拟南芥(Arabidopsis thaliana)WRKY72转录因子属于Ⅱb亚组成员。为探明WRKY72基因的特性及其在非生物胁迫中的作用,本研究采用多种细胞分子生物学方法进行研究。亚细胞定位发现WRKY72转录因子定位在细胞核中。qRT-PCR检测WRKY72对多种逆境与激素处理的响应,结果表明在热害、盐害、脱落酸、低氮、葡萄糖等非生物胁迫处理3 h后,WRKY72的转录水平显著受到抑制。酵母体内转录活性分析以及双荧光素酶报告系统分析显示WRKY72是一个转录抑制子。酵母双杂交(yeast two-hybrid, Y2H)和双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation, BiFC)发现,WRKY72不仅能与近源的WRKY9、WRKY36、WRKY47、WRKY61、WRKY72转录因子发生互作,还能与自身发生互作。利用该基因T-DNA插入突变体进行表型分析,结果显示,wrky72突变体在百草枯(methyl viologen, MV)和低氮(low nitrogen, LN)处理下主根延伸长度显著变短,说明WRKY72对MV和LN敏感,提示WRKY72参与调控活性氧耐受和氮营养吸收或利用过程。综上所述,WRKY72可能与自身及一些近源WRKY转录因子互作,以多聚体的形式发挥其转录抑制子的功能,并参与特定的非生物胁迫相关的信号转导过程。本研究为深入解析WRKY72转录因子的抗逆功能与分子调控机制提供了资料基础。

狂犬病病毒(Rabies virus, RV) G蛋白是唯一能激发机体产生细胞免疫,并诱导产生中和抗体的结构蛋白,也是狂犬病病毒中唯一糖基化的结构蛋白,此外还介导细胞融合、受体结合以及参与病毒的致病等。本研究将优化的狂犬病G基因(GenBank登录号: ABI53869.1)序列插入到中间载体pMP3上,成功构建中间载体pMP3-G,然后将中间载体pMP3-G和植物载体pCAMBIA1300通过双酶切、连接,成功地构建了植物表达载体pCAMBIA1300-G。挑选空白未转基因水稻(Oryza sativa)种子TP309消毒,在愈伤诱导培养基上31 ℃光照3 d,使其长出愈伤组织,用已经转入狂犬病G基因的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105去侵染愈伤组织,并与愈伤组织共培养3 d,将狂犬病G基因导入水稻愈伤组织中。愈伤组织再经过潮霉素抗性筛选、分化、出芽、生根,获得313株植株,取313株植株的叶片通过十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyl trimethyl ammonium bromide, CTAB)法提取叶片基因组DNA,对其进行PCR扩增,经核酸胶进行初步鉴定,有79株为阳性,经过炼苗、种植共获得50株阳性表达植株。分别随机挑选50株阳性植株的种子,切半,标记,将不含胚乳的一半研磨,用提取液提取蛋白后通过抗原检测试纸条和Western blot检测,结果表明,G蛋白在转基因水稻种子中成功表达,且具有良好的反应原性。从50株阳性表达植株中挑选出高表达、反应原性最好的4个株系,将这4个株系T₁代中与检测阳性结果相对应的含有胚乳的另一半种子进行组织培养种植,在植株移栽大田前后,再次用CTAB法提取T₁代植株叶片基因组DNA,并以水稻的内源基因水稻淀粉分支酶基因(rice starch branching enzyme, RBE4)为内参基因,通过相对荧光定量PCR(relative fluorescence quantitative PCR)方法筛选阳性植株中的纯合植株,通过绝对荧光定量PCR(absolute real-time PCR)计算纯合植株的拷贝数,结果显示,132株植株中35株为纯合植株。纯合植株的拷贝数分别为1、2、3、5、7、11、16。本研究为今后制备新型狂犬病亚单位疫苗奠定基础。

