黑素皮质素受体4(melanoeortin receptor-4, MC4R)基因属于G蛋白偶联受体超家族成员，参与哺乳动物的饮食行为控制及能量平衡。为了探讨MC4R基因的多态性与藏羊(Ovis aries)生长性状的关系，寻找与藏羊生长性状相关的分子标记，本研究利用DNA测序方法检测藏羊MC4R基因的多态位点并对其进行基因分型，同时分析了单个多态位点不同基因型及双倍型与藏羊生长性状的关联性。结果发现，在MC4R基因上检测到4个多态位点，包括位于第1内含子的g.1803G＞A，位于第2外显子的g.1261T＞C，以及位于3'侧翼区的g.1803G＞A和g.1918C＞T。关联性分析表明，在本研究所选取的555头藏羊样本中，g.880G＞A位点上AA基因型的体重、体高、体长和胸围极显著或显著高于GG基因型(P＜0.01或P＜0.05)；g.1261T＞C位点上TC基因型的体重与TT基因型存在显著性差异(P＜0.05)；g.1803G＞A位点的不同基因型能够显著影响体重(P＜0.01)，优良基因型为GG。通过合并基因型发现，双倍型H13H7 (GTGC-ATAC)的各个生长性状表现最优(P＜0.05)。以上结果表明，MC4R基因单核苷酸多态性及合并基因型对藏羊生长性状有一定的影响，可以作为藏羊生长性状分子标记辅助选择的候选基因，为藏羊的选育改良提供理论依据。

miRNA是真核生物体内一类非编码的小RNA，在动植物发育过程中发挥重要作用，但迄今为止，其在水稻耐高温方面的分子机理研究很少。为进行水稻(Oryza sativa)高温胁迫下miRNA的功能研究，前期通过小RNA测序发现，miR396家族是响应水稻高温胁迫最显著的家族。为了进一步研究miR396家族响应高温胁迫的分子机制，本研究对水稻日本晴(Oryza sativa spp. japonica cv. Nipponbare)苗期叶片进行不同时间48 ℃高温处理，通过qRT-PCR法分析8个miR396家族成员以及12个预测的靶基因生长调节因子(growth regulating factor, GRF)家族的表达情况。结果显示，miR396家族8个成员及12个预测靶基因对高温胁迫应答不同。miR396a、miR396e和miR396f在每个时间的高温胁迫呈上升表达，而miR396b，miR396c，miR396d,miR396g,miR396h在1.5、3、6 h呈下降表达，在12、24 h呈不同程度上升表达；miR396a、miR396e和miR396f在高温胁迫下上升表达10倍以上，其中miR396f上升100倍以上。OsGRF家族随高温胁迫呈不规律的上升或下降表达，其中OsGRF2随着胁迫时间增加持续下降表达至8~10倍。并且OsGRF2与miR396a、miR396e和miR396f的表达呈高的负相关，表明OsGRF2为miR396a、miR396e和miR396f的靶基因。研究结果表明miR396在水稻耐高温方面有关键作用。

体细胞不亲和性(somatic incompatibility, SI)是担子菌中同种遗传型不同的个体间菌丝接触时进行同种异体识别，防止融合和重组即同种异体相斥的机制，由SI位点控制。体细胞不亲和性基因在单核体中是否表达尚不清楚。本研究利用来自糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)天达300担孢子的2个单核菌株MK13和MK3，通过杂交得到双核菌株DK13×3。采用转录组测序(RNA-Seq)技术得到了这3个菌株的转录组。从这3个菌株的转录组中，共比对得到参与SI的unigene 76个，分别属于异核体不亲和性基因(heterokaryon incompatibility gene, het) het-e、het-6和耐受基因(tolerant, tol)、编码核苷-三磷酸酶域(nucleoside-triphosphatase domain, NACHT)/配体结合域40(ligand-binding domain, WD40；约由40个氨基酸组成)的基因同系物。这些unigene中，在3个菌株中均表达的占61.8%，仅在MK13和DK13×3中表达的占23.7%，仅在MK3和DK13×3中表达的占11.8%，仅在DK13×3中表达的占1.3%，仅在MK13和MK3中表达的占1.3%。从这些unigene中选出4个，经定量反转录PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)分析其表达量，结果与转录组测序一致。研究结果表明，几乎所有参与SI的unigene在双核菌株中表达，70%以上在单核菌株中表达，这些基因可能在担子菌单-单杂交和单-双杂交中参与自我/非我识别。本研究为体细胞不亲和性基因影响担子菌杂交成功率及杂交后代的可育性提供了理论依据。

