为研究吐鲁番黑羊(Ovis aries)的繁殖调控，培育新的高繁殖力绵羊品种，本研究以吐鲁番黑羊卵泡期和黄体期显著差异表达的绵羊微小RNA150(Ovis aries microRNA150, oar-mir-150)为研究对象，利用生物信息学预测oar-mir-150的靶基因，应用qRT-PCR检测吐鲁番黑羊卵泡期和黄体期卵巢组织中oar-mir-150和类固醇激素合成急性调节蛋白基因(steroidogenic acute regulatory protein gene, STAR)的表达水平，合成野生型、突变型和缺失型STAR基因碱基序列，退火扩增后与PGL3-control载体连接，构建荧光素酶报告基因重组载体，将绵羊oar-mir-150 mimic或negative control mimic与重组载体共转到293T细胞，利用双荧光素酶活性检测实验检测荧光素酶活性。结果表明，oar-mir-150的全部靶基因有540个，其中卵泡期与黄体期差异表达的靶基因有8个，STAR 基因作为卵泡期较黄体期表达显著上调的靶基因其mRNA的3'非翻译区(3' untranslated region, 3' UTR)存在oar-mir-150靶标结合位点(UUGGGAG)；相对定量结果显示：卵泡期与黄体期相比，吐鲁番黑羊卵巢组织中oar-mir-150相对表达量为0.73，显著下调(P＜0.05), STAR mRNA相对表达量为1.90，显著上调(P＜0.05)；成功构建野生型、突变型和缺失型荧光素酶报告基因重组载体，并以最佳转染效率和最佳转染比例进行转染；双荧光素酶活性检测结果表明oar-mir-150靶向负调控STAR的表达。研究证明了oar-mir-150与STAR间存在确切的靶向关系，且负调控STAR基因的表达，为研究微小RNA(microRNA,miRNA)在发情周期的不同阶段调控吐鲁番黑羊繁殖过程提供理论依据。

布鲁氏菌(Brucella)是一种革兰氏阴性兼胞内寄生菌，是多种动物和人布氏杆菌病的病原。 布鲁氏菌磷酸甘露糖变位酶(phosphomannomutase, manB)基因编码磷酸甘露糖变位酶,是布鲁氏菌毒力因子脂多糖的重要组成成分。为了研究布鲁氏菌毒力因子脂多糖的ManB蛋白的生物学功能和免疫原性，本文构建磷酸甘露糖变位酶manb基因原核表达载体，对ManB蛋白进行生物信息学预测分析并鉴定其免疫原性。采用PCR技术对布鲁氏菌manB基因进行特异性扩增，与pET-28a表达载体连接后转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)和Western blot检测目的蛋白的表达及其反应原性，并通过小鼠(Mus musculus)免疫实验评价其免疫原性。生物信息学分析显示，该蛋白无跨膜区结构，不存在信号肽，二级结构以α-螺旋为主。利用Phyre2服务器成功构建了该蛋白的三维模型。SDS-PAGE和Western blot结果表明获得了约56.3 kD的融合蛋白，且该融合蛋白与羊抗布鲁氏菌阳性血清可发生特异性反应。间接酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)结果显示，免疫小鼠7、14、21 d，实验组小鼠均可产生抗体，且随时间增加抗体水平也随之升高，并在免疫21 d后达到最高峰。ManB重组蛋白免疫小鼠后可诱导产生高水平的特异性抗体，具有良好的免疫原性。本研究结果为今后开发布鲁氏菌新型疫苗提供了新材料。

为了明确黄瓜(Cucumis sativus)节间长性状的遗传模型与基因的作用方式，并估测其主基因、多基因遗传效应与遗传率，利用短节自交系SJ57-h为P1和长节自交系SJ11-1为P2构建6世代遗传群体，在春秋两季种植，采用主+多基因遗传分析方法，开展节间长性状的遗传研究。研究结果显示，两季节间长受1对加性-显性-主基因+加性-显性-上位性多基因控制(D-0模型)，且均偏向长节间亲本优势，长短更趋近于SJ11-1亲本。春季B1、B2、F2三个分离世代的主基因遗传率分别为68.5%、36.2%和56.3%，多基因遗传率分别为0.6%、17.1%和0.6%，环境变异平均值占表型变异的比例平均为40.2%；秋季B1、B2、F2三个分离世代的主基因遗传率分别为68.5%、40.5%、65.1%，多基因遗传率分别为1.2%、40.6%和5.4%；环境变异平均值占表型变异的比例为26.3%。表明黄瓜节间长受一对主基因控制，主基因在B1、F2世代选择效率高，B2世代加强多基因的选择，该性状受环境影响较大。节间长性状适宜在早期世代进行选择。本研究为黄瓜的株型改良育种提供了理论基础。

