黑籽南瓜(Cucurbita ficifolia)具有很强的抗逆能力，对低温、干旱、贫瘠土壤以及瓜类枯萎病等逆境均具有较强的抗性，这些优良的抗性基因很难通过有性杂交转移到其它瓜类作物上，但可通过可转化人工染色体(TAC)以大片段的形式转化到其它瓜类作物中。本研究利用TAC载体构建了黑籽南瓜基因组DNA文库，该文库包含57 560个克隆，保存在150块384孔板中，其库容量相当于黑籽南瓜基因组的 7 倍。TAC文库克隆插入片段大小分布范围为20~100 kb，超过 40 kb 插入片段克隆占40%以上，插入片段平均大小为45 kb。在挑取的15个TAC克隆中无空克隆；细菌继代培养30、60和100代后质粒的酶切鉴定表明，TAC 克隆可以在大肠杆菌(Escherichia coli) DH 10B 中稳定复制和保存，说明本研究构建的文库质量较高。该研究结果表明，TAC文库为黑籽南瓜抗性基因的克隆、功能验证、物理图谱的构建和基因组测序等有关研究提供了基础资料。

转基因产品的安全性一直都备受关注，因此转基因产品的定性、定量检测越来越重要，而转基因标准物质的使用是转基因产品检测结果有效和可比的重要保证。本文针对国内外转基因植物标准物质的研究现状及相关技术进行综述，重点介绍了转基因植物标准物质的种类、转基因标准物质定值技术，分析了转基因标准物质研制过程中的关键点。更重要的是综述并提出了质粒DNA分子标准物质的定值模式，包括如何合理评价质粒分子可替代性问题，此外还总结了目前国外转基因标准物质的种类，目的是为我国转基因植物标准物质研制和相关研究提供有价值的参考。

牛支原体(Mycoplasma bovis)是感染牛的一种重要的致病性病原体。本研究利用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术建立了牛支原体的快速检测方法。该方法以牛支原体保守性基因uvrC为靶序列设计了5 条特异引物，在58℃等温条件下，60 min 即可完成反应。LAMP 方法能检测出20 pg牛支原体DNA，较PCR方法高100 倍，用牛鼻支原体(M. bovirhinis)、无乳支原体(M. agalactiae)、精氨酸支原体(M. ariginini)、牛副流感病毒(BPIV)、牛腺病毒(BADV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)作特异性检测，两种方法均有很高的特异性。本研究还将荧光显色剂钙黄绿素(calcein)和Mn2+用于LAMP反应结果的可视化检测。临床鼻拭子样品煮沸后，可直接进行等温扩增，省去了DNA提取步骤。在对167个临床鼻拭子样本的检测中，LAMP 方法检测结果阳性率(26.95%)高于PCR方法检测出阳性率(19.16%)，这证明本研究所建立的方法，与PCR法比较更适于临床样品的检测。研究结果表明，LAMP 方法具有操作简便、快速、高效、敏感、特异、经济等特点，适于基层实验室监测的广泛使用。

种子败育的无籽瓜果具有较强的市场竞争力和可观的经济价值。来源于解淀粉芽胞杆菌(Bacillus Amyloliquefaciens)的Barnase基因编码12 kD的胞外小分子核糖核酸酶(RNAase)。在缺乏其天然抑制物Barstar的情况下，单独表达Barnase通常会造成宿主细胞的死亡。本研究用油菜(Brassica napus)种子特异启动子Napin调控Barnase基因，构建T-DNA表达载体，并用叶盘转化法转化烟草(Nicotiana benthamiana)，获得55株转基因植株。随机抽取10株对其花器官进行形态学分析，并比较转基因植株和非转基因植株在不同发育时期花器官的形态学变化，发现转基因植株和非转基因植株在授粉前的花器官形态没有明显差异，但是受精以后转基因植株花瓣逐渐枯萎，不能正常发育形成种子，而非转基因植株能够正常形成种子。为了进一步了解转基因烟草种子败育的原因，将转基因植株和非转基因植株正反杂交，均不能正常结籽，表明转基因烟草的种子败育不是由自交不亲和性引起的。将转基因植株和非转基因植株花粉分别使用亚历山大染液染色，显微观察花粉的大小、形状和色泽，发现转基因花粉和非转基因花粉无明显差别，转基因植株和非转基因植株均能产生具有正常授粉活性的花粉。以上研究表明，使用种子特异性启动子驱动Barnase基因表达，外源基因不会通过花粉渗漏表达。本研究成功获得了Barnase基因在种子中特异表达的无籽转基因烟草，该研究为无籽植物的研制提供了一种全新的模式和思路。

