为了获得番鸭(Cairina moschata)源小鹅瘟病毒(Goose parvovirus, GPV)结构蛋白VP基因的相关信息，根据国内外已发表鹅源GPV与番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus, MDPV)全基因序列，应用DNAStar分子生物学软件设计一对引物，应用高保真PCR技术扩增番鸭源小鹅瘟病毒PT株(GPV PT株)VP全基因序列。将扩增得到的VP全基因克隆到pMD18-T载体上，获得的重组质粒经PCR鉴定后进行序列测定。结果表明，PT株VP全基因大小为2 199 bp，编码732个氨基酸(GenBank登录号：JF926695)，与番鸭源小鹅瘟病毒GPV DY株核苷酸及其推导氨基酸同源性分别为98.8%和98.8%，高于鹅源GPV与MDPV参考毒株。在国内外首次发现番鸭源GPV VP基因VP1独特区具有MDPV核苷酸序列特征，而VP2基因具有鹅源GPV核苷酸序列特征。本研究从番鸭源GPV PT株成功克隆到结构蛋白全基因序列，为深入研究番鸭源GPV的起源及水禽细小病毒遗传衍化提供参考。

OsbHLH1基因编码bHLH(basic helix-loop-helix，碱性螺旋-环-螺旋)类转录因子，与水稻耐低温相关。草铵膦是一种高效低毒灭生性除草剂，Bar基因表达产物能解除草铵膦的毒性。本实验对通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)浸染法获得的以粳型水稻(Oryza sativa L. subsp. japonica Kato) 恢复系淮C17为受体的转OsbHLH1和Bar基因水稻进行研究，鉴定其除草剂抗性和耐低温能力，考查其农艺性状。草铵膦筛选发现Bar基因正常表达；对草铵膦筛选获得的转基因植株进行PCR、Southern、RT-PCR和实时荧光定量PCR检测，发现OsbHLH1基因已经整合到水稻基因组中并且在水稻中表达。转基因T3代株系芽期(萌发芽长0.5 mm)在2℃条件下处理6 d，第6号转基因株系死苗率为17.8%，对照死苗率为61.1%。Ｔ3代苗期(一叶一心)在8~10℃下处理７ｄ，第5、6、9、11号株系的根长显著长于对照，第3、5、11号株系的根数显著多于对照，第3号株系的平均鲜重显著重于对照。芽期、苗期耐冷性试验表明，OsbHLH1基因在水稻中过量表达显著提高了水稻芽期、苗期的耐低温能力。对转基因T2代的农艺性状进行考查，株高、千粒重、结实率、理论产量等农艺性状与对照相比较均出现了显著的变化，外源基因的导入对水稻的农艺性状有明显影响。研究结果将为选育抗除草剂、耐低温杂交粳稻新组合提供新种质。

中介体是一种大分子蛋白复合物，中介体亚基之间的相互作用是中介体复合物在真核生物的转录调控中发挥作用的基础。本研究利用同源搜索，克隆了烟草(Nicotiana tabacum)中介体亚基基因NtMed6、NtMed18和NtMed21，测序结果表明NtMed6、NtMed18和NtMed21与拟南芥(Arabidopsis thaliana)中介体同源基因的序列一致性分别为69.46%、76.91%和77.01%。通过筛选适宜的侵染培养基优化了农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达进行亚细胞定位方法，分析了linker序列对亚细胞定位结果的影响。发现以YEB+100 mmol/L AS和AA+100 mmol/L AS为侵染培养基时荧光强度大，并且表达荧光的细胞多；构建融合表达载体时添加5个氨基酸编码序列的linker提高了融合蛋白亚细胞定位结果的可靠性。烟草中介体亚基亚细胞定位表明，NtMed8、NtMed18、NtMed6和NtMed21定位在细胞核和细胞质内，但主要在细胞核里。为进一步证实NtMed8属于烟草中介体亚基，同时研究NtMed8与其它亚基的相互作用，构建了35S驱动的含有EYFP N-端1-173氨基酸和C-端151-238氨基酸编码序列标签的融合表达载体(pNYE和pCYE)。把NtMed8、NtMed18、NtMed6和NtMed21的全长ORF亚克隆到相应的载体上，共转化烟草(Nicotiana benthamiana)叶片，结果表明，NtMed8与NtMed18存在互作，同时还观察到NtMed8与NtMed6的互作以及NtMed18与NtMed6的互作。BiFC用于检测蛋白之间的互作是一种快捷有效的方法，能够应用于中介体亚基之间结构联系的研究。