枇杷(Eriobotrya japonica)叶是中国传统药用植物资源，五环三萜类化合物(pentacyclic triterpenoids)作为枇杷的主要活性成份具有广泛的药理作用和重要的生物活性，同时也是枇杷三萜类物质的主要组成。经细胞悬浮培养产生的五环三萜类化合物含量远高于原植株。本研究以原植株枇杷叶片、愈伤组织(悬浮培养的必经阶段)、2个富含五环三萜类化合物的调控，共4个样品进行了转录组测序，用生物信息学方法进行Unigene的从头测序拼接，蛋白质功能注释，代谢通路分析。结果共获得123 685个Unigene，平均长度为804.44 bp。三萜合成相关途径中，叶片(样本Ⅰ)分别与培养细胞(样本Ⅱ, 样本Ⅲ, 样本Ⅳ)的基因表达差异较大，愈伤组织阶段(样本Ⅱ)与富含五环三萜类目标产物的不同调控(样本Ⅲ，样本Ⅳ)之间的基因表达模式相近。在三萜骨架形成和修饰代谢途径中，以样本之间差异基因的交集结合已报道的重要基因进行筛选，从整体上分析了枇杷五环三萜类化合物代谢途径中的关键性酶为乙酰辅酶A酰基转移酶(acetyl-CoA acetyltransferase, AACT)，鲨烯合成酶(squalene synthase, SQS)，鲨烯环氧酶(squalene monooxygenase, SQE)，香树素合酶(amyrin synthase, AS) ，细胞色素 P450(cytochrome P450, CYP450)，糖基化转移酶(UDP-glycosyltransferase, UGT)，这些酶相关基因或不同家族基因成员的表达水平与目标产物的含量有一定相关性，为进一步深入研究此物种三萜合成途径提供理论依据。同时，枇杷愈伤组织阶段五环三萜类化合物合成途径已经大量开启，是枇杷细胞悬浮培养的重要中间阶段。本研究通过Illumina HiSeq 4000平台，首次利用转录组测序技术对枇杷细胞悬浮培养后五环三萜类活性成分富集的遗传基础进行分析，为进一步完善植物体五环三萜类化合物的合成机制提供理论依据，同时也为枇杷细胞悬浮培养生产萜类物质的人工调控提供基础资料。

14-3-3蛋白对植物的生长发育、逆境生理及淀粉代谢有重要的调控作用。为探究14-3-3蛋白对枸杞(Lycium barbarum)花药发育过程中淀粉代谢的调控功能，本研究以宁夏枸杞品种宁杞１号花药为材料，利用反转录PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)技术，克隆了1个花药发育差异表达蛋白基因。生物学信息分析表明该基因属于14-3-3蛋白基因家族，命名为Lb14-3-3a(GenBank登录号: MG189703)。运用Gateway技术，构建了Lb14-3-3a基因的植物过表达载体pMDC83-Lb14-3-3a。通过农杆菌(Agrobacterium)介导法，将pMDC83-Lb14-3-3a转入马铃薯(Solanum tuberosum)品种紫花白幼茎中，并分析了Lb14-3-3a基因在阳性转化苗中的表达情况及叶片淀粉含量。结果表明，Lb14-3-3a基因的ORF长768 bp，编码的蛋白含有256个氨基酸残基，分子量为61.9 kD，等电点为4.99，具有14-3-3蛋白家族保守结构域。Lb14-3-3a蛋白与烟草(Nicotiana tabacum)、番茄(Lycopersicon esculentum)的14-3-3蛋白处于进化树同一分枝上，亲缘关系最近。经抗性筛选及PCR鉴定，获得马铃薯转基因植株。在CaMV35s(35S promoter of cauliflower mosaic virus)强启动子下，外源基因Lb14-3-3a在马铃薯中可以表达。幼苗期野生型与转基因植株的淀粉含量相差不大，结薯期和成熟期转基因植株叶片淀粉含量比野生型都高，且差异显著(P＜0.05)，推测枸杞Lb14-3-3a基因可能影响马铃薯淀粉的合成。本研究结果为进一步探讨Lb14-3-3a基因对枸杞花药发育过程中淀粉积累与水解供能代谢的调控提供了参考依据。

