摘 要 细菌生物被膜(bacterial biofilm, BBF)可以提高细菌的紫外线抗逆性，调控细菌对环境胁迫的适应能力。本研究以课题组前期比较基因组工作中筛选出的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)XL6-(GenBank No. CP013000.1)的调控生物被膜形成的候选基因00940为基础，分析其基因功能，并构建基因敲除突变株。通过生物信息学分析发现00940基因可能编码谷氨酰胺合成酶，并受到转录因子SigL、CcpA、DegU和LexA的调控。在枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)中，SigL是一种增强子，位于枯草芽孢杆菌的谷氨酸脱氢酶基因的下游，负责转录编码谷氨酸脱氢酶的rocG基因；CcpA转录因子参与代谢产物的分解；DegU控制鞭毛形成和生物被膜形成的基因表达；LexA蛋白在DNA损伤的情况下被诱导，是细菌SOS DNA修复系统的转录抑制因子，推测这些转录因子在Bt中也发挥相似的作用。通过PCR获得00940基因上、下游同源臂和卡那霉素(kan)抗性基因，利用重叠PCR获得完整的基因敲除片段。根据酶切位点将基因敲除片段和pMAD温敏载体进行重组反应，得到重组质粒。将重组质粒电击转化Bt XL6-，筛选获得了00940基因敲除突变株。以Bt Xl6-作为对照，对Bt Xl6- 00940基因突变株进行表型分析，包括生长曲线测定、群游能力测定以及生物被膜形成能力测定。结果表明，00940基因的敲除对菌株的生长趋势没有影响，但是群游能力和生物被膜形成能力提高，初步确定00940基因的敲除提高Bt Xl6-菌株的生物被膜形成能力。基因敲除突变株的获得为进一步分析相关调控基因的功能提供科学依据和基础资料。

摘 要 白蚁(Isoptera)常以富含纤维素的木材为食，体内存在纤维素酶产生菌。从源于陕西佛坪的白蚁(经鉴定为黑胸散白蚁(Reticulitermes chinensis))体内筛选出了4株产纤维素酶菌株，采用单因素实验设计对酶活最高的菌株进行了产酶条件优化，并对其所产纤维素酶进行了酶学性质研究；同时，依据NCBI数据库设计的引物扩增出了该菌株的内切-β-1，4-葡聚糖酶基因Cbs和β-葡萄糖苷酶基因BaG，之后在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行了表达实验。结果表明：从黑胸散白蚁体内筛选出4株菌分别是阿氏肠杆菌(Enterobacter asburiae)、炭疽芽胞杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，其中枯草芽胞杆菌所产纤维素酶的活力最高，该菌发酵产酶的最适温度和pH分别是42 ℃、6.5，酶促反应的最适温度和pH分别是70 ℃、4.5，在此条件下该菌株酶活力为2.36 U/mL。该菌株所产的纤维素酶在50 ℃、pH 6.5的条件下热稳定性和pH稳定性最佳，使用该菌株所产的粗酶液发酵粗饲料，结果发现其对玉米(Zea mays)秸秆、小麦(Triticum aestivum)秸秆、苜蓿(Medicago polymorpha)干草和青贮饲料的粗纤维降解率分别为12.21%、1.3%、3.24%和17.42%。基因克隆结果表明该菌株具有BaG、Cbs 2个纤维素酶基因，且大肠杆菌表达结果显示BaG基因的粗酶液proBaG无纤维素酶活性，而Cbs基因的粗酶液proCbs在60 ℃、pH 5.0时酶活可达4.14 U/mL，将BaG和Cbs基因进行原核融合表达，产生的蛋白约35 kD，其在最适条件70 ℃、pH 4.5时的酶活为4.57 U/mL，说明无纤维素酶活性的BaG基因与Cbs基因融合后可能表达出了一个活性更高的纤维素酶蛋白。本研究对后期构建可降解木质纤维素的人工重组菌具有重要的理论价值。