为了开发具有药用价值的硫酸软骨素(chondroitin sulfate, CS)的新资源，从鲐鱼(Pneumatophorus japonicus Houttuyn)软骨蛋白聚糖(proteoglycan, PG)制备了糖胺聚糖(glycosaminoglycan, GAG)，用酶降解和阴离子交换HPLC法测定了GAG的CS的组成及其含量，用凝胶层析法测定了GAG的分子量，用表面等离子体谐振(surface plasmon resonance, SPR)法测定了其与多效生长因子(PTN)、中期因子(MK)和肝细胞生长因子(HGF)相互作用的动力学参数结合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)和平衡解离常数(KD)。结果显示，鲐鱼软骨GAG含量约为651 μg/mg PG或1.09 μmol/mg PG(按照二糖单位计算)，主要含CS (1.03 μmol/mg PG，按照二糖单位计算)，CS酶解产生的主要二糖单位是ΔDi-6S(38.8%)和ΔDi-4S(46.3%)，有少量的ΔDi-0S(8.4%)和ΔDi-diSD(6.5%)。GAG (CS)的分子量为78 kD。GAG(CS)与生长因子的相互作用的动力学参数ka((mol/L)-1·s-1)、 kd (s-1)和KD (nmol/L)分别为(2.77±0.17)×105、(7.74±1.56)×10-5和(0.28±0.06)(MK)，(1.05±0.22)×104、(4.16±0.80)×10-3和(417±131.3)(PTN)，(7.04±0.94)×105、(7.84±2.82)×10-3和(11.1±3.80)(HGF)。该GAG同MK、HGF和PTN有高的或较高的亲和性，暗示鲐鱼软骨GAG的CS 有可能通过调节生长因子的信号转导途径而对某些疾病发挥治疗作用，具有潜在进一步药用开发价值。

卵母细胞成熟和母源型-合子型过渡过程中，存在大量基因的表达差异，使得应用mRNA差异显示(DDRT-PCR)筛选对胚胎发育起关键作用的基因成为可能。为了解牛卵母细胞成熟过程及体外受精胚胎不同发育阶段相关基因mRNA表达规律，本研究以牛生发泡(GV)期卵母细胞、体外受精获得的8细胞期胚胎和囊胚期胚胎为检测对象，利用mRNA差异显示技术筛选这三个时期mRNA表达差异基因，并用实时定量PCR分析差异基因在这三个时期以及体外成熟卵母细胞中的mRNA丰度。结果成功筛选得到5个差异片段，经测序和GenBank数据库比对分析，检索到与这5个片段有高同源性的已知基因，分别为无机焦磷酸1基因(PPA1)、ErbB2 互作蛋白基因(ERBB2IP)、350 kD中心体相互作用蛋白基因(CEP350)、核糖体蛋白L27a基因(RPL27A)和Ⅱ类主要组织相容复合物下调因子基因(IK)，实时定量PCR检测和SPSS统计分析结果表明，PPA1、ERBB2IP和CEP350mRNA表达量随胚胎发育进程呈不同程度的降低趋势，RPL27AmRNA表达量在囊胚期由降低转为升高，IK的转录物含量在囊胚期前呈波动变化，到囊胚期显著降低。本研究结果为进一步了解卵母细胞成熟对后续胚胎发育的影响以及合子基因组激活机制提供了实验依据。