肌细胞增强因子2D(myocyte enhancer factor 2D, MEF2D)是属于肌细胞增强因子2(myocyte enhancer factor 2, MEF2)基因家族一员，被认为与骨骼肌生长发育有关。为研究MEF2D基因的多态性对兴义鸭(Anas platyrhynchos domestica)屠宰性状的影响，本研究利用PCR扩增结合测序的方法对90日龄兴义鸭MEF2D基因外显子区域进行SNP位点筛选，同时运用qRT-PCR对0~150日龄兴义鸭不同组织中该基因mRNA表达规律进行探究。结果显示，在MEF2D基因外显子区域共发现6个SNPs，均为同义突变；群体遗传学分析显示，6个多态位点均表现为中度多态(0.25＜PIC＜0.5)，经χ2检验表明兴义鸭群体在这6个多态位点均处于Hardy-weinberg平衡状态(P＞0.05)；各SNPs与屠宰性状关联分析发现，T16236C位点的不同基因型在活重和屠体重存在显著差异(P＜0.05)，A16305C和A21071G位点对多项屠宰指标存在显著或极显著影响(P＜0.05或P＜0.01)，G16359C位点的CC基因型个体半净膛重、全净膛重显著高于GG基因型个体(P＜0.05)，其余SNPs对屠宰性状无显著影响(P＞0.05)；单倍型分析结果表明，兴义鸭CGCCCG单倍型的半净膛重和半净膛率显著或极显著高于其他单倍型(P＜0.05或P＜0.01)；TACCCA单倍型的腿肌重显著高于其他单倍型(P＜0.05)；TATAGA单倍型的全净膛率显著高于其他单倍型(P＜0.05)；qRT-PCR结果显示，在10个组织中均检测到了MEF2D基因的表达，说明该基因的表达具有广谱性，且公母差异显著，母鸭腿肌中的表达量最高，心、肝脏、肺脏、肾脏、十二指肠、大脑、胸肌、腺胃中的表达量较高，而公鸭心肌、肝脏中的表达量最高，十二指肠、大脑、胸肌、腿肌、腺胃中的表达量较高。研究结果可为兴义鸭屠宰性状的分子标记辅助选育提供参考，同时为鸭MEF2D基因结构功能的进一步研究提供理论基础资料。

跨膜蛋白9B(transmembrane protein 9 domain family member B, TMEM9B)是近年来被发现的一种多功能糖蛋白，研究表明TMEM9B蛋白在多条信号通路中发挥关键调控作用。而目前，关于该基因的表达和功能特性研究报道较少。本研究选择海兰褐鸡(Gallus gallus)、爱拔益加肉鸡(arbor acres plus broiler, AA+肉鸡)和三黄鸡为研究对象，通过克隆不同品系鸡Tmem9B基因的全长编码序列并对比分析，同时利用实时荧光定量PCR(quantitative real time polymerase chain reaction, qRT-PCR)技术定量鉴定Tmem9B基因在3个品系(AA+肉鸡、三黄鸡和海兰褐鸡)正常雏鸡和大肠杆菌(Escherichia coli)脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的炎症模型雏鸡(AA+肉鸡和海兰褐鸡)的表达变化，研究Tmem9B基因在不同品系雏鸡间的表达活性与功能特性。实验结果表明，三黄鸡Tmem9B基因编码序列存在1个SNP位点，该基因在不同品系鸡间高度保守。组织表达谱分析显示Tmem9B基因在AA+肉鸡、三黄鸡和海兰褐雏鸡的多种组织中均有表达，但是不同品系雏鸡间略有差异。有趣的是，Tmem9B基因在3个品系雏鸡的脑组织中均具有高转录活性。在LPS诱导的炎症模型雏鸡中，Tmem9B基因在免疫相关组织中的转录活性均显著上调。本研究表明，鸡Tmem9B可能是在鸡的生长发育和炎症反应等生物学过程中具有重要作用的一个多功能基因。本研究结果为进一步探索Tmem9B基因的功能与特性提供了理论依据。