苦荞(Fagopyrum tataricum)作为一种药食两用植物，富含以芦丁为主的黄酮类化合物。苦荞芽期芦丁含量较高，其分子机制尚不清楚。本研究选用西荞2号，采用AlCl3法测定了苦荞芽期6~10 d胚轴和子叶中的总黄酮，采用半定量RT-PCR分析其黄酮合成途径中主要关键酶基因苯丙氨酸氨裂解酶基因(Pal)、查尔酮异构酶基因(Chi)和黄酮醇合酶基因(Fls)，以及MYB转录因子基因FtMyb1、FtMyb2和FtMyb3的相对表达水平，并对三者之间的相关性进行了统计学分析。结果表明，以相关系数绝对值大于0.75为阈值，子叶中，总黄酮的积累与FtMyb3表达显著正相关(0.9625)，与FtMyb2表达显著负相关(－0.8572)；Chi与FtMyb2表达显著正相关(0.8468)，与FtMyb3表达显著负相关(－0.8010)；Pal、Chi和Fls表达彼此显著正相关，相关系数分别为0.9119、0.8920和0.7584。子叶中总黄酮含量在4.58%~5.54%之间，且随芽期递增。Pal、Chi和Fls整体表达趋势相似，均呈现先升高后降低的趋势，且Fls的表达水平明显高于前二者。FtMyb2 和FtMyb3整体表达趋势相反，FtMyb2呈下降趋势，FtMyb3呈上升趋势。胚轴中，总黄酮含量与Chi显著负相关(－0.8989)；Fls与Chi显著负相关(－0.7498)。结果提示，苦荞芽期黄酮合成的分子机制较为复杂，但部分基因表达仍存在显著相关性联系，为进一步选择苦荞分子操作靶位点提供参考。

建阳橘柚兼具橘和柚的优良性状，为了解其携带的柑橘衰退病毒(CTV)分离株的分子特征及其传播到江西赣州对赣南脐橙产业的影响，将建阳橘柚(Citrus paradisi × C. reticulata)CTV分离株JY-5嫁接接种到赣南脐橙纽荷尔(C. sinensis)品种上，比较接种前后病毒外壳蛋白(cp)基因的HinfⅠRFLP和SSCP变化情况，实验结果表明， 建阳橘柚上CTV分离株RFLP组群由接种前的单一组群变为混合组群，SSCP谱带数增加，在建阳橘柚上受抑制的CTV分离株在纽荷尔脐橙上能得到较好地增殖；同时接种前后分离株cp，p23和k17基因片段序列同源性及聚类分析表明，在建阳橘柚上的CTV分离株JY-5与其嫁接接种在纽荷尔脐橙上的JY-5R分离株并未在系统进化树上聚类在一起，表明两者不具有紧密的亲缘关系，结合RFLP和SSCP分析结果推测，JY-5R可能是在建阳橘柚上受抑制的分离株在纽荷尔脐橙上恢复了增殖。研究结果提示，建阳橘柚上的CTV分离株一旦传到赣南脐橙上，对赣南脐橙产业会带来一定的威胁。