Pi2是一个对稻瘟病生理小种具有广谱抗性的基因，对于水稻(Oryza sativa)的稻瘟病抗性育种具有非常重要的应用价值，但目前针对该基因的分子标记辅助选择(marker-assisted selection, MAS)育种所开发的分子标记操作繁杂，难以实现批量以及准确检测，严重阻碍了该基因在水稻MAS育种过程中的大量应用。本研究通过对Pi2基因及其复等位基因进行序列比对，找出其特异性变异，开发成基于高分辨率熔解曲线分析(high resolution melting analysis, HRM)技术检测的与Pi2基因完全共分离的分子标记。通过对23份两系不育系和三系保持系材料进行 Pi2基因鉴定，发现它们都不含有该基因。对4个Pi2基因改良的后代分离群体进行分子标记跟踪检测，发现该标记能够很好地区分供体亲本华占与其他受体亲本以及华占与各受体在Pi2基因处的杂合基因型。与已经报道的Pi2特异性分子标记相比，本研究所开发的分子标记的检测效果更好，操作更加简便。因此，本研究中的Pi2基因特异性分子标记结合HRM的检测方法能够高效准确地进行Pi2基因的资源鉴定和对抗病性改良后代群体的高通量检测筛选，为今后的水稻高效、准确、大规模分子育种提供技术支持。

在饥饿状态下，机体脂肪内参与能量代谢的许多基因会发生改变来适应环境的变化，从而维持人(Homo sapiens)和动物在没有食物摄入时的生存需要。为了探究miR-378在短期饥饿(24 h)状态下脂肪代谢中发挥的作用，本研究采用野生型和miR-378基因敲除型小鼠(Mus musculus)为材料，分别对小鼠进行正常饲喂及高脂诱导，采集两月龄及高脂诱导两个月的小鼠棕色脂肪、腹股沟脂肪、性腺脂肪、肾周脂肪及皮下脂肪组织，利用qRT-PCR检测脂肪合成和分解相关基因mRNA的表达量，来探讨饥饿状态下miR-378基因敲除对脂肪分解的影响。实验表明在饥饿状态下脂肪合成基因Pparγ表达量降低，而脂肪分解基因激素敏感脂肪酶(hormone sensitive lipase, HSL)、长链脂酰辅酶A合成酶1(acyl-Col synthetase long-chain family member 1, Acsl1)和长链脂酰辅酶A脱氢酶(acyl-Coenzyme A dehydrogenase, long-chain, Acadl)表达量升高，同时miR-378在脂肪中的表达量有所升高。miR-378敲除组与野生组相比在饥饿时脂肪分解标志基因下调。研究结果表明，miR-378可促进禁食状态下脂肪组织的分解，敲除miR-378后抑制禁食状态下脂肪组织的分解。本研究确定了miR-378可作为重要的调节因子影响小鼠脂肪的分解，为人及其他动物脂肪分解的研究提供了重要的理论依据。

小麦(Triticum aestivum)胞质甘油醛3-磷酸脱氢酶(cytosolic glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPC) TaGAPC5基因在干旱等非生物胁迫下显著表达。序列分析表明，TaGAPC5基因启动子区包含3个W-box顺式作用元件。本实验利用PCR定点突变技术对TaGAPC5基因启动子区-640处W-box单独突变、-640、-700两处W-box突变和-640、-700、-997处W-box均突变，将这3种突变的启动子分别与植物表达载体pC0390-GUS融合表达，利用农杆菌(Agrobaoterium tumefaciens)介导法转化烟草(Nicotiana tabacum)，对转化后的烟草分别进行正常条件下培养和100 nmol/L脱落酸(abscisic acid, ABA)、20% PEG8000胁迫处理。组织化学染色结果显示，这3种突变后的启动子序列均具有一定的启动子活性。烟草叶片GUS酶活检测结果表明，在正常生长条件下，TaGAPC5基因启动子-640处W-box单独突变对启动子活性影响不大，-640、-700、-997三处W-box均突变TaGAPC5基因启动子活性显著降低(P＜0.01)；在100 nmol/L ABA诱导下，-640处W-box单独突变、-640、-700两处W-box突变和-640、-700、-997处W-box均突变均可显著降低TaGAPC5基因启动子活性(P＜0.01)；在PEG胁迫条件下，TaGAPC5基因启动子-640处W-box单独突变和-640、-700、-997三处W-box均突变可显著降低该基因启动子活性(P＜0.01)。因此表明-640、-700、-997处W-box对小麦TaGAPC5基因启动子活性有一定影响，其中在100 nmol/L ABA、20% PEG8000胁迫条件下其影响较大，推测TaGAPC5基因启动子序列中W-box元件可能参与非生物胁迫下小麦TaGAPC5基因的表达调控。这一研究结果可为小麦TaGAPC5基因在非生物胁迫下的表达调控研究提供重要线索。