免疫相关基因的筛选与研究是猪(Sus scrofa)抗病育种的前提与基础。本研究基于课题组前期对仔猪的T淋巴细胞亚群指标进行的全基因组关联分析(genome-wide association study, GWAS)，对5号染色体上一个1.05 Mb免疫调控区域内包含的6个免疫相关基因：白细胞分化抗原4(cluster of differentiation 4, CD4)、淋巴细胞活化基因-3(lymphocyte activation gene-3, LAG3)、白细胞分化抗原27(cluster of differentiation 27, CD27)、淋巴毒素β-受体(lymphotoxin beta receptor, LTBR)瘤坏死因子受体超家族成员1A(tumor necrosis factor receptor superfamily member 1a, TNFRSF1A)和白细胞分化抗原9(cluster of differentiation 9, CD9)在大蒲莲和长白仔猪群体外周血液中的表达量进行检测，并对各基因开展品种和母猪效应分析，为进一步筛选影响大蒲莲仔猪高抗病力的候选基因提供借鉴。采集大蒲莲猪(104头)和长白猪(171头)35日龄仔猪的外周血，提取总RNA，逆转录为cDNA后，通过qRT-PCR的方法进行上述免疫相关基因和内参基因β2-微球蛋白(beta-2-microglobulin, B2M)的表达水平检测，在对各免疫基因表达量通过内参基因校正后，对矫正后的表达量ΔCt在大蒲莲猪和长白猪群体内的表达特征、品种和母猪效应进行分析。结果显示，大蒲莲仔猪CD4和CD27基因表达量极显著低于长白仔猪(P＜0.01)，且母猪效应差异也达到极显著水平(P＜0.01)；大蒲莲仔猪TNFRSF1A基因表达量显著低于长白仔猪(P＜0.05)；大蒲莲仔猪CD9基因表达量极显著高于长白仔猪(P＜0.01)。本研究对基于GWAS的6个免疫相关基因在大蒲莲猪和长白猪群体内的表达开展分析，其中CD4、CD27、TNFRSF1A和CD9 4个基因在大蒲莲和长白仔猪群体间显著差异表达，这些基因可以考虑作为影响大蒲莲仔猪高抗病力的候选基因，为大蒲莲仔猪高抗病力性状的标记辅助选择研究提供基础。

奶牛(Bos taurus)的繁殖性能与机体能量代谢密切相关，过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ)是由PPARG基因编码的配体激活的核转录因子，在调控动物能量稳态、繁殖生理和免疫应答等过程中发挥关键性作用，PPARG是奶牛繁殖性状的重要候选基因。本实验采用聚合酶链式反应-单链构象多态(polymerase chain reaction products-single strand conformation polymorphism, PCR-SSCP)技术并结合测序，检测中国荷斯坦牛PPARG基因exon7区Q448H错义突变，并分析其对中国荷斯坦牛繁殖性状的影响。结果表明，PPARG基因exon7共存在2 个等位基因3种基因型，等位基因G/T在低代杂种、高代杂种和纯种荷斯坦牛群体中的频率分别为0.65/0.35、0.75/0.25和0.69/0.31，优势基因型为GG型；3个实验群体在该位点均处于中度多态。测序结果显示，与普通牛PPARG基因序列(NC_007320.6)相比，T等位基因在64 947位核苷酸处发生了G→T的碱基突变，导致第448位氨基酸由谷氨酰胺变为组氨酸，而G等位基因与NC_007320.6序列相同。最小二乘法分析表明，GG型产后第一次配种天数(days to first breeding, DFB)显著低于GT型(P＜0.05)和TT型(P＜0.01)，标记对产后第一次配种天数的表型贡献率为3.82%；GG型空怀天数(days open, DO)显著低于GT型(P＜0.05)，标记对空怀天数的表型贡献率为2.55%；GG型第1胎次配妊次数(number of services per conception, NSC)显著低于GT型(P＜0.01)，标记对第1胎次配妊次数的表型贡献率为2.24%；第2胎次NSC显著低于GT型和TT型(P＜0.05)，标记对第2胎次配妊次数的表型贡献率为3.46%；各基因型之间初产月龄(age at first calving, AFC)差异不显著(P＞0.05)。对于G等位基因，DFB、DO和NSC(第2胎次)的加性效应分别为-6.97 d、-11.2 d和-0.215次。基因替代效应分别为-8.83 d、-15.70 d和-0.25次，即每个G等位基因替代T等位基因会导致产后第一次配种天数提前8.83 d，空怀天数缩短15.7 d，配妊次数降低0.25次，等位基因G为高繁殖性能优势基因。PPARG基因Q448H突变位点可作为中国荷斯坦牛繁殖性状的分子标记。本研究为中国荷斯坦牛繁殖性状的标记辅助选择提供了理论依据。