为了利用NCBI上大量的葡萄(Vitis vinifera L.) EST序列进行葡萄应答外源赤霉素基因的信息挖掘，通过本地化Blast、Blast2go等工具以及其他生物信息学工具和数据库，对NCBI上经过赤霉素(gibberellins, GA)诱导后的葡萄EST序列进行处理，获得了45条仅在赤霉素处理后表达的无冗余EST序列。Blastx注释结果显示，45条序列中有25条序列注释为假定蛋白或未知蛋白(约占55.6%)，14条序列无注释信息(约占31.1%)，6条序列(13.1%)注释有推定功能，其中包括整合酶蛋白(EE077049)、SPX结构域基因1(EE085000)、丝氨酸羧肽酶类44蛋白(EE091188)、CHY1(EE092187)、假尿苷合酶/转运蛋白(EE106096) 、钾离子通道蛋白(EE108944)。Blast2go分析显示，共有29条序列通过基因本体论(GO)注释180个GO号，分属于分子功能(molecular function)、细胞成分(cellular component)、生物过程(biological process)三大类的不同水平。初步推断，在外源赤霉素对葡萄进行处理后，应答基因主要具有结合活性(46.34%)和催化活性(39.02%)两方面的分子功能。其作用空间分布为整个细胞(44.68%)或者细胞器(40.43%)中，并且主要通过参与细胞生理过程(28.57%)和代谢过程(25.71%)等一系列复杂的生理生化反应完成整个应答过程。为进一步研究赤霉素处理后导致葡萄的基因表达情况提供了基本资料。

赭曲霉毒素A(ochratoxin A, OTA)是一种分布广泛的真菌毒素，会对谷物、动物饲料、动物性食品等造成污染。OTA对多种动物具有较强的肾毒性和肝毒性，并有致畸、致突变和致癌作用。对植物的研究表明，OTA还具有植物毒性。本实验研究了植物中重要的内源信号分子水杨酸(Salicylic acid, SA)在OTA对拟南芥(Arabidopsis thaliana)毒性中的作用。利用高效液相色谱测定了拟南芥叶片在OTA处理下SA含量的变化，结果显示，OTA胁迫促进了SA含量的上升；通过实时荧光定量PCR测定了OTA对SA途径中重要的病程相关蛋白1基因(pathogenesis-related gene 1, PR1)相对表达量的影响，结果显示，OTA能诱导PR1的表达，并且这种诱导作用与OTA胁迫时间有关；SA与OTA同时处理拟南芥叶片后，观察到SA能造成OTA引起的叶片坏死斑的加重，相对电导率和活性氧含量的测定结果表明，SA能加重OTA对叶片的伤害，促进OTA诱导的活性氧的上升。本研究表明，SA参与了OTA诱导的拟南芥毒性过程，SA和OTA共同处理能增强OTA的植物毒性。

靶基因的高丰度组织特异性表达是基因治疗和制备转基因动物的重要条件。运用Cre-LoxP系统是提高组织特异性启动子转录活性的有效途径之一。本研究利用Cre-LoxP系统，以肠道粘蛋白2启动子调控Cre重组酶表达，转染细胞后检测荧光素酶活性。结果显示，Cre-LoxP系统能使粘蛋白2启动子介导的靶基因在肠细胞SW480中的表达量提高约6倍。细胞特异性检验后发现，Cre-LoxP系统显著弱化了肠道粘蛋白2启动子的细胞特异性。研究结果提示，运用Cre-LoxP系统尽管可以大幅提高弱启动子的活性，但对启动子的特异性要求较高。