干旱是影响我国苹果(Malus×domestica)生产的主要逆境因素之一，砧木的抗旱能力直接影响着树体的生长发育、产量及果实品质的形成。本研究以平邑甜茶(Malus hupehensis var. pingyiensis)基砧分别嫁接7种苹果矮化砧木(GX, CG24, M26, M9-T337, SH1, SH6和SH40)盆栽苗为试材，持续干旱胁迫处理40 d，通过测定植株生长、叶片蒸腾速率、净光合速率等相关指标，利用平均隶属函数法综合分析了各矮化砧木的抗旱性。结果显示，7种苹果矮化砧木抗旱性依次为：SH6＞SH40＞M9-T337＞SH1＞M26＞CG24＞GX。进一步对比分析强抗旱砧木SH6与不抗旱砧木GX显示，SH6中4种抗氧化酶(氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD), 抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX), 过氧化氢酶(catalase, CAT)和脱氢抗坏血酸还原酶(dehydroascorbate reductase, DHAR))活性及其合成关键基因表达水平均高于GX，表明抗氧化能力是砧木抗旱性形成的重要构成。该研究结果为苹果抗旱矮化砧木应用与抗性分子育种提供了理论参考。

转录组测序(transcriptome sequencing)是一种获得基因表达信息的快速、高效方法。为挖掘与光皮桦(Betula luminifera)材质性状相关的基因，本研究以光皮桦茎、叶等组织为材料开展转录组测序、拼接序列的功能注释与分类；采用cDNA末端快速扩增技术(rapid-amplification of cDNA ends, RACE)分离S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosylmethionine synthase, SAMS)基因全长cDNA，再利用DNAStar、MAGA 7.0等生物信息学软件进行序列分析，使用qRT-PCR技术分析SAMS基因的表达模式。结果表明，转录组测序共获得有效数据1.9 Gbp，拼接得到Unigenes序列54 577个。分别比对冗余蛋白质数据库(non-redundant protein database, NR)和Swiss-Prot蛋白质序列数据库(Swiss-Prot protein sequence database)，共有65.8%(35 920)的Unigenes得到注释信息，包含了24 482个不同序列号的蛋白质。另外，7 954和9 997个Unigenes分别获得了基因本体(Gene Ontology, GO)和直系同源基因簇(Clusters of Orthologous Groups, COG)分类信息。在转录组测序基础上克隆到BlSAMS1、BlSAMS2和BlSAMS3的全长cDNA，其长度分别为1 578 bp、1 555 bp和1 266 bp；相应编码蛋白的分子量分别为42.9、43.1和42.7 kD，且皆具典型的SAMS保守结构域。进化树构建显示，BlSAMS1和长春花(Catharanthus roseus)CrSAMS2聚在一起；BlSAMS2和小金海棠(Malus xiaojinensis)MxSAMS、葡萄(Vitis vinifera)VvSAMS4聚为一类；BlSAMS3与木质素合成相关的拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtSAMS3、海岸松(Pinus pinaster)PpSAMS1等序列相似，聚在同一分支。BlSAMS1在叶中的整体表达量较高；BlSAMS2和BlSAMS3在茎中的表达量随着木质化程度的增加而升高，且在木质部优势表达。因此，推测BlSAMS3通过参与光皮桦木质素的合成在木材形成中发挥作用。光皮桦的转录组信息和BlSAMSs序列及表达分析为进一步研究木材形成的分子机制提供了基础资料。