肌醇-1-磷酸合成酶(myo-inositol-1-phosphate synthase, MIPS)是生物肌醇代谢调节的关键酶之一，为了解MIPS基因与大黄鱼(Larimichthys crocea)低温胁迫应激响应的相关性，本研究通过cDNA 末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术克隆了大黄鱼MIPS基因的cDNA全长、进行了序列分析并检测了其在急性和慢性低温胁迫下的表达变化。结果表明，大黄鱼MIPS基因cDNA (GenBank登录号: MG760436)全长为2 599 bp，含1个长度为1 659 bp的开放阅读框，预测编码蛋白含553个氨基酸、分子量为 60.5 kD。序列比对显示，大黄鱼与其他硬骨鱼类的MIPS氨基酸序列相似性较高(85.5%~88.4%)，均含有4个高度保守核心区。系统进化树中大黄鱼MIPS与其他硬骨鱼类MIPS聚为1个大簇，并与红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)MIPS的进化关系最近。慢性低温胁迫中(12 ℃缓降至6 ℃)，大黄鱼MIPS基因在鳃、皮肤和心脏组织中均呈现先显著上升后显著下降的趋势(P＜0.05)，在8 ℃时达到峰值表达量，分别为12 ℃时的13.71、89.50和50.83倍；脑和肌肉中MIPS表达量在整个胁迫过程中持续升高，6 ℃时表达量比降温前分别升高了99.89和110.17倍；肠、肾、肝、脾中MIPS表达量则无显著变化(P＞0.05)。急性低温胁迫(由12 ℃骤降至8 ℃并持续胁迫4 h)下，MIPS基因在除肠以外的其他组织均出现显著的表达量上调(P＜0.05)，以脑和肌肉中变化最为显著，分别比胁迫前升高了54.53和32.89倍。急性和慢性低温胁迫实验的结果提示，MIPS基因参与了大黄鱼的低温胁迫应激响应，并可能与大黄鱼的低温适应性有关，脑和肌肉是大黄鱼应对低温胁迫调节中的重要组织。该研究结果为研究大黄鱼MIPS基因的功能及研究大黄鱼低温耐受性、选育耐低温品种提供了参考资料。