摘 要 牙鲆(Paralichthys olivaceus)是我国主要的海水经济养殖鱼类，在胚胎冷冻保存方面已获得了超低温冷冻保存成功的案例，但在分子水平上对牙鲆胚胎在低温状态下相关基因的表达进行研究，至今还未见报导。本研究首先收集了牙鲆的3个胚胎时期(肌节期、尾芽期和心跳期)，分别在0 ℃及16.5 ℃进行处理培养，使用实时荧光定量PCR技术检测4个内参基因18S rRNA、ACTB、GAPDH及EF1α的表达水平，并用GeNorm和NormFinder软件对其的稳定性进行排序分析。GeNorm软件分析结果显示，18S rRNA和EF1α的稳定性最好，稳定性最差的为GAPDH；NormFinder软件分析结果显示，18S rRNA的稳定性最好。综合两个软件的分析结果，在不同发育时期以及低温处理的牙鲆胚胎中，18S rRNA表达量相对稳定，较其他3个基因更适合作为内参基因。为探究牙鲆胚胎在低温处理下分子水平的变化，本研究选取了对温度适应性较强的尾芽期胚胎为实验材料，分别在低温0 ℃和正常培养温度16.5 ℃下进行培养，并选取与应激反应相关的热休克蛋白基因(heat shock protein, Hsp)70和冷诱导RNA结合蛋白基因(cold-inducible RNA-binding protein, CIRP)进行表达量分析。实时荧光定量PCR的结果表明，CIRP的表达量在0 ℃处理30 min之内逐渐下降，在30 min时达到最低值，30~120 min内上升，并在120 min时达到峰值，之后回落，在180 min时，其表达量回落到与对照组相似的水平。而Hsp70在低温处理的前30分钟表达量下降，后回升，120 min达到最大值后回落的现象，与对照组有显著性差异(P＜0.05)。研究结果说明低温会导致CIRP及Hsp70基因表达水平的改变，先下降后升高再回落的趋势也说明了机体内对低温应激产生了保护反应，为探索牙鲆胚胎在低温下调节和适应的分子机理提供了一定的依据。

摘 要 天冬氨酸蛋白酶(aspartic proteases, APs)是植物体内一类蛋白水解酶，在植物的生长发育过程中发挥极为重要的作用。为了明确月季(Rosa hybrida)中APs的初步功能，本研究以切花月季萨蔓莎(R. hybrida 'Samantha')为材料，采用cDNA末端快速扩增PCR (rapid amplification of cDNA ends, RACE-PCR)的方法克隆到一个天冬氨酸蛋白酶基因(APs)，命名为RhASP1(GenBank No.: MG384616)，通过qRT-PCR和异源过表达拟南芥(Arabidopsis thaliana)的方法对RhASP1的表达特性和在拟南芥中的生物学功能进行了初步研究。结果表明RhASP1开放阅读框(ORF)包含1 287 bp，编码428个氨基酸，属于B类型APs；RhASP1的表达受盐处理诱导，乙烯处理24 h和失水胁迫3 h显著提高了RhASP1的转录水平(P＜0.05)。通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法转化野生型拟南芥，获得3个超表达转基因株系，并对盐胁迫下转基因植株的表型和生理指标进行了测定。不同盐胁迫浓度处理下，RhASP1转基因植株的发芽率、初生根伸长量和侧根数目均显著高于野生型拟南芥(P＜0.05)；与野生型相比较，RhASP1转基因株系的叶片和植株染色较浅，O2·和H2O2相对积累量少，且显著低于野生型植株(P＜0.05)。上述结果初步明确了RhASP1的生物学功能，为月季的逆境育种提供了基因储备和理论参考。

摘 要 前黑素小体蛋白基因(premelanosome protein gene, PMEL)可以直接启动黑素小体内纤维的形成，促进黑素小体合成，是调控动物毛色的主要候选基因之一。目前关于北极狐(Vulpes lagopus)毛色差异表达基因的相关研究相对较少，本研究旨在筛选调控北极狐毛色的PMEL基因的启动子核心区域及转录因子。研究通过基因组测序技术，获得了北极狐PMEL基因启动子序列，利用生物信息学方法对其核心启动子区域和转录因子结合位点进行预测；以北极狐基因组DNA为模板，扩增出该基因不同长度的启动子缺失片段，并连接至pGL3-Basic载体，将重组质粒瞬时转染到A375和293T细胞，利用基因检测仪进行活性验证。结果表明，成功构建了8个含有不同长度启动子片段的重组质粒，经双荧光素酶活性检测发现北极狐PMEL基因的-1 162/+8区域为核心启动子区域；生物信息学预测分析发现在北极狐PMEL基因的-1 162/-655区域存在5个转录因子结合位点，分别为Sp1(-966/-952)、Sp1(-912/-900)、Sp1(-750/-736)、NF-1(-712/-699)和NF-1(-682/-673)；利用重叠延伸PCR技术成功构建了5个突变载体，经双荧光素酶活性检测发现该5个突变载体活性均显著下降(P＜0.05)，表明这5个转录因子是北极狐PMEL基因转录调控的正调控元件。本研究为探究该基因的表达调控机制提供了科学依据，并为北极狐毛皮品质分子育种和彩色毛皮材料的创制提供了思路。