类无精症缺失基因(deleted in azoospermia-like gene, Dazl)在雄性动物生殖细胞分化过程中起重要调控作用，但对于不同物种或处于不同发育阶段的同一物种而言，其调控机制存在差异。为了探讨Dazl在绵羊(Ovis aries)不同发育期睾丸组织中的表达、定位及调控作用，本实验选取0、2、5、12和24月龄健康的绵羊15只，每组3只，采取睾丸、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和肌肉组织。运用实时荧光定量PCR(quantitative Real time PCR, qRT-PCR)检测了0、2、5、12和24月龄绵羊睾丸组织及12月龄绵羊的不同体组织(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和肌肉)中Dazl mRNA的表达量，利用Western blot技术对Dazl基因编码蛋白的表达量进行检测，并采用免疫组织化学染色方法检测Dazl蛋白的阳性信号在不同月龄睾丸组织中的分布情况。结果显示，对于不同月龄睾丸组织，从mRNA和蛋白水平均检测到了Dazl基因的表达，并且二者的趋势基本相似。在0、2和5月龄睾丸中Dazl mRNA及蛋白表达量较低，12月龄中表达量较高且极显著高于0、2和5月龄(P＜0.01)，而在24月龄中Dazl mRNA及蛋白的表达量均出现不同程度的下调现象。12月龄绵羊各组织的qRT-PCR检测结果显示，Dazl mRNA只在睾丸组织中高表达，在心脏中表达量很低，而在其他组织中不表达。免疫组织化学染色结果显示，Dazl蛋白在初情期前(0、2和5月龄)定位于睾丸间质细胞，而在12和24月龄定位于睾丸间质细胞、初级精母细胞、次级精母细胞和精子细胞。研究结果表明，Dazl基因在性成熟前公羊的睾丸间质细胞及成年羊的睾丸间质细胞、精母细胞和精细胞中表达，并且在他们的增殖过程中起调控作用。由此推测，在绵羊睾丸发育过程中，Dazl基因可能通过直接作用(调控精母细胞的成熟分裂)和间接作用(调控睾丸间质细胞的增殖)共同调控精子发生。本研究为进一步研究Dazl基因在雄性动物精子发生过程中的调控机制提供了科学依据和参考。

紧密连接蛋白3(claudin3, CLDN3)可调节小分子穿过睾丸支持细胞(sertoli cell, SC)紧密连接(tight junction, TJ)的运动，为细线前期和细线期精母细胞创造物理屏障。为探索CLDN3基因对牦牛(Bos grunniens)SC的生物学作用，本研究采用反转录聚合酶联反应(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)方法克隆牦牛CLDN3基因，对其进行生物信息学分析，并将不同浓度(0, 10, 25, 50, 75和100 ng/mL)的促卵泡激素(follicle-stimulating hormone, FSH)作用于牦牛SC，运用实时荧光定量PCR(quantitative real time polymerase chain reaction, qRT-PCR)和免疫蛋白印记(western bloting, WB)方法，检测FSH对牦牛SC中CLDN3表达的影响，并采用免疫荧光染色对CLDN3蛋白表达定位检测。结果表明,本研究成功克隆得到1 074 bp含有开放阅读框的牦牛CLDN3 cDNA序列(GenBank No. YK 411920)，其中编码区660 bp，编码219氨基酸，经同源性分析发现牦牛与其他物种同源性较高(≥90%)；FSH浓度为25 ng/mL的处理组与其他组相比其CLDN3 mRNA表达和CLDN3蛋白表达水平最高，且差异极显著(P＜0.01)；免疫荧光结果显示SC细胞质、细胞核及细胞膜均有CLDN3表达。综上所述，牦牛CLDN3氨基酸序列在种属间具有保守性，FSH可能为牦牛睾丸形成TJ的重要激素，并以浓度依赖的方式诱导牦牛SC中CLDN3表达，最佳浓度为25 ng/mL。本研究为揭示牦牛精子迁移过程中CLDN3的生物学作用提供科学依据。