胸腺是哺乳动物的中枢免疫器官。为了解猕猴胎儿中枢免疫器官在自然流产时的免疫应答情况，采用猕猴(Macaca mulatta)自然流产胎儿为材料，通过HE染色和免疫组化染色对不同胎龄猕猴胎儿胸腺白细胞介素2和10(IL-2; IL-10)阳性细胞的分布及表达进行观测，研究其在自然流产过程中的表达情况。结果表明：猕猴胎儿胸腺各胎龄组小叶间分界清晰，小叶数量皮质髓质中淋巴细胞数量也逐月增加；2月胚龄髓质形成，开始出现弥散型胸腺小体，3月胚龄髓质中可见典型胸腺小体，胸腺组织结构趋于完善。胸腺IL-2和IL-10的表达在1月龄无阳性，此后阳性细胞的光密度值和阳性细胞面积率随着月龄的增加而增长；阳性细胞分布于皮质边缘、皮质与髓质交界处、髓质中心区，以及没有退化的胸腺小体和血管周围；IL-2在胸腺中的表达强烈且数量多，IL-10表达较少。研究结果提示两种细胞因子主要在胸腺细胞发育增长活跃区域表达，并以IL-2表达为主，IL-2和IL-10的分泌水平可作为预测孕妇早产的一个新的敏感指标。

为寻找与山羊(Capra hircus)产羔数密切相关的分子标记，加快山羊育种进程，研究转化生长因子β1基因(TGF-β1)遗传多态性与山羊产羔数的相关性，根据牛的TGF-β1基因序列设计3对引物, 采用 PCR-SSCP .和DNA测序技术检测山羊TGF-β1基因外显子2和内含子3的多态性, 同时用最小二乘法研究了其多态性与产羔数的关系。结果表明，在波尔山羊和陕南白山羊中，仅第二外显子148 bp位点碱基发生A→G 的突变，导致苏氨酸(Thr)变为丙氨酸 (Ala)；多态位点均以A为优势等位基因，基因频率分别为0.530和0.648。在波尔山羊的1~3胎产羔数中，AB型个体的产羔数显著高于BB和AA型个体(P<0.05)；在第四胎产羔数和平均产羔数中，AB 型个体的产羔数显著高于AA(P<0.05)，显著高于BB(P<0.05)；BB型个体的平均产羔数显著高于AA型(P<0.05)。在陕南白山羊中，AB型个体的2~4胎产羔数和平均产羔数显著高于 AA和BB型个体(P<0.05)；在第一胎中，AB型个体显著高于AA 型个体(P<0.05)。研究结果表明TGF-β1基因多态位点与产羔数显著相关，可以用于山羊分子遗传育种的候选基因。

胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors, IGFs)在鱼类的生长、发育过程中起重要作用。本研究克隆了荷那龙罗非鱼(Oreochromis hornorum)两种胰岛素样生长因子(IGF)基因，并采用半定量RT-PCR方法检测了两种基因在不同组织中的表达情况。以荷那龙罗非鱼肝脏总RNA为模板，RT-PCR结合3'RACE与5'RACE 法扩增IGF-Ⅰ与IGF-Ⅱ的cDNA。扩增片段插入pMD-T载体并测序。序列分析表明：IGF-Ⅰ总长1 305 bp；IGF-Ⅱ总长1 091 bp。其推测氨基酸序列都具有胰岛素样生长因子基因的典型特征结构，分别包括信号肽和B、C、A、D、E 5个区域，并具有6个保守的半胱氨酸，但它们之间推测氨基酸全序列的同源性较低，为26%。正常生理条件下，两种IGF在所有被检测组织中均有表达。IGF-Ⅰ在肝脏、肌肉和性腺中表达量较高，在肾脏中表达量最低；IGF-Ⅱ在肾、胃、肠、脾、垂体中表达量较高，在肌肉中表达量最低。在所有被检测组织中，IGF-Ⅱ的表达量均高于IGF-Ⅰ的表达量，但二者的表达量只有在肠、脾、胃、肾和垂体中具有显著性差异(P<0.05)。雌雄个体中除脾、胃、肾、垂体外，IGF-Ⅰ在雌性中的其它组织表达均低于雄性，其中雄性个体中肌肉组织IGF-Ⅰ的表达水平显著高于雌性个体(P<0.05)；IGF-Ⅱ在雌雄个体相同组织间的表达水平比较差