甜瓜(Cucumis melo)主要在世界温带到热带地区栽培。为从转录组水平上挖掘甜瓜雄性不育的发生过程与超氧代谢和相关氧化酶活性的相关性，本研究利用雄性不育两用系对甜瓜可育株与不育株5 mm的花蕾雄蕊进行转录组测序，筛选氧化酶相关差异表达基因。此外，本研究在花蕾雄蕊5 mm时期对其进行qRT-PCR分析以鉴定差异基因表达量，并对雄性不育株与可育株的花蕾酶活性进行测定。结果显示，转录组测序共有1 364个差异基因表达，其中表达上调的基因共有834个，表达下调的基因共有530个。根据相同或相似的表达模式对上述筛选得到的差异表达基因进行聚类分析，共将这些差异表达基因分为28类，其中第8类中有18个差异表达基因，这些基因参与超氧代谢途径相关性极其显著(P＞0.001)。对差异表达基因进行基因本体论(Gene Ontology, GO)功能分析显示，共有1 118个基因归属于生物合成、分子功能和细胞组分3大分支，过氧化氢酶参与的催化过程中有576个差异表达基因，其中17个基因差异表达极显著。京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)注释结果显示，与氧化还原酶相关的差异基因为10个，其中9个为过氧化物酶同源基因，1个为过氧化氢酶相关表达基因。在苯丙素的生物合成途径中，与过氧化物酶相关基因MELO3C012183在雄性不育株与雄性可育株相比基因表达显著上调，过氧化物酶相关基因MELO3C014656表达显著下调。在色氨酸代谢途径中，与过氧化氢酶同工酶相关基因MELO3C017024在雄性不育株与雄性可育株相比基因表达显著上调。qRT-PCR验证表明，与过氧化物酶(peroxidase, POD)相关基因peroxidase 2-like precursor和peroxidase 11表达量可育株都低于不育株，而过氧化氢酶(cata-lase, CAT)相关表达基因catalase isozyme 1-like表达量可育株高于不育株，而雄性不育株中POD和CAT酶活性均高于可育株。研究结果表明，过氧化物酶POD和过氧化氢酶CAT活性在不育株系中的差异表达是由植物自我保护激发诱导产生，氧自由基的积累使不育株系的膜脂过氧化水平异常升高，此现象有可能对小孢子发育造成伤害，从而导致花粉败育。本研究为甜瓜花粉发生败育的内在原因和作用机理提供了一定的科学依据。

超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2, SOD2)基因作为内源性抗氧化防御屏障重要组成部分，在抗肿瘤、抗炎症、抗衰老、预防疾病等方面发挥着重要的作用。为探讨SOD2基因在临床型乳房炎与正常绵羊(Ovis aries)乳腺组织中的表达与定位情况。实验选取临床型乳房炎与正常绵羊各3只，采集乳腺组织，应用荧光定量PCR和Western blot方法检测SOD2 mRNA与蛋白在正常与临床型乳房炎绵羊乳腺组织中的表达情况，并应用免疫组织化学方法对正常与临床型乳房炎绵羊乳腺组织中的SOD2蛋白进行定位。结果显示，临床型乳房炎与正常绵羊乳腺组织中均有SOD2基因的表达，且临床型乳房炎乳腺组织中该基因的mRNA与蛋白表达均极显著高于对照组(P＜0.01)；免疫组织化学染色发现，正常与临床型乳房炎绵羊乳腺组织中的乳腺上皮细胞均有SOD2阳性表达，且临床型乳房炎绵羊乳腺组织中该蛋白的阳性反应较强。研究结果表明，临床型乳房炎绵羊乳腺组织中SOD2 mRNA和蛋白表达均上调，这为进一步研究该基因与绵羊乳房炎发病机理提供了基础性的数据资料。

嗜热角蛋白酶可在较高的温度下降解角蛋白，具有良好的热稳定性。为了克隆嗜热地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)Y6角蛋白酶基因，研究重组角蛋白酶酶学特性，本实验根据角蛋白酶基因设计引物，克隆了一个含完整开放性阅读框的1 140 bp基因片段(GenBank No. MF327392)，将该片段插入到表达载体pET-32a，转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)，成功诱导表达出重组角蛋白酶，经Ni-亲和柱纯化后对酶学特性进行测定。结果显示Y6菌株的角蛋白酶前体有1个29个氨基酸残基的信号肽，成熟蛋白的理论相对分子量为27.27 kD，等电点为6.57，属于疏水性稳定蛋白质。以酪蛋白为底物，测得重组角蛋白酶最适反应温度为70 ℃，最适反应pH为8.5，Vmax为0.149 mmol/(L·min)，Km为0.029 mmol/L，Kcat为20.1 S-1。乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS)、苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)、Mn2+、Fe3+对其酶活性有一定的抑制作用，但异丙醇、甘油、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)等有机溶剂对其活性没有影响。该嗜热角蛋白酶具有较大的应用潜力，未来可应用于某些工业生产中。