咽扁桃体(pharyngeal tonsil, PhaT)属于粘膜相关淋巴组织，在呼吸道的粘膜免疫中起重要作用，免疫球蛋白A(immunoglobulin A, IgA)和免疫球蛋白G(immunoglobulin G, IgG)是粘膜免疫的两个重要效应分子，具有广泛的免疫学功能。为了研究牦牛(Bos grunniens)咽扁桃体发育过程中组织学结构的变化，以及IgA与IgG抗体分泌细胞(antibody secreting cells, ASCs)在其内部的分布特征和变化规律，本研究采用组织学方法对新生与成年牦牛咽扁桃体的组织学结构进行观察比较；免疫组织化学法(immunohistochemistry, IHC)检测IgA和IgG在新生与成年牦牛咽扁桃体内的表达情况。组织学结果显示，牦牛咽扁桃体上皮由非网状上皮和网状上皮构成，实质由淋巴滤泡和弥散淋巴组织组成，弥散淋巴组织中分布有大量的高内皮静脉和淋巴管。新生牦牛咽扁桃体内仅观察到少数的初级淋巴滤泡，而成年牦牛咽扁桃内以次级淋巴滤泡为主，且成年组淋巴滤泡数量远高于新生组(P＜0.01)。免疫组织化学结果显示，两个年龄段IgA和IgG ASCs在非网状上皮下区域、网状上皮区域、滤泡间区、淋巴滤泡和腺体间均有分布，且均在非网状上皮下区域分布最高；单位面积内，两个年龄段IgG ASCs的平均数目均高于IgA ASCs，且成年组两者之间差异极显著(P＜0.01)，而新生组两者差异不显著(P＞0.05)。结果表明，牦牛咽扁桃体在新生阶段已形成初级淋巴滤泡；IgA和IgGASCs主要通过非网状上皮下区域到达粘膜外表面发挥免疫保护作用；两年龄段IgG ASCs在数量上均占优势，说明IgG可能在牦牛咽扁桃体免疫防御作用中处于主导地位。本研究为牛呼吸道粘膜免疫及相关疫病的发病机理提供了形态学和免疫学资料。

CCAAT/增强子结合蛋白α基因(CCAAT/enhancer binding protein alpha gene, CEBPA)在脂肪生成、生长发育过程中发挥重要作用，同源异型基因Six1(sine oculis homeobox homolog 1 gene)在骨骼肌的发育和肌纤维类型的转化中起调控作用，且两者均与骨骼的发育密切相关。本研究以CEBPA和Six1基因为候选基因，采用直接测序法检测2个基因外显子的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)，并分析其对无量山乌骨鸡(Gallus gallus)屠体和体尺性状的影响。研究结果表明，在CEBPA基因外显子上共检测到74 C＞G、552 G＞A、936 C＞T 3个突变位点，在Six1基因外显子上共检测到375 G＞A和564 G＞A 2个突变位点，其中只有CEBPA基因74 C＞G位点的突变引起了氨基酸的变化，且为中性突变。连锁不平衡(linkage disequilibrium, LD)分析发现，CEBPA基因的各突变位点间、Six1基因的各突变位点间均不存在强连锁不平衡。在无量山乌骨鸡群体中，CEBPA基因的3个SNPs位点形成了5种单倍型和7种双倍型，Six1基因的2个SNPs位点形成了4种单倍型和5种双倍型。关联分析表明，CEBPA基因的74 C＞G突变位点对半净膛率、全净膛率、体斜长、胸宽、胸深和龙骨长有显著或极显著影响(P＜0.05或P＜0.01)，936 C＞T突变位点对活重、屠体重、半净膛重、全净膛重、胸肌重、体斜长、骨盆宽和胫长有显著或极显著影响(P＜0.05或P＜0.01)。双倍型H1H1、H4H4的半净膛率、全净膛率，H1H2的胸肌重、骨盆宽、胫长，H1H4和H4H4的体斜长，H4H4的胸宽、胸深、龙骨长分别显著高于其他部分双倍型(P＜0.05或P＜0.01)；Six1基因的375 G＞A和564 G＞A突变位点对部分屠体和体尺性状有显著性影响(P＜0.05或P＜0.01)，双倍型H6H6、H6H7、H6H8的胸肌重、胸肌率，H6H7的屠宰率，H6H8的全净膛重、胸深、骨盆宽，H7H7的胸角、胫长、胫围，分别显著高于其他部分双倍型(P＜0.05或P＜0.01)。本研究结果表明，CEBPA基因和Six1基因的多态性对无量山乌骨鸡的屠体和体尺性状有显著影响，可作为无量山乌骨鸡及其他鸡种屠体和体尺性状分子标记辅助性选择的候选基因。