落粒性是与水稻(Oryza sativa)生产密切相关的重要农艺性状之一,落粒性过强既不利于稻谷收获,也不适于水稻的机械化生产。落粒性基因qSH1 (QTL of seed shattering in chromosome 1; LOC_Os01g62920)是控制水稻落粒性的主效基因之一,其在小穗离层区域(abscission zone, AZ)的表达促进了离层结构形成,最终导致落粒性形成。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑系统,在qSH1的编码区起始密码子附近及位于其开放阅读框12 kb处5'端调控区的一个关键SNP位点设计5个靶位点,构建3个不同的CRISPR/Cas9植物表达载体,转化受qSH1基因主效调控的易落粒大穗型籼稻(Oryza sativa ssp. indica)品种HR1128。经PCR检测鉴定,获得了31株T₀代转基因阳性植株。对其靶位点PCR扩增及测序分析发现,3个不同的表达载体的突变效率分别为85.71%、76.92%、63.64%。选择10个T₀代突变植株深入分析靶位点突变特征,发现靶位点的突变类型包括了碱基缺失、碱基插入及碱基替换等类型,突变基因型包括了纯合突变、杂合突变、双等位突变及嵌合突变4种模式。进一步预测并分析了编码区和调控区靶位点突变所引起的效应发现,编码区靶位点突变引发移码突变,从而导致氨基酸翻译的提前终止;而调控区靶位点突变可能影响ABI3 (abscisic acid insensitive3)型转录因子的结合,使得qSH1基因的转录表达异常。本研究成功实现了对水稻qSH1基因及其调控区的定点编辑,获得了一系列不同类型的T₀代突变植株,并对其突变特征进行了统计分析,为进一步分析、挖掘qSH1基因新功能及关键调控位点、培育落粒性适中的水稻新品种提供了理论依据和材料基础。

E3泛素连接酶作为泛素化途径中的重要调控者参与细胞内多种生物学过程。为了挖掘水稻(Oryza sativa)抗病毒分子中的重要基因,本研究基于前期的研究成果,通过反转录PCR方法(reverse transcription PCR, RT-PCR)克隆得到水稻E3泛素连接酶—泛素融合蛋白(ubiquitin fusion protein, UF)基因的cDNA序列(GenBank No. XM_015757177.2)。基序(motif)分析结果显示,OsUF中含有7个保守的motif,其中包含了5个泛素相关motif (Ubiquitin, Rad60-SLD, Ubiquitin-2, Rad60-SLD-2和DUF2407)和2个非泛素化相关motif (Ribosomal_L4F01020和zf-C4pol);利用Gateway同源重组体系将OsUF cDNA全长重组到融合表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的表达载体pEarleyGate103上,然后通过农杆菌介导(Agrobacterium-mediated)的烟草(Nicotiana benthamiana)瞬时表达系统,在本氏烟叶片中瞬时表达OsUF蛋白。亚细胞定位和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染核结果显示,OsUF蛋白定位在细胞核。Western blot结果显示,OsUF与GFP蛋白融合并正确表达。本研究为深入分析OsUF可能参与的生物学过程以及解析水稻抗病毒机理提供了理论资料。

DREB (dehydration responsive element binding)是植物应答干旱、高盐、高温和低温等非生物逆境的一类重要的转录因子,该基因在不同作物间存在抗逆复杂性和局限性。本研究以普通小麦(Triticum aestivum)及其野生近缘种的二倍体和四倍体为材料,克隆TaDREB1基因(GenBank No. DQ195070.1),发现在六倍体小麦中有3种TaDREB1的DNA序列,分别对应于A、B和D基因组,命名为TaDREB1-a/b/d。根据TaDREB1-b在不同材料间的多态性位点开发功能标记,利用加倍单倍体(doubled haploid, DH)和重组自交系(recombinant inbred lines, RIL)群体将TaDREB1-b定位在染色体3B上,与两侧标记P2449-185和WMC231、Xfbb117和Xgwm566的距离为19.2和16.0 cM、3.4和6.4 cM;同时以小麦品种旱选10号为材料,分别设计TaDREB1-a/b/d的特异引物,通过qRT-PCR分析其在4种胁迫下的表达模式发现,TaDREB1-a/b/d在小麦根、叶中的表达时间和峰值均存在差异。其中,在PEG、NaCl和ABA胁迫处理下,叶片中的TaDREB1-a/b表现为上调表达,TaDREB1-d则为下调表达;低温胁迫下,叶片中的TaDREB1-a/b/d均为上调表达。在4种处理模式下,小麦幼根中的TaDREB1-a/b/d都为上调表达。本研究开发的TaDREB1-b功能标记为分子标记辅助选择育种提供了支持,同时从基因组水平上初步阐释了TaDREB1-a/b/d对非生物胁迫的应答模式,为深入探讨小麦抗逆分子机制提供了基础资料。