建立转基因成分灵敏、准确的定量标识是实施转基因安全阈值管理的一个基本步骤，其中实时定量PCR技术是检测产品中转基因含量的主要技术方法。本研究利用该技术确定了双价(cry1Ac+CpTi)转基因抗虫水稻(Oryza sativa)科丰6号中有3个拷贝的外源基因插入。通过对外源基因Bt和转化事件特异的边界特异序列为对象的绝对定量和相对定量检测方法的研究，发现以边界特异序列为对象的事件特异性检测和以目的基因Bt为对象的检测都能够满足相对定量检测的要求。在100 ng基因组DNA中，Bt基因和特异性检测的相对定量检测限分别为0.1%和0.5%，在绝对定量检测中，特异性检测的检测限为5个拷贝。不同检测方法对4个已知转基因含量的样品检测结果与预期均一致。结果表明，以转基因产品占总产品比例为定义的转基因含量的测定中，多拷贝或单拷贝基因为对象的不同定量方法的检测对转基因产品的相对定量结果没有影响，本研究对转基因产品的定量阈值设定具有一定的借鉴意义。

马铃薯晚疫病是由致病疫霉[Phytophthora infestans (Mont.) de Bary]引起的第一大作物病害，目前已严重限制了全球马铃薯的生产和发展。马铃薯晚疫病抗性分子机理的研究一直是抗病育种中的热点问题。本研究利用病毒诱导的基因沉默 (virus-induced gene silencing, VIGS)技术，在本氏烟草(Nicotina benthamiana)中沉默两个马铃薯晚疫病水平抗性相关的基因片段EL732276和EL732318。目的基因沉默后的烟草接种晚疫病菌P. infestans，根据病斑生长速率LGR(length grow rate)来了解这两个基因是否参与烟草对晚疫病的抗性反应。结果表明，目的基因片段EL732276和EL732318被成功地插入烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus, TRV)载体中。利用携带八氢番茄红素脱氢酶基因(phytoene desaturae, PDS)的TRV重组载体病毒接种烟草，感染病毒的烟草植株表现光漂白现象，说明VIGS体系有效。用携带目的片段的重组载体病毒TRV∶EL732276和TRV∶EL732318感染烟草植株，一个月后，烟草叶片接种晚疫病菌P. infestans，从接种P. infestans的烟草叶片上可以看出，感染TRV空载体的对照烟草叶片上病斑扩展速率非常缓慢，而目的片段EL732276和EL732318沉默后的烟草叶片可见明显的水浸状病斑和少量白色的晚疫病菌菌丝。进一步的分析表明TRV∶EL732276重组载体病毒侵染的烟草接种P. infestans后LGR值极显著上升，TRV:EL732318病毒侵染的烟草接种P. infestans后LGR值显著上升，表明EL732276和EL732318同源基因在烟草中沉默后，烟草对P. infestans的抗性显著降低。研究结果认为，病毒诱导的基因沉默技术可在本氏烟草中初步快速鉴定马铃薯抗病相关基因的功能。

抗草甘膦基因在转基因植物体内持续高效表达，不但增加植物代谢压力，有的甚至改变植物形态造成植物的生长发育畸形。为了减少转基因植株的代谢负担和能源浪费，从拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)基因组中克隆了Leafy组织特异性启动子替代CaMV35S启动子，用其驱动改造后加二磷酸核酮糖羧化酶(rubisco)小亚基引导肽的5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶(CP4EPSPS)基因，同时调控报告基因gus的编码区构建植物表达载体p3300-Leafy-gus和p3300-Leafy-CP4EPSPS，嵌合基因经农杆菌(Agrobacterium)介导转化烟草。稳定表达后经GUS组织染色分析表明，Leafy驱动的gus表达仅局限在植物茎尖和幼叶部分，转基因植株成熟的叶片、茎部和根系均未能检测到GUS活性。草甘膦试验分析表明，Leafy驱动的CP4EPSPS的转基因植株幼芽部位有草甘膦抗性。结果表明，Leafy启动子驱动CP4EPSPS表达增强植株芽端对草甘膦的抗性。