毛乳头细胞(dermal papilla cells, DPCs)是毛囊(hair follicle, HF)底部一种特化的具有诱导毛囊再生能力的细胞，是诱导毛囊重建、传导毛发生长信号的重要结构。本研究通过采集陕北白绒山羊(Capra hircus)生长期皮肤组织样本，使用显微解剖法剥离毛乳头(dermal papilla, DP)并进行体外原代培养，利用细胞免疫荧光染色法检测DPCs中α-平滑肌激动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)和CD133 /prominin-1(5_transmembrane, 5_TM)的表达，然后采用细胞计数、MTT(3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide)比色法、碱性磷酸酶(alkaline phosphatas, AKP)的测定等方法比较DPCs在不同血清比例下的常规培养DMEM/F12(dulbecco's modified eagle media/nutrient mixture F-12)(1∶1)与DMEM/F-12 GlutaMAX、减血清培养基Advanced DMEM/F-12与Advanced RPMI 1640(roswell park memorial institute 1640)的体外培养效果。结果显示： (1)细胞免疫组化染色证实所培养的细胞为DPCs，在供试的4种培养基中加入不同比例的血清后，均可成功培养DPCs并传代；(2)体外培养DPCs的4种培养基中，添加的血清比例越高，细胞的生长、增殖速度越快，细胞活力、细胞诱导能力越强；(3)当添加10%血清时，减血清培养基培养的DPCs的生长增殖速率及生物学功能均明显高于常规培养基(P＜0.05)；(4)添加4%~6%血清的减血清培养基与添加10%血清的常规培养基的培养效果无显著性差异(P＞0.05)。由此可知，减血清培养基相较于常规培养基，含有对DPCs生长增殖、细胞活力、细胞诱导能力维持或加强的有效因子，因此添加4%~6%血清的减血清培养基更适合于DPCs培养。本研究首次提出利用减血清培养基体外培养DPCs，并探究出较适宜陕北白绒山羊DPCs体外培养的最佳培养基类型及血清浓度，为进一步研究毛乳头在毛囊周期发育中的分子机制提供了理想细胞模型参考。

枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis) FJ-3-16是一株角蛋白酶高产菌株，在畜禽废弃物降解和生物脱毛方面有潜在应用价值。为提高菌株B. subtilis FJ-3-16胞外角蛋白酶产量，本研究综合利用单因子实验、Plackett-Burman(PB)设计和中心组合设计(Central composite design, CCD)优化了B. subtilis FJ-3-16的摇瓶产酶发酵条件，优化后的培养基配方为玉米粉1.41%、豆粉3.62%、酪素2%、CaCl2 0.16%、K2HPO4 0.3%、KH2PO4 0.1%、pH 8.0，温度37 ℃，转速250 r/min，培养时间48 h，胞外角蛋白酶酶活由原有培养基的73.82 U/mL提高至166.08 U/mL。且建立了利用50 L发酵罐生产角蛋白酶的发酵工艺，酶活在摇瓶发酵的基础上进一步提高，达207.6 U/mL，同时产酶时间缩短至18 h。同时利用菌株发酵液对巴马香猪(Sus scrofa)的猪蹄、猪头皮张及猪蹄整蹄进行脱毛，效果显著，表明B. subtilis FJ-3-16在巴马香猪为代表的难脱毛生猪的脱毛应用中具有极好的应用前景。本研究为实现角蛋白酶的工业化应用提供了基础资料。

山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum subsp. capripneumoniae, Mccp)是山羊传染性胸膜肺炎(contagious capri pleuropneumonia, CCPP)的病原。本研究根据GenBank公布的Mccp F38株(No.LN515398.1) arcD (MCCPF38_00114)基因序列设计1对特异性引物，建立了针对Mccp的SYBR Green I qRT-PCR方法。结果显示，该方法能特异性检测Mccp，与丝状支原体山羊亚种(Mycoplasma mycoides subsp. capri, Mmc)、副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis, HPS)、绵羊肺炎支原体(Myplasma ovipenumoniae, Mo)、羊传染性脓疱毒(Orf virus, ORFV)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, SA)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida, Pm)、大肠杆菌(Escherichia coli, Ec)等羊常见病原均无交叉反应，表明该方法具有良好的特异性；该方法的最低检测限为279 copies/μL，组内和组间变异系数均小于1%，说明该方法灵敏度高、重复性好。本研究建立的检测Mccp arcD基因的SYBR Green I qRT-PCR方法为CCPP的临床早期诊断及定量分析Mccp感染水平提供了更准确的方法。