雷公藤(Tripterygium wilfordii)作为重要的药用植物,具有抗癌、抗炎和免疫调节等作用,并具有较强的杀虫活性。雷公藤红素(celastrol)是雷公藤最具代表性的三萜物质,药理活性高且作用广泛,极具开发价值。环氧角鲨烯环化酶(oxidosqualene cyclase, OSC)被认为是三萜类次生代谢途径中的关键限速酶,是三萜合成生物学研究的重要元件之一。根据前期对雷公藤根转录组数据的分析设计引物,克隆得到4个雷公藤OSC基因：TwOSC1 (GenBank No. MH412928)、TwOSC2 (GenBank No. MH412929)、TwOSC3 (GenBank No. MH412930)和TwOSC4 (GenBank No. MH412931)。TwOSC1~3的ORF均为2 289 bp,编码762个氨基酸;TwOSC4的ORF为2 280 bp,编码759个氨基酸。生物信息学分析表明,4个TwOSC蛋白序列相似性较高,多重序列两两比对相似性在53%~77%之间。分子进化树分析表明,TwOSC1与多个物种的β-香树素合成酶聚为一个分支,TwOSC2、TwOSC4与环阿屯醇合成酶聚为一个分支,TwOSC3与羽扇豆醇合成酶聚为一个分支。以qRT-PCR方法检测上述基因在雷公藤不同组织部位的表达模式,结果显示,TwOSC1基因只在根中表达,TwOSC2、TwOSC3和TwOSC4在不同组织中均有表达。进而以茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)诱导处理雷公藤发状根,可不同程度地增加TwOSC1、TwOSC2、TwOSC4基因表达,同时抑制TwOSC3基因表达。以高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography,HPLC)检测雷公藤发状根中红素的含量变化,经MeJA诱导处理后红素含量有不同程度增加,且MeJA诱导后TwOSC1基因表达量的变化趋势与红素含量的变化趋势一致,推测TwOSC1可能与雷公藤红素的合成有关。本研究为雷公藤三萜活性物质的合成与积累提供了基础资料。

当前干腐病的大面积爆发已对山核桃(Carya cathayensis)产业可持续发展构成了严重威胁,为探究山核桃树体pH值、养分与细菌多样性对山核桃干腐病的影响,本研究采用16S rRNA基因高通量测序,比较了健康山核桃树、发病山核桃树的发病与未发病部位树皮、木质部在山核桃干腐病发病期的pH值、养分及细菌多样性差异,并分析了其相关性。结果表明：健康山核桃树皮与木质部pH值分别为7.03和7.63,均呈中性且显著高于呈酸性的发病山核桃树(P<0.05)。健康山核桃树皮单宁、可溶性糖含量分别为0.317%和3.348%,木质部分别为0.079%和0.626%,均显著高于发病山核桃树(P<0.05)。健康山核桃树皮、木质部还原糖含量分别为0.865%和0.420%,均显著低于发病山核桃树(P<0.05)。健康山核桃树皮细菌操作分类单元(operational taxonomic units, OTU)数目显著高于发病山核桃树,木质部细菌OTU数目显著低于发病山核桃树。健康山核桃树及发病山核桃树发病与未发病部位树皮分别有7、8和8个,木质部分别有8、4和8个主要细菌菌属,且健康与发病山核桃树皮和木质部主要菌群在种类和多度上均存在显著差异(P<0.05)。健康山核桃树皮优势菌属为蛭弧菌属(Bdellovibrio)、酸胞菌属(Acidocella)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas),多度分别为0.13%、0.01%和15.32%,木质部优势菌属为Massilia、鞘氨醇单胞菌属,多度分别为1.2%与4.41%,均显著高于发病山核桃树(P<0.05)。发病山核桃树发病与未发病部位树皮中,优势菌属均为粘细菌属(Byssovorax)与甲基杆菌属(Methylobacterium),发病部位这两个属的多度分别为7.56%与6.46%,显著高于未发病部位,且发病山核桃树两个部位树皮此两个属的多度均显著高于健康山核桃树(P<0.05)。在发病山核桃树发病与未发病部位木质部中,甲基杆菌属、Luedemannella、粘细菌属为优势菌属,多度分别为2.36%、0.35%、2.35%和1.76%、1.81%、0.55%,均显著高于健康山核桃树(P<0.05)。健康山核桃树皮与木质部的Ace、Chao、Shannon和Simpson指数分别为599、603、6.59、0.98和440、454、6.35、0.95,均显著高于发病山核桃树(P<0.05)。冗余分析(redundancy analysis, RDA)与蒙特卡罗检验表明,pH值、可溶性糖、还原糖均对山核桃树皮与木质部细菌优势属有显著影响(P<0.05)。研究结果可为山核桃林可持续健康经营提供借鉴。