肝细胞核因子1α (hepatocyte nuclear factor 1α, HNF1α)调控众多的肝脏特异性基因，参与机体的脂类、糖类和蛋白质的代谢过程。以PCR技术从本研究室已构建的真核表达载体pcDNA3.1-HNF1α质粒上扩增获得鸡(Gallus gallus) HNF1α的编码序列，在其5′、3′端分别引入的NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点，以此位点将其克隆入pET30a表达载体，并构建获得重组表达菌BL21-pET30a-HNF1α。然后以不同浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (isopropyl-β-D-thiogalactoside, IPTG) (0.1~0.8 mmol/L)优化重组蛋白的诱导表达，并采用15 ℃的低温诱导重组蛋白的可溶性表达。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)和Western blot分析结果显示，与未诱导组相比，重组表达菌在37 ℃下，经不同浓度的IPTG 诱导4 h后均能产生一条约69 kD的蛋白条带，与预计目的蛋白HNF1α的大小相一致，且IPTG浓度在0.1 mmol/L时诱导重组蛋白的量高于其他浓度组，而低温诱导未能使重组蛋白可溶性表达。于是采用8 mol/L尿素变性包涵体，溶解重组蛋白，通过融合在HNF1α重组蛋白C端的6-His多肽，以Ni2+对重组蛋白进行亲和层析纯化，结合固—液两相法对目的蛋白进行原位复性。结果显示通过 Ni2+亲和层析和目的蛋白原位复性相结合的一步纯化法，成功地从包涵体中获得了纯度高达95%以上的重组蛋白HNF1α，这为研究鸡HNF1α在糖脂代谢、机体生长及抗体的制备等方面提供了物质保障。

硬脂酰辅酶A去饱和酶1(Stearoy-CoA desaturase 1, SCD1)是肝细胞合成单不饱和脂肪酸的限速酶，对机体脂肪酸的组成具有重要调控作用。为了探究鸭(Anas platyrhynchos) SCD1基因对其脂肪沉积的遗传调控机制，本实验采用Ⅳ型胶原酶消化肝脏分离培养法分离21日鸭胚原代肝细胞并进行培养，构建携带HIS标签的pEGFP-N3-SCD1真核过表达载体，转染鸭胚原代肝细胞，利用HIS标签检测试剂盒测定SCD1基因在鸭胚原代肝细胞中的过表达量，探讨其过表达对鸭原代肝细胞脂质指标的效应。实验结果显示肝细胞初分离效果良好，细胞培养至96 h基本贴满培养板，pEGFP-N3-SCD1重组质粒在肝细胞中能稳定过表达并发出绿色荧光， SCD1基因的过表达与总胆固醇(total cholesterol, TC)及低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)含量呈极显著正相关(P＜0.01)，与高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)含量呈极显著负相关(P＜0.01)，与甘油三酯(triglyceride, TG)则不相关(P＞0.05)。结果表明：Ⅳ型胶原酶消化肝脏提取法能成功分离培养鸭原代肝细胞，pEGFP-N3-SCD1重组质粒转染效果良好，SCD1基因过表达对鸭原代肝细胞的脂质代谢具有调控作用，这对今后进一步研究SCD1对肉鸭脂肪沉积的遗传调控机制具有重要的指导意义。

可视化芯片技术是在传统芯片技术的基础上发展起来的一项新的疾病诊断和基因分析技术，对于临床疾病检测和诊断具有重要意义。本研究针对禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)的核蛋白(nucleprotein, NP)基因设计一对特异性引物，以H9亚型禽流感病毒分离株 cDNA为模板，经PCR扩增、连接、转化和核酸序列鉴定后，得到含有AIV-NP基因的重组质粒。同时复苏本实验室保存的3株分别含有新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)的融合(fusion, F)蛋白基因、鸡传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus, ILTV)胸苷激酶(haemaggluttinin-neuraminidase, TK)基因和鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus, IBV)核衣壳(nucleocapsid, N)蛋白基因的重组菌。以上述4种病原的靶基因核酸序列片段的正义链为模板，设计寡核苷酸探针，喷样到尼龙膜上制备成芯片，利用不对称PCR技术扩增生物素标记的靶基因，与芯片进行杂交后，检测结果直接用肉眼就可以判定。本研究对芯片制备流程和检测过程中主要条件进行优化。结果表明当寡核苷酸探针喷样浓度为25 μmol/L、芯片杂交反应的时间为1 h、杂交温度为50 ℃、Streptavidin HRP Conjugate (1.0 mg/mL)稀释2 000倍、二氨基联苯胺(diaminobenzidine, DAB)显色时间为5 min时，芯片检测技术的结果最佳。用该方法与PCR/RT-PCR技术同时对临床采集的96份疑似病料进行检测，两种方法的检测结果一致。本研究构建的检测4种禽呼吸道疾病病毒可视化基因芯片技术具有高通量、快速、准确等优点，为鸡病的临床诊断提供了新的技术。