马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)是世界范围内广泛分布的检疫性线虫，严重危害多种作物。马铃薯腐烂茎线虫为适应不同的生活环境而发生相应的遗传变异，可以通过不同地理种群之间遗传结构的差异来研究环境生态因子对种群遗传结构的影响。利用简单重复序列区间(inter-simple sequence repeat, SSR)分子标记技术研究了我国马铃薯腐烂茎线虫5个群体的遗传多样性、遗传变异，分析了遗传多样性与生态因子的相关性。研究结果表明，马铃薯腐烂茎线虫具有较高的遗传多样性。在种群水平，安徽省太和县种群的遗传多样性最高，河北省昌黎县的遗传多样性最低；在群体水平，5个群体的遗传多样性大小分别为安徽＞山东＞江苏＞河北＞北京。5个群体间具有较小程度的遗传变异，遗传分化系数(Gst)为0.0725；不同种群间具有频繁的基因交流(Nm=6.3933)。相关分析表明马铃薯腐烂茎线虫的Shannon遗传多样性与海拔、经度、纬度、年降雨量等成正相关关系，与年均温、最高温、最低温等成负相关关系；马铃薯腐烂茎线虫的遗传距离与地理距离成正相关关系。研究结果认为马铃薯腐烂茎线虫对低温具有较强的适应性，适于在华北、东北等地生长发育，将加强北方地区马铃薯种苗和种薯的管理，对防止马铃薯腐烂茎线虫进一步扩散蔓延提供指导意义。

昆虫羧酸酯酶(carboxylesterases, CarEs)对有机磷、拟除虫菊酯、氨基甲酸酯等三大类化学杀虫剂的代谢解毒作用是昆虫代谢抗性产生的一种重要机制。为明确棉铃虫(Helicoverpa armigera)两个酯酶基因001f和001g在代谢抗性中的作用，本研究基于杆状病毒表达载体系统(BEVS)在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf9细胞系中成功表达了酯酶基因001f和001g，表达产物经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和α-乙酸萘酯染色，结果表明，两个酯酶的条带染色很深，染色条带主要分布在相对迁移率(Rm)值为0.27~0.36和 0.37~0.48之间的两个区域。进一步采用酶标仪测定了表达产物对α-乙酸萘酯(α-naphthyl acetate)和4-硝基苯基乙酸酯(para-nitrophyl acetate)的酶促代谢动力学特性，结果表明，两个酯酶对底物均有极强的亲和力和非常高效的催化效率，其对α-乙酸萘酯的亲和系数(Km值)分别为(3.9±0.6)和(3.3±0.4) μmol/L，速率常数(kcat/Km值)高达(95±9.3)和(26.5±1.9) μmol-1·s-1·L；相比较而言对于4-硝基苯基乙酸酯的kcat/Km值较低(分别为(4.47±0.33)和(12.8±0.10) μmol-1·s-1·L)。上述结果在生化水平上证实了两个酯酶均具有较强代谢作用，预示着这两个酯酶基因与棉铃虫的代谢抗性可能相关，并可能对有机磷、拟除虫菊酯等化学杀虫剂也具有一定代谢解毒作用。

翻译调节肿瘤蛋白(translationally controlled tumor protein, TCTP)是一个在物种间高度保守、广谱表达和多功能的蛋白质，具有调节细胞骨架的动态变化和调节细胞的生长与增殖的作用；能够激活干细胞标记基因Oct4和Nanog的转录；调节细胞凋亡、肿瘤逆转、细胞分化、炎症反应和保护细胞免受多种应激的损伤等。本文综述了TCTP的结构、表达调控、生物学功能等研究进展。