AP2/ERF (APETALA2/ethylene-responsive factor)家族是植物中特有的转录因子家族,其中干旱响应元件结合蛋白(dehydration-responsive element binding protein, DREB)亚家族成员参与调节干旱、高盐、高温和低温等非生物胁迫。为明确珠美海棠(Malus zumi)中DREB基因表达状况,本研究利用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术,从珠美海棠中分离克隆得到1个新基因,命名为MzDREB2A (GenBank No. MH992511)。该基因开放阅读框为1 197 bp,无内含子结构,编码398个氨基酸,蛋白质分子量为43.9 kD,等电点为4.93,具有1个AP2结构域。生物信息学分析显示,该基因编码蛋白质为亲水性蛋白,无跨膜区域,具有α-螺旋(7.54%)、β-折叠(4.52%)和无规卷曲(87.94%),具有核定位序列。同源性和系统进化分析结果表明,MzDREB2A与塞威氏苹果(Malus sieversii)的亲缘关系最近,同源性为99%。qRT-PCR检测结果显示,该基因在根器官中表达量最高,其次为叶片,茎中表达量最低;在NaCl和PEG-6000诱导下,MzDREB2A表达量均明显升高;当NaCl浓度为150 mmol/L时,MzDREB2A表达量趋于饱和;当PEG-6000含量为20%时,MzDREB2A表达量达到最大值。本研究成功克隆了珠美海棠AP2/ERF家族MzDREB2A基因,为深入探究MzDREB2A基因功能及珠美海棠抗逆分子机理提供了参考依据。

类胡萝卜素羟化酶(Carotenoid hydroxylase)是类胡萝卜素代谢途径中的关键酶,可催化多种类胡萝卜素的合成。类胡萝卜素羟化酶包括亚铁血红素依赖型β-胡萝卜素羟化酶(β-carotenoid hydroxylase, CHYB)和细胞色素P450家族类胡萝卜素羟化酶(CYP97)。为探究chyb基因家族和cyp97基因家族在绿色杜氏藻(Dunaliella viridis)中的生物信息学特征及在不同胁迫条件下基因的表达情况,本研究通过绿色杜氏藻转录组数据,获得chyb1、chyb2和cyp97c基因cDNA序列,对其进行生物信息学分析,并通过荧光定量PCR探究其在不同非生物胁迫下的基因表达水平。生物信息学结果表明,这3条基因编码的蛋白质均为亲水性蛋白,其中CHYB1蛋白和CHYB2蛋白各有4个跨膜结构,CYP97C蛋白无跨膜结构。氨基酸多重序列比对结果显示,CHYB1和CHYB2各含有2种保守的组氨酸残基HXXXXH和HXXHH,CYP97C蛋白含有1个血红素位点FXXGXRXCXG和1个谷氨酸(E)和精氨酸(R)完全保守的螺旋K区保守位点EXXR。系统进化树分析显示,绿色杜氏藻cyp97c属于cyp97基因家族,莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)与绿色杜氏藻的亲缘关系最近。qRT-PCR结果表明,在强光胁迫下绿色杜氏藻chyb1、chyb2和cyp97c基因的表达量均有极显著上升(P<0.01),且藻体内叶黄素和玉米黄素含量显著提高,活性氧水平明显上升,表明类胡萝卜素羟化酶基因家族参与高光胁迫并受到活性氧调控进而保护藻体免受氧胁迫的伤害;此外,高盐、低温及甲基茉莉酸(methyl jasmonate, MeJA)、乙酰水杨酸(acetylsalicylic acid, ASA)、花生四烯酸(arachidonic acid, AA)、硫酸铈铵(ammonium cerous sulfate, ACS)等植物生长调节物质处理均不能同时诱导这两个家族基因,表明不同家族基因对胁迫应答具有不同的偏好性。本研究初步揭示绿色杜氏藻类胡萝卜素代谢调控机理,将为提高叶黄素和玉米黄素含量提供优良的基因资源,同时为植物抗逆提供新思路。