口蹄疫(Foot-and-mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)引起的一种高度接触传染性动物疫病。本研究拟建立一种能区分FMDV O/A/AsiaⅠ型的基因芯片。根据FMDV O/A/AsiaⅠ型的VP1基因序列设计3对特异性引物，用RT-PCR扩增获得248、206和239 bp的三个靶基因片段，并针对这三个片段分别设计了3种探针，以引物荧光标记法标记靶基因，建立了一种鉴别FMDV O/A/AsiaⅠ型的分型基因芯片并进行了敏感性、特异性、重复性和保存期评价。结果表明最佳反应条件为：水化温度37 ℃，封闭液为0.25% BH4Na/25% 乙醇，杂交温度为42 ℃。灵敏性实验表明，FMDV-O 检测限为118 pg/mL，FMDV-A为18.4 pg/mL，FMDV-AsiaⅠ为129 pg/mL，芯片方法灵敏度比常规RT-PCR高10~100倍；特异性实验表明，O、A和AsiaⅠ三型之间无交叉杂交；该芯片可至少保存3个月仍能重复使用。本研究建立的FMDV分型基因芯片为O、A和AsiaⅠ型鉴别提供了新方法。

本研究旨在开发传染性造血器官坏死病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus, IHNV)现场检测新技术，用于鉴定鱼类苗种是否携带IHNV，降低疫病传播风险，实现水产健康养殖管理。基于IHNV基因组序列保守性分析结果，以保守性最高的基质蛋白编码基因(matrix, M)为检测靶序列，设计了6条IHNV特异性扩增引物，对样品RNA进行逆转录等温链置换扩增。在部分引物5’端标记二茂铁分子，使扩增产物带有电化学信号，在部分底物中标记生物素分子，使扩增产物被亲和素修饰的电极表面捕获锚定，基于该原理构建了电化学生物传感体系，通过检测扩增产物的循环伏安信号，判断样品中是否携带IHNV。本方法能够在15 min内完成核酸扩增，且扩增反应在59~65 ℃的宽松温度区间内均可进行，无需精准控温，对设备和操作要求较低。在扩增温度63℃、信噪比为3的条件下，本方法最低检测限(limit of detection, LoD)为6.2 copies/μL，能够对未表现出感染症状的鲑鳟类鱼苗、鱼卵进行IHNV检测，适用于苗种场、养殖场等生产经营性场所的现场检测，在水产苗种鉴定领域具有良好的应用前景。

由规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)以及CRISPR相关蛋白９(CRISPR-associated protein 9, Cas9)组成的系统被发现广泛存在于细菌及古菌中，是机体长期进化形成的由RNA指导的降解外源遗传物质的适应性免疫系统。由于该系统可以识别靶向序列完成DNA的双链切割，因此从2013年起，CRISPR/Cas9系统即被改造为基因编辑工具。作为一种新型的基因组编辑技术，CRISPR/Cas9系统具有设计简单、特异性强、效率高等优点，为基因组定向改造调控和应用带来了突破性的革命，并且迅速在基础理论、转基因动物生产、基因诊断和临床治疗等领域中得到广泛的研究与应用。然而，CRISPR/Cas9也存在着脱靶效应和外源基因插入困难等一些亟待解决的问题，这在一定程度上限制了CRISPR/Cas9 的应用。因此，近年来围绕CRISPR系统改进获得了一系列可用于基因编辑与基因表达修饰的新工具。本文介绍了CRISPR系统的组成、工作原理，并综述了近几年来基于CRISPR系统开发的几种新型基因编辑工具以及基因表达修饰工具的研究进展和应用，并对其应用前景和发展方向进行了展望。