本研究意在提供一系列适于稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的基因敲除、过表达和荧光蛋白融合表达，并且操作简单、耗时短、稳定可靠的通用载体，为系统研究稻瘟病菌的基因功能提供便利。通过PCR、克隆、酶切、连接等分子生物学方法，克隆了2个在菌丝和附着胞阶段都强力表达的启动子(SOD1启动子和H3启动子)；构建了14种载体：3种稻瘟病菌基因敲除载体(pBS-SUR、pBS-BAR和pBS-NEO)、4种丝状真菌基因过表达载体(pKD5、pKD6、pKD61和pKD8)和7种丝状真菌荧光融合蛋白载体(pKD5-GFP、pKD5-RED、pKD6-GFP、pKD6-RED、pKD7-RED、pKD8-GFP和pKD8-RED)；并提供了这些载体在丝状真菌的基因敲除、基因过表达和荧光融合蛋白表达中的应用方法。使用构建的基因敲除载体通过原生质体及ATMT转化最多同时在稻瘟病菌中敲除了4个基因；用pKD5-RED、pKD6-GFP和pKD6-RED转化稻瘟病菌后，发现SOD1启动子和H3启动子控制下的绿色和红色荧光蛋白在稻瘟病菌中强力表达，Real-time PCR 结果证实SOD1 启动子指导下的eGFP mRNA表达量是β-tubulin的2.5倍，SOD1 启动子指导下的DsRED2 mRNA表达量是β-tubulin的5.4倍，而H3启动子指导下的DsRED2 mRNA表达量是β-tubulin的20.8倍；MoATG8-DsRED2的融合蛋白(使用pKD6-RED)可以正确定位MoATG8于小泡附近；SOD1启动子驱动的DsRED2(使用pKD6-RED)可以在稻瘟病菌的菌丝、孢子、附着胞等各个发育阶段表达。这些实验说明14种载体可以用于稻瘟病菌的基因敲除、基因过表达和荧光融合蛋白表达，也可用于镰刀菌等其他丝状真菌的基因功能研究。

卵特异性连接组蛋白(oocyte-specific linker histone H1, Hlfoo)是在哺乳动物卵母细胞与早期胚胎内特异表达的连接组蛋白，它在卵母细胞生长成熟、受精及胚胎发育中起关键性作用。本研究旨在克隆猪H1foo基因，并构建其真核表达载体。首先利用5'RACE和RT-PCR的方法获得猪H1foo基因的CDS区，并提交GenBank，登录号为HQ915640；然后将H1foo基因的CDS区连接到载体pMD19-T上，经酶切后定向克隆到表达载体pVenus上，从而构建pVenus-H1foo真核表达载体；用脂质体2000介导重组质粒pVenus-H1foo转染Hela细胞，荧光显微镜下观察、RT-PCR检测，确定重组质粒在Hela细胞内的表达和定位；最后通过体外转录试剂盒将H1foo-venus体外转录为mRNA，并显微注射至猪卵母细胞，荧光显微镜观察其表达和定位。序列分析表明猪Hlfoo基因CDS区全长1 041 bp，编码346个氨基酸，蛋白分子量为36.45 kD，在核苷酸水平上与牛、人和小鼠H1foo基因的相似度分别为75.7%、67.9%和54.3%；真核表达载体pVenus-H1foo转染后，能在Hela细胞中表达并可以准确的定位在细胞核；体外转录的H1foo-venus mRNA显微注射猪卵后其融合蛋白也能准确定位于细胞核。本研究克隆了猪H1foo基因并成功构建其真核表达载体；体外转录的H1foo-venus mRNA能在猪卵中正确表达和定位，为进一步研究H1foo在猪卵母细胞成熟以及核移植过程中的作用提供了基础资料。

为建立和优化猪肌肉组织蛋白质双向电泳技术，从提取方法、加样量、IPG 胶条的选择、SDS-PAGE胶浓度、染色方法等多个方面对双向电泳分离效果进行比较研究。结果显示，液氮研磨+超声破碎法提取猪肌肉组织蛋白效果优于液氮研磨法，前者细胞破碎彻底蛋白质溶解性好且核酸污染少，图谱质量较好；18 cm pH 4~7的IPG胶条分离效果比pH 3~10非线性IPG胶条好；对于银染，18 cm pH 4~7 的IPG胶条150 μg 上样量比较适宜；同一肌肉样品的三块胶的重复性可达70%以上；同时，对双向电泳过程中的典型问题作了详尽分析。研究结果表明，通过优化的双向电泳条件获得了较高分辨率和较好重复性的猪肌肉组织双向电泳图谱，可用于后续蛋白质组学分析。