哺乳动物的研究表明,乙酰辅酶A羧化酶A(acetyl­CoA carboxylases alpha, ACACA)与脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FASN)是脂肪酸从头合成的关键限速酶,对脂肪酸的生物合成有着重要的作用,其表达受到多种激素的调控。本研究旨在探讨蛋鸡脂肪代谢相关基因ACACA与FASN基因的表达规律以及雌激素、油脂摄入对其表达量的影响。利用qRT-PCR分析ACACA与FASN基因在蛋鸡不同组织以及不同发育时期肝脏中的表达规律,分别从个体和细胞水平研究不同雌激素和大豆油水平对蛋鸡ACACA与FASN基因表达量的影响。结果表明,ACACA与FASN基因在心、肝、脾、肺、肾、胸肌、十二指肠、腹脂、胰腺、卵巢中均有表达,且在肝脏组织中表达量最高;ACACA与FASN基因在产蛋高峰期鸡肝脏中的表达量极显著高于产蛋前期(P≤0.01);0.5、1.0、2.0 mg/kg的17β-雌二醇处理鸡肝脏组织和25,50,100 nmol/L的17β-雌二醇处理蛋鸡胚肝脏原代细胞后,ACACA与FASN基因的表达量呈现升高趋势,且差异具有显著性(P≤0.05)或极显著性(P≤0.01);饲喂8%大豆油饲粮组蛋鸡肝脏ACACA与FASN基因的表达水平分别显著(P≤0.05)与极显著(P≤0.01)高于对照组,4%大豆油饲粮组与对照组间无明显差异(P>0.05)。综上所述,鸡ACACA与FASN基因参与脂质代谢过程,其表达受雌激素调控,且饲粮中添加8%水平的大豆油可显著提高鸡ACACA与FASN基因的表达量。本研究为进一步解析ACACA与FASN基因对鸡脂质代谢的调控机制提供了科学依据。

腺苷琥珀酸裂解酶(adenylosuccinate lyase, ADSL)属于天冬氨酸酶/延胡索酸酶超级家族成员,在嘌呤核苷酸起始合成和嘌呤核苷酸循环中发挥重要作用,同时对改善肌肉风味具有重要意义。为研究溆浦鹅(Anser cygnoides)ADSL在不同组织中的表达规律,本研究以溆浦鹅为实验对象,利用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术对溆浦鹅ADSL基因序列进行克隆,并对其核酸序列及蛋白进行生物信息学分析,同时利用qRT-PCR技术检测ADSL基因在80日龄溆浦鹅不同组织中的表达量。结果显示,克隆获得的溆浦鹅ADSL基因序列(GenBank No. MK161097)全长为1 496 bp,其中5'UTR为202 bp,3'UTR为31 bp,ORF为1 263 bp,编码420个氨基酸,无信号肽位点,属于非分泌蛋白;亚细胞定位预测结果显示,该基因主要存在于细胞质中,为不稳定亲水性蛋白;同源性分析显示,溆浦鹅ADSL基因与浙东白鹅、绿头鸭(Anas platyrhynchos)、原鸡(Gallus gallus)、野鸽(Columba livia)的同源性分别为99.68%、88.33%、85.64%、82.24%,以该基因构建系统发育树,发现溆浦鹅与浙东白鹅的亲缘关系最近,其次是绿头鸭和原鸡,与哺乳动物的亲缘关系较远;ADSL基因在各组织中的表达结果显示,该基因在各组织中均有表达,表达量由高至低依次为胸肌、腿肌、肝脏、皮脂、腹脂,其中胸肌表达量显著高于皮脂、腹脂(P<0.05)。本研究结果为进一步研究溆浦鹅ADSL基因在鹅肉品质中的作用机制提供了参考资料。