转基因大豆(Glycine max) SHZD32-1是我国自主研发的耐除草剂大豆转基因品系，该材料将耐草甘膦基因G10-EPSPS导入栽培品种中豆32 (Glycine Max, Zhongdou 32)使其获得耐除草剂抗性，具有广阔的应用前景。到目前为止，尚没有针对SHZD32-1的检测方法系统研究的报道。本研究以转基因大豆SHZD32-1转化体的插入位点基因组序列和外源插入片段/基因组连接区序列为靶标，通过设计和筛选引物、探针，特异性、灵敏度等测试，建立了特异性SHZD32-1转化体普通PCR和qRT-PCR检测方法。检测方法特异性实验中，普通PCR和qRT-PCR方法均只在含有SHZD32-1的样品中扩增出阳性结果，而其他不含有SHZD32-1的检测样品中均为阴性结果；方法灵敏性检测中，普通PCR检测法检出限为0.1%，qRT-PCR法检测下限(limit of detection, LOD)为21个拷贝；方法稳定性实验中，普通PCR和qRT-PCR方法在其相应最低检出限浓度下进行60次重复试验，结果均为阳性。本研究建立的SHZD32-1转化体特异性PCR检测方法特异性好、灵敏度高、稳定性强。转基因作物转化体特异性检测方法的研究是转基因生物分子特征评价的重要内容之一，其为转基因生物安全监管和追溯提供了技术支持。

实时荧光定量PCR(quantitative Real-time PCR, qRT-PCR)是目前研究基因表达的常用方法，而在特定的实验材料及条件下选择合适的内参基因是准确分析目标基因相对表达量的首要条件。本研究以毛竹(Phyllostachys edulis)的根、茎、叶和笋等器官和组织为实验材料，通过qRT-PCR技术对5种常用内参基因：甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)、肌动蛋白(actin, ACT)、热休克蛋白(heat shock protein, HSP)、18S核糖体RNA(18S ribosomal RNA, 18S rRNA)和真核起始因子4α(eukaryotic initiation factor 4α, eIF-4α)在毛竹不同器官和组织中的表达情况进行了分析。经GeNorm、NormFinder和BestKeeper 3个软件对比分析发现，对5种常用内参基因而言，在利用qRT-PCR分析比较毛竹不同叶片之间的基因表达差异时，可选取eIF-4α作为校正内参基因；比较笋不同部位之间的基因表达差异时，可选取18S rRNA或ACT作为校正内参基因；而比较毛竹根、茎、叶不同器官组织分化中的基因表达差异时，可选取18S rRNA作为校正内参基因。而上述发现与多数文献中把ACT作为毛竹唯一内参基因的研究不一致。本研究为在毛竹qRT-PCR分析中选择合适的内参基因提供了理论依据。

流式细胞术广泛应用于植物的染色体倍性鉴定和基因组大小估测。本研究拟建立一套适于枣(Ziziphus jujuba)的流式细胞术方法，为枣倍性育种和基因组分析提供技术支持。以二倍体临猗梨枣和其同源四倍体辰光为材料，系统比较了细胞裂解液种类、叶片成熟度、叶片保存方式及碘化丙啶(propidium Iodide, PI)染液用量对倍性检测效果的影响。结果表明,Tris-MgCl2裂解液的裂解效果最好，木本植物缓冲液(woody plant buffer, WPB)的裂解效果最差；幼嫩叶片检测效果优于成熟叶片，老化叶片不能产生清晰的主峰；在4 ℃和-20 ℃条件下，检测效果随着保存天数的增加而降低，4 ℃保存1~3 d或-20 ℃保存3~6个月后检测效果未发生明显变化，4 ℃保存7 d或-20 ℃保存12个月仍可进行测定；综合考虑成本和检测效果，PI染液适宜用量为30 μL。利用建立的枣流式细胞术倍性检测方法进行倍性检测，确定枣和酸枣(Z. acidojujuba)三倍体和二倍体的荧光强度比值为1.43~1.60，四倍体和二倍体荧光强度比值为1.70~2.11，六倍体和二倍体荧光强度比值为2.90~3.27。估测出的冬枣(组培苗)基因组大小为449.94±3.60 Mb，与其基因组测序结果误差仅为1.33%；同时估测出了献县酸枣、台南1号毛叶枣(Z. mauritiana)(多倍体)、滇刺枣(野生二倍体毛叶枣)基因组大小分别为404.25±2.33，1 349.73±8.22，462.97±8.72 Mb。本研究建立的利用流式细胞术鉴定枣属植物染色体倍性和估测枣属植物基因组大小的方法，操作简单、准确、省时省力，1人1 d内可完成对200余个样品的测定，该方法还适用于梨(Pyrus bretschneideri)、葡萄(Vitis vinifera)、杨树(Populus)和白菜(Brassica rapa)等植物。本研究结果可为枣属植物倍性育种和组学研究提供技术支撑，同时为其他植物提供借鉴参考。