选择合适的内参基因是利用实时荧光定量PCR准确分析基因相对表达量的先决条件。基于现有对内参基因的研究，本研究挑选出10个基因作为小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp. tritici)的候选内参基因。经过PCR扩增效率筛选，8个基因符合要求可用于稳定度的筛选，这些基因包括泛素连接酶(UBC)、泛素连接酶E2(UBCE2)、核糖体蛋白S5(RPS5)、α微管蛋白(TUBA)、β肌动蛋白(ACTB)、β微管蛋白(TUBB)、延伸因子1(EF1)和延伸因子3(EF3)。本研究以两种小麦条锈菌(CYR32和Pst78)的夏孢子、萌发芽管分别接种两个小麦(Triticum aestivam)品种(CYR32/XZ9104和Pst78/AvS)后0.5、3和14 d的样品为材料，利用实时荧光定量PCR技术，检测了这8个持家基因在不同发育阶段的小麦条锈菌中的表达情况。经geNorm软件分析发现，3个持家基因在样品中的表达趋势与小麦条锈菌的侵染过程相符合。 ACTB、TUBB和TUBA的组合可作为检测小麦条锈菌基因表达的内参基因。

从大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)的胞外分泌物中分离到一种蛋白激发子PevD1(UniProtKB accession No. P86840)。为了明确该蛋白激发子的特性以及诱导植物抗病的机制，本研究在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达了重组蛋白6His-PevD1。该重组蛋白激发子可以引起烟草(Nicotiana tabacum cv. Samsun-NN)悬浮细胞死亡，提高烟草植株对烟草花叶病毒(TMV)的系统获得抗性(SAR)，枯斑抑制率最高可达46.64%。重组蛋白激发子处理后的烟草叶片中的苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)和过氧化物酶(POD)活性均有大幅度提高。处理后144 h PAL活性最大，是对照的3.3倍；处理后120 h，PPO和POD活性分别增加236.8%和204.6%。PevD1可以诱导抗性相关基因酸性病程相关基因1(acid pathogenesis-related gene 1, PR1-a)、碱性病程相关基因1(basic pathogenesis-related gene 1, PR1-b)、病程相关基因非表达子1(nonexpressor of pathogenesis-related gene 1, NPR1)和苯丙氨酸解氨酶基因(phenylalanine ammonia lyase gene, PAL)的表达。研究表明，防御相关酶的活性提高和抗病相关基因的诱导表达是PevD1诱导烟草产生系统性抗性的主要机制。

抗菌肽(antibacterial peptides)是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的多肽，是天然免疫的重要组成部分。为了提高抗菌肽的表达量以及很方便地检测抗菌肽的表达情况，本研究利用口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV) 2A将荧光蛋白dTomato基因和3个串联的MagaininⅡ基因融合到一个开放阅读框中(open reading frame, ORF)，融合的基因被置于pPIC9K载体醇氧化酶基因(AOX1)启动子的下游，构建分泌型重组酵母表达载体pPIC9K-dTomato -2A-3M，将线性化的重组酵母表达载体通过电击法转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中，经G418筛选和PCR鉴定得到阳性转化子，然后将其转至摇瓶，在30℃、0.5%甲醇的条件下进行诱导表达，连续诱导3 d。SDS-PAGE电泳图谱显示，在31 kD(dTomato)和9.5 kD(3M)处有蛋白条带出现，在荧光显微镜下观察酵母表达上清发出红色荧光，对大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)抑菌试验结果表明，重组抗菌肽串联的MagaininⅡ具有明显的抑菌效果。结果表明，由2A连接的融合基因(荧光蛋白dTomato和串联的MagaininⅡ)在毕赤酵母中成功的进行了表达，FMDV 2A在其C端剪切多聚蛋白，得到dTomato和串联的MagaininⅡ两个独立而有活性的蛋白，为小分子抗菌肽的表达提供一个高效的检测方法。