Agouti基因编码刺鼠信号蛋白(agouti-signaling protein, ASIP),发挥黑素皮质素1受体(melanocortin 1-receptor, MC1R)拮抗剂作用,抑制黑色素沉积形成棕褐色斑纹的被毛特征。水貂(Neovison vison)作为重要的毛皮用经济动物,具有丰富的皮毛色泽特征,但Agouti基因在调控水貂毛皮颜色中的作用不甚明确。本研究旨在获得水貂Agouti基因序列并分析其结构特征,探讨其中601 bp序列插入突变的分布,以及该突变与Agouti基因表达的关系。以黑、白、咖啡等3种毛色水貂基因组DNA以及黑、咖啡等2种毛色水貂皮肤组织RNA为实验材料,通过PCR克隆测序获得水貂Agouti基因序列,利用生物信息学方法分析其变异并预测mRNA剪接体类型;对于PCR克隆测序比对发现的601 bp插入突变,分别进行群体分析和荧光素酶启动子活性检测;对于转录组数据进行Blast比对,分析Agouti基因序列的转录信息。经克隆测序获得水貂Agouti基因25 478 bp序列,提交NCBI数据库(GeneBank No. KP981640.1);经预测得到7种剪接体,包括60个SNP和601 bp的短散在重复序列元件(short interspersed nuclear element, SINE)转座元件插入突变。群体遗传分析表明,黑貂601 bp野生基因型构成显著高于白貂和咖啡貂(P<0.05);荧光素酶活性分析显示,包含601 bp SINE与插入位点上下游的1 605 bp正向片段,其启动子活性极显著高于反向片段和野生片段(P<0.01)。包含SINE的973 bp转录本,与Agouti基因内含子3区域序列具有100%的覆盖度和相似度,但没有发现Agouti基因的mRNA转录信息。上述结果提示,Agouti基因内含子3中601 bp的SINE插入,形成具有启动子活性的序列并且转录表达,可能因此沉默了水貂Agouti基因转录,因而水貂全身被毛一致的毛色特征可能与Agouti基因表达无关,即在水貂皮毛颜色形成中Agouti基因可能没有参与作用。本研究为基因组中转座元件的表达调控与基因功能关系研究提供了数据支持。

波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)是家兔(Oryctolagus cuniculus)呼吸道传染病的主要病原。本研究以新西兰实验兔为研究对象,以波氏杆菌作为致病原,冷应激为应激原,旨在明确冷应激对兔波氏杆菌感染传播的影响。90只健康的波氏杆菌阴性实验兔随机分为5组,Bb/RT组与PBS/RT组在常温(room temperature, RT)(20±2 ℃)同室分笼饲养,Bb/cold组与PBS/cold组在6±2 ℃同室分笼饲养,control/RT组常温隔离饲养。Bb/RT组与Bb/cold组的每只兔鼻腔滴注0.5 mL 4×10⁹ CFU/mL波氏杆菌菌液(CFU: 菌落形成单位(colony forming unit));其余各组的兔鼻腔滴注0.5 mL PBS。在冷暴露开始后的第7 h、12 h、24 h、3 d、7 d、12 d 6个时间采样,采用TaqMan荧光定量PCR检测兔鼻腔、气管、肺、肝脏、心脏细菌浓度,采用SYBR-Green逆转录PCR(reverse transcription, RT-PCR)检测细胞因子免疫应答水平变化。结果显示,波氏杆菌通过空气进行传播,7 h时PBS/RT组与PBS/cold组受试兔鼻腔内均检测到波氏杆菌。冷应激对在感染兔鼻腔内细菌增殖影响不显著：在各个采样时间点,Bb/RT组与Bb/cold组实验兔鼻腔内Bb浓度差异不显著,PBS/RT、PBS/cold两组差异也不显著。短期冷应激(3 d内),冷应激组气管内波氏杆菌感染繁殖速度快;冷暴露12 h时,Bb/RT组、Bb/cold组实验兔气管内Bb浓度显著高于PBS/RT组、PBS/cold组(P<0.01);1 d和3 d时,4组试组两两比较仅Bb/RT组与PBS/RT组兔气管内细菌浓度差异显著(P<0.05)。7 d后4组实验组兔气管内Bb浓度差异不显著。所有实验兔肺脏、肝脏、肾脏、心脏均未检测到波氏杆菌。在感染后的各检测时间点,感染兔的血液中IL-10表达均上调,但无明显趋势变化;干扰素基因(interferon-gamma, IFN-γ)和肿瘤抑制因子基因(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)表达上调,并在感染后3 d出现峰值。在同一时间点不同感染组IL-10、IFN-γ和TNF-α表达水平变化差别不显著。研究表明波氏杆菌通过空气进行有效传播感染,短期冷应激对感染兔气管内细菌感染繁殖有促进作用,鼻腔与气管为波氏杆菌感染主要入侵与定植器官,冷应激对波氏杆菌感染兔细胞因子表达并没有产生显著影响。本研究为波氏杆菌防控提供了技术依据。