羽衣甘蓝(Brassica oleracea var. acephala)属十字花科(Cruciferea)芸薹属(Brassica)植物，其园艺品种具有叶色鲜艳，耐寒性强的特点，是一种特别适合于晚秋至早春使用的赏食兼用型植物材质。其杂种优势强，商品种基本为F1杂种。在多年观赏羽衣甘蓝双单倍体育种实践的基础上，本研究对包含商品种及其F2至F3代，以及新配制杂交组合在内的103份试材基因型的双单倍体(double haploid, DH)纯系培育及其育种应用进行总结报道。 采用游离小孢子培养，在皱叶、圆叶、羽叶、插花四大类型材料中均获得了DH植株，具胚状体形成的基因型频率为77.7%， 55.3%的试材获得了小孢子再生植株；不同基因型平均每皿(3×105小孢子)的出胚数在0 ~314个之间， DH系间的杂种具有更高的出胚能力。整体上羽衣甘蓝胚状体发育同步性不高，胚状体的植株再生率在0~51.3%之间。F1比其自交后代具有更好的胚状体发生能力，在F2 ~ F3代中，仍然存在具有较好胚状体诱导能力的单株。小孢子植株的倍性复杂，包含单倍、二倍、三倍、四倍及混倍体，二倍体率平均为42.7%。F1材料的小孢子再生株表型多样性丰富，叶色、叶型、株型等性状在DH系中得到了快速固定和多层次表现，隐性基因性状得到表达；F3代材料的小孢子再生株表型性状趋同性高，变异幅度低。与常规育种相比，采用DH技术，可以在羽衣甘蓝F1新品种培育上缩短一半以上的时间。本研究结果不仅为羽衣甘蓝，而且也为其他作物的DH育种提供了较完整的借鉴。

A型流感病毒(Influenza A viruses, IAVs)可以感染禽类和包括人类(Homo sapiens)在内的多种哺乳动物，造成重大经济损失，严重威胁人类健康。接种流感疫苗是预防流感发生的最有效手段，然而不同免疫策略对疫苗接种效果的影响仍未知。为探讨不同免疫策略对流感病毒免疫小鼠(Mus musculus)后抗体产生的影响，本研究选取两株血清学交叉反应性较弱的H9N2亚型禽流感病毒(A/chicken/Hubei/YK524/2015, A/chicken/Shandong/LX830/2014, 分别简称为YK524和LX830)作为研究对象，比较了同源免疫与异源免疫以及病毒灭活与否对抗体产生的影响。首先将病毒通过蔗糖梯度离心纯化，免疫6~7周龄雌性BALB/C小鼠，定期采集血清测定血凝抑制效价(haemagglutinin inhibition titer, HIT)。结果显示，活病毒抗原较灭活病毒抗原刺激小鼠产生的抗体水平更高，具备良好的交叉反应性。说明活病毒更易于刺激机体产生具有广泛交叉反应性的抗体。另一方面，异源免疫可刺激机体产生更多交叉反应性抗体。本研究进一步选择抗体效价较高的两只小鼠，利用杂交瘤技术制备抗流感病毒单克隆抗体。采用间接免疫荧光法筛选抗体分泌克隆。将阳性克隆经过3轮亚克隆，最终获得3株持续分泌抗体的细胞株，分别命名为H9-1、H9-2和H9-3。在对抗体进行鉴定中，发现3株抗体均对LX830及另外1株H9N2亚型禽流感病毒A/Mink/Shandong/wm/2014(Mink/SD/14)具有血凝抑制活性及中和活性，H9-1与H9-2抗体的血凝抑制效价和中和抗体活性均高于H9-3。推测这3株抗体的抗原识别表位位于血凝素(haemagglutinin, HA)球部受体结合部位。3株抗体均不可与YK524发生特异性结合，也不具备血凝抑制活性及中和活性，推测可能与YK524的血凝素基因上关键位点的差异有关。本研究探讨了可刺激机体产生更广谱抗体应答的途径，为流感疫苗的研发以及免疫策略的制定提供了参考，所制备的单克隆抗体可用于流感病毒诊断试剂的开发。