基为燕麦液体培养基,培养10 d时,菌丝干重达到最大,最适pH为7,最适培养温度为32 ℃,最适单一碳源为葡萄糖,最适单一氮源为L-甲硫氨酸。本研究明确了武川地区马铃薯疮痂病病菌菌株PS1的种类和生物学特性,为进一步研究其流行规律及防治措施提供依据。

植物真菌病害是造成各国农业损失的主要原因之一，受该病害影响，全球粮食及其他农作物减产高达20%。前期工作中，本实验室筛选到1株对引起大豆根腐病的尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)有较强拮抗作用的枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis) 8-32，生防、促生效果显著。为解析枯草芽胞杆菌8-32的拮抗和促生机制，并进一步开发应用该菌种，本实验验证了该菌株对植物病原菌孢子萌发、芽管及菌丝生长的抑制作用；根据已报道基因，采用PCR方法扩增其拮抗基因，高效液相色谱-质谱(high performance liquid chromatography-mass spectrometry, HPLC-MS)法鉴定其产生的拮抗物质，并检测该菌株产生的促生物质。结果表明，菌株8-32可抑制多种病原菌孢子的萌发和芽管的伸长，最大抑制率分别为100%和95.40%，还可以导致病原菌菌丝断裂；PCR扩增得到与拮抗相关的基因4个，分别为枯草杆菌素A合成酶基因(subtilosin A gene, sboA)、枯草杆菌蛋白酶基因(subtilisin gene, qk)、丰原素合成酶基因(fengycin gene, FenB)和假定蛋白合成基因(hypothetical protein yndj gene, yndj)；HPLC-MS结果表明，菌株8-32主要通过伊枯草菌素(iturin)家族发挥抑菌效果，并且其具有较高的吲哚乙酸(indolo acetic acid, IAA)产生能力，发酵72 h后上清液中IAA含量为45.29 mg/L。本研究为进一步在分子水平上研究枯草芽胞杆菌的生物防治提供了科学基础，为菌株8-32的应用提供理论支持。

植物三萜酸等萜类化合物具有抗炎、抗氧化、抑制肿瘤细胞增殖等生物活性,在医药、化妆品、食品等等领域应用广泛,但萜类化合物的生物合成调控机制尚未明确。本文重点综述近年来植物萜类化合物生物合成相关转录因子和调控机制的研究进展,为进一步阐明萜类代谢的转录调控网络提供参考。

肝细胞核因子4α (hepatocyte nuclear factor 4α, HNF4α)是核受体超家族成员之一,广泛地调控葡萄糖、胆固醇及脂肪酸代谢途径中多种基因的表达。为了获得鸡(Gallus gallus) HNF4α特异性抗体,本研究首先根据大肠杆菌(Escherichia coli)的密码子偏好性,优化并合成鸡HNF4α基因,构建原核重组表达载体pET-30a(+)-HNF4α。其次,将该重组表达载体转化至E.coli BL21 (DE3)进行诱导表达,并对诱导温度和异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside, IPTG)浓度进行优化,表达产物利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl dulfate polyacrylamide gel electropheresis, SDS-PAGE)进行鉴定。最后,将HNF4α重组蛋白经Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱纯化后免疫新西兰大白兔(Oryctolagus cuniculus),制备抗鸡HNF4α的特异性抗体。利用间接酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测抗体效价,并用所得抗体进一步分析HNF4α在鸡各组织的表达情况。结果表明,经密码子优化后构建的原核重组表达载体pET-30a(+)-HNF4α可在E.coli BL21 (DE3)中高效表达,在37 ℃、0.5 mmol/L IPTG、诱导4 h的条件下,在上清液中有较多可溶性蛋白表达。利用SDS-PAGE检测发现,通过Ni-NTA琼脂糖凝胶纯化获得了大小约为51.6 kD的融合蛋白且纯度达90%以上;ELISA检测抗体效价可达1∶512 000。利用该抗体分析鸡各组织蛋白表达谱发现,HNF4α在肝脏和肾脏中高表达,在小肠、睾丸中少量表达,而在其他组织几乎不表达。综上所述,本研究成功制备了效价高、特异性强的鸡HNF4α抗体,为进一步研究鸡HNF4α基因功能提供了基础资料。

牛支原体(Mycoplasma bovis, Mb)是引起肉牛(Bos taurus)和奶牛疾病的重要病原之一,给养牛业造成了重大的经济损失。烯醇化酶(enolase, eno)为糖酵解途径的关键限速酶,主要催化2-磷酸甘油酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸。为研究Mb eno酶促活性及其动力学参数,本研究参照GenBank中Mb PG45株eno基因(NC_014760.1)序列设计特异性引物,应用PCR扩增获得Mb武威分离株的eno基因。在序列分析及基因优化的基础上,构建其原核表达载体pET-eno并转化大肠杆菌(Escherichia coli)表达菌Transetta (DE3),经异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)诱导表达,在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl dulfate polyacrylamide gel electropheresis, SDS-PAGE)分析的基础上,纯化表达产物对其酶促活性进行分析。结果表明,优化后的Mb武威株eno基因在大肠杆菌中成功获得表达,重组蛋白His-eno大小约为53 kD,且主要以可溶性蛋白形式存在;酶活分析结果显示：纯化产物His-eno的催化活性略高于兔肌肉烯醇化酶,且其最适温度为42 ℃,最适pH为8.0。双倒数作图所得His-eno米氏常数(K_m)和最大反应速率(V_max)分别为4.1×10^-3 mol/L和3.4 μmol/(L·min)。本研究结果为进一步研究Mb eno的生物学功能提供基础资料。

绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae, Mo)和丝状支原体山羊亚种(M.mycoides subsp.capri, Mmc)是引起羊支原体性肺炎(M.pneumonia of sheep and goats, MPSG)的主要病原。为了快速鉴别引起MPSG的主要病原,建立一种可以同时检测Mo和Mmc的双重TaqMan探针荧光定量PCR (Real-time fluorescence quantitative PCR, qRT-PCR)检测方法。根据Mo p113序列和Mmc MLC_1770 (hypothetical protein gene)序列,利用Beacon Designer 7.9结合NCBI Blast软件分析,分别设计出针对Mo和Mmc的特异性引物和探针。通过对引物浓度、探针浓度和退火温度等反应条件的优化,建立了双重TaqMan探针qRT-PCR方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行了验证。结果表明,建立的双重TaqMan探针qRT-PCR的标准曲线相关系数R²分别为0.998和0.999,扩增效率分别为94.8%和97.0%;该方法对其他羊常见病原均无扩增信号,证明该方法具有良好的特异性;该方法对Mo和Mmc的最低检测限均为100 copies/μL,敏感性是常规PCR的100倍;组内和组间变异系数都低于2%,说明重复性好。应用该方法对福建省内收集的187例临床样品进行检测,结果显示,Mo的阳性率为47.6% (89/187),Mmc的阳性率为11.8% (22/187),两种病原体混合感染阳性率为10.2% (19/187)。以上数据结果表明,本研究建立的方法可用于临床上Mo和Mmc的准确、快速检测。本研究为Mo和Mmc的快速检测及流行病学提供了技术支撑。