木聚糖酶(xylanase)基因VmXyl1在苹果树腐烂病菌—黑腐皮壳菌(Valsa mali)致病过程中发挥重要作用。为了揭示VmXyl1在腐烂病菌与寄主互作过程中的作用机制,本研究构建了原核表达载体pET-32a-VmXyl1,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)进行诱导,在大肠杆菌(Escherichia coli)表达菌株Rosetta (DE3)中成功表达了VmXyl1融合蛋白;利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)检测融合蛋白的可溶性和纯化效果,免疫新西兰白兔(Oryctolagus cuniculus)制备多克隆抗体,并对其效价和特异性进行分析。结果显示,该蛋白主要以包涵体形式存在,且0.5 mmol/L IPTG、30 ℃诱导8 h融合蛋白高效表达;经Ni-NTA柱亲和层析纯化后,获得了预期大小的融合蛋白。酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)和Western blot分析表明,所制备抗体效价达1∶102 400,且抗体能特异性识别VmXyl1融合蛋白及发病苹果(Malus pumila)树皮组织中的木聚糖酶蛋白,说明所制备的抗体具有高效性和特异性。研究结果为深入探究腐烂病菌木聚糖酶的致病机理及其与寄主的互作机制提供了基础资料。

2017年9月福建漳州地区龙海市东园乡番茄(Solanum lycopersicum)种植区暴发病毒病害,导致严重减产,同时病区内烟粉虱(Bemisia tabaci)虫害发生严重。为明确该地区番茄病毒病突然成灾原因,本研究采用分子生物学方法对番茄病毒病原、病区内烟粉虱的生物型以及虫体带毒情况进行分子检测,并通过室内接毒实验对烟粉虱的传毒性和传毒能力进行测定。结果表明,漳州番茄病毒病原为番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV);该病区采集的烟粉虱为B生物型,B型烟粉虱具有极强的获毒和传毒能力;虫体对TYLCV病毒携带率为100%。本研究证实了外来入侵烟粉虱在TYLCV病毒传播中的重要媒介作用,揭示了福建省番茄种植区病毒暴发成灾的主要原因,这为将来该病毒的防治提供了依据和帮助。

肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis, SE)可长期定植于家禽的肠道与生殖道组织,造成禽蛋的直接污染和垂直传播,难于清除与预防,不仅影响产蛋量,还造成环境污染,危害人类健康。Ⅲ型分泌系统(type secretion system, T3SS)的效应蛋白在肠炎沙门菌与宿主细胞表面黏附时至关重要。为研究肠炎沙门菌T3SS1主要效应蛋白SipC (type secretion system-1 effector SipC, T3SS1-SipC)在感染中的作用,本研究利用λRed同源重组系统构建肠炎沙门菌MY1的sipC基因缺失株MY1ΔsipC,同时将sipC基因克隆至载体质粒pBR322,构建回补株MY1ΔsipC/psipC。比较分析了野生株MY1、缺失株MY1ΔsipC以及回补株MY1ΔsipC/psipC在生长特性、对人(Homo sapiens)结肠细胞(human colorectaladeno carcinoma cell line, Caco-2)、鸭(Anas platyrhynchos)卵泡颗粒细胞(duck granulosa cells, dGCs)的黏附和侵袭能力,以及雏鸭半数致死量的差异。结果显示,缺失sipC基因后,肠炎沙门菌生长特性不变;感染2 h后,对Caco-2黏附和侵袭数量分别下降44.9%和34.5%;对dGCs黏附和侵袭数量分别下降37.9%和30.4%;对雏鸭的致病性显著降低(P<0.05)。本研究初步证实sipC参与肠炎沙门菌的致病力,为进一步探索sipC在肠炎沙门菌黏附宿主的分子机制提供实验材料。

MicroRNA(miRNA)是生物体内产生的一类长度约为20~24个核苷酸的非编码小分子RNA,在植物生长发育,生物和非生物胁迫响应方面起重要作用。烟草(Nicotiana tabacum)作为固着生长植物,不能像动物一样通过移动获取生长发育所需能量及躲避不利环境因素影响。因此,需要自身特殊生理机制如：启动控制叶绿素相关的关键基因表达来促进生长发育、启动防御相关的关键基因表达来响应胁迫,许多miRNA(microRNA)就参与相关过程。近年的研究表明,植物诸多生物学过程都受到miRNA的调控,包括细胞维持和分化、生长发育、信号转导以及对环境因素胁迫的响应。植物miRNA表达量随环境因素变化而改变,miRNA通过调控其相应靶基因的表达,使植物在生理及形态上产生对环境的适应性。本文综述了近年来miRNA介导的烟草响应干旱、盐、营养、温度和病害等逆境胁迫以及在烟草生长发育等方面的研究进展,并对今后烟草miRNA的研究做出了展望。

Sec14p是最早在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中发现的具有转运磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol, PI)和磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine, PC)功能的一类磷脂酰肌醇转运蛋白(phosphatidylinositol transfer proteins, PITPs),广泛存在于真核生物中。植物Sec14-like磷脂酰肌醇转运蛋白与酵母Sec14p存在较高的序列同源性。近年来,随着分子生物学和脂质基因组学的发展,越来越多的植物PITPs被挖掘。该类蛋白的结构由最初的Sec14p结构域进化到与膜定位Nlj16结构域、囊泡运输相关GOLD (Golgi dynamics)结构域结合,致使该类蛋白在植物体内行使的功能分化导致多样性,包括渗透调节、细胞极性生长、根瘤发育、蛋白运输、植物免疫调节和病毒相互作用等。本文主要综述了目前发现的三类植物Sec14-like磷脂酰肌醇转运蛋白Sec14-only proteins, Sec14-nodulin proteins和Sec14-GOLD proteins在结构和功能上的区别与联系,探讨其生物学功能多样性。

红梨(Pyrus pyrifolia)果皮花青苷的合成积累是影响红梨果实着色的关键因素,其生物合成由各步酶促反应基因调控,筛选出稳定可靠的内参基因对于研究红梨果实着色关键基因及其调控机制具有重要意义。本研究旨在筛选红梨的不同品种(早白蜜, 中熟32, 云红梨1号),在不同生长发育时期(幼果期, 缓慢生长期, 快速生长期, 成熟期)和不同遮光处理(自然光照, 部分遮光及完全遮光)条件下均稳定表达的内参基因,以用于qRT-PCR分析。选取红梨果皮为实验材料,以梨树(Pyrus communis)中常见的6个管家基因—β-肌动蛋白基因(β-actin, ACT)、18S核糖体RNA基因(18S ribosomal RNA, 18S rRNA)、甘油醛三磷酸脱氢酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)、组蛋白基因(histone, His)、转录延伸因子基因(elongation factor 1α, EF-1α)及α微管蛋白基因(α-tubulin, TUB)作为候选内参基因,分别进行qRT-PCR扩增效率、内参基因稳定性参数及不同样品中相对表达量分析。以BIO-RAD CFX Manager v2.0软件对稳定性参数指标—循环阈值(cycle threshold, Ct)、平均表达系数(M)和变异系数(variation coefficient, CV)进行分析和综合对比,结果显示,不同候选内参基因的表达稳定性存在差异,其中EF-1α和His在红梨不同品种、不同生长发育时期及不同遮光处理条件下均稳定表达;对于不同样本中内参基因相对表达量的分析显示,EF-1α和His在不同样本中的表达量相对稳定。上述结果提示,EF-1α和His可作为红梨果皮组织qRT-PCR分析的内参基因,为后续开展红梨果实着色相关基因的表达分析提供了校正和标准化基因选择。

化肥过度使用导致比较严重的耕地退化问题,极大影响了作物的产量与品质。本研究筛选产酸性蛋白酶菌株,结合现代发酵技术,尝试开发一种新型氨基酸生物有机肥。首先利用透明水解圈法和福林酚法,从鱼粉水解液中筛选得到一株产酸性蛋白酶菌株Zju-c,对其进行形态学观察及26S rRNA分子鉴定,并对鱼粉菌解条件和培养基成分进行部分优化。经生理生化分析发现,该菌株可直接利用大多数糖及少部分醇,能水解酪素、淀粉、明胶以及酒石酸盐,生长速度较快,可耐受13% NaCl;通过BLAST比对,确定为毕赤酵母属Pichia galeiformis (GenBank No. JF781422.1)。最佳发酵培养基成分为300 g/L鱼粉、50 g/L葡萄糖、30 g/L大豆蛋白胨、30 g/L NaCl和0.9 mg/mL Mg²⁺。在30 ℃、起始pH 5、3%接种量以及180 r/min的优化发酵条件下振荡培养7 d,以游离氨基酸含量和酶活为发酵水平衡量指标,发酵液中氨基酸含量由最初的29.4±2.1 mg/mL提高至88.4±1.4 mg/mL,酶活由190.2±2.9 U/mL提高到400.1±3.8 U/mL。上述研究结果提示,该菌株在利用发酵鱼粉研制液体生物有机肥中具有较好的应用价值。