摘 要 猪传染性胸膜肺炎 (porcine contagious pleuropneumonia, PCP)是猪(Sus scrofa)的一种呼吸道疾病，影响世界养猪业，其病原菌为猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae, APP)，现有疫苗由于保护效果不甚理想，因此有必要寻找新的疫苗候选分子。本研究检测了猪APP重组NLPI蛋白(recombinant NLPI, rNLPI)的免疫保护作用。根据GenBank中已报道的APP nlpi基因序列设计引物对，然后以 APP的基因组为模板PCR 扩增nlpi基因，测序后进行生物信息学分析，发现该基因(GenBank No.: MH027649)由900 bp组成，编码1个含299个氨基酸的蛋白质，为一外膜脂蛋白，此外膜蛋白在多种APP血清型之间具有很高同源性。将nlpi基因亚克隆至 pET32a(+)载体，转化大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)诱导表达APP rNLPI，并经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blot, WB)确认。结果表明，在34 kD处有特异性条带，可被相应的阳性血清识别。动物保护实验采用BALB/c小鼠(Mus musculus)进行，酶联免疫吸附法(enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)用于测定免疫球蛋G(immunoglobulin G, IgG)抗体滴度。结果表明,弗氏不完全佐剂+50 μg rNLPI、弗氏不完全佐剂+30 μg rNLPI、弗氏不完全佐剂+10 μg rNLPI、30 μg rNLPI免疫后，可诱导小鼠分别产生40%、20%、10%和20%的存活率；佐剂组和生理盐水对照组存活率为0。幸存小鼠慢慢恢复健康，并正常采食。可见，rNLPI皮下免疫可诱导小鼠产生免疫应答和较高的抗攻击感染的免疫保护力。该研究结果为进一步筛选猪传染性胸膜肺炎分子疫苗积累了基础资料。

摘 要 PNPLA3 (patatin like phospholipase domain-containing 3)也称为脂肪细胞营养素(adiponutrin)或不依赖于钙的磷脂酶A2ε (calcium-independent phospholipase A2ε, iPLA2ε), 是PNPLAs家族中的一员，具有水解磷脂和中性脂质的活性以及酯酰基转移酶活性，能够参与脂肪的积累和脂肪动员。本研究旨在探讨鸡(Gallus gallus)肝脏中PNPLA3基因表达调控规律，为进一步阐明PNPLA3基因在鸡肝脏脂质代谢中的生物学功能奠定基础。首先运用生物信息学方法对鸡和其他12种动物的PNPLA3氨基酸序列进行分子进化分析；然后利用qRT-PCR技术，分析PNPLA3基因在不同发育时期卢氏绿壳蛋鸡各组织的时空表达规律，并分别从个体与细胞水平分析雌激素及其受体拮抗剂对PNPLA3表达的调控机制。结果表明，鸡与两栖类、爬行类和鱼类等物种的PNPLA3氨基酸序列相似性较高，在哺乳动物人(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)等物种中的序列相似性较低；鸡PNPLA3基因在各组织中表现出广泛表达的特性，其中在10周龄的鸡胸肌、腹脂、胰腺中表达水平较高，在30周龄鸡的肝脏、胸肌、腹脂中表达水平较高，且在肝脏中的表达水平随着性成熟而显著升高(P＜0.01)；雌激素处理可显著提高鸡肝脏组织和体外培养的鸡胚胎肝原代细胞中PNPLA3的表达水平(P＜0.05)，雌激素受体(estrogen receptor, ER)-α特异性拮抗剂MPP(methyl-piperidino-pyrazole)可完全抑制雌激素的作用(P＜0.05)。综上所述，鸡与两栖类和鱼类等物种的PNPLA3氨基酸序列相似性较高，与哺乳动物序列相似性较低；PNPLA3在肝脏组织表达丰度较高，且在性成熟后显著升高；雌激素通过雌激素受体ER-α调控PNPLA3表达。上述发现为深入研究鸡PNPLA3与肝脏脂肪代谢调控机制提供了基础资料。

摘 要 华南鲤(Cyprinus carpio rubrofuscus)作为优质的地方鲤鱼品种禾花鲤在广东省粤北地区有着悠久的稻田养殖历史。为了解人工养殖和选育对华南鲤群体的遗传多样性和遗传结构的影响，为华南鲤的种质资源保存和育种利用等提供依据，本研究采用16对微卫星引物对华南鲤第5代选育群体(F5)和2个地方品种(乳源群体, 乐昌群体)的遗传多样性进行了比较分析。结果显示，在3个群体中，16对微卫星引物均表现为多态性，共扩增得到119个等位基因，每个微卫星座位检测到的等位基因数为3~10个，平均每对引物7.44个。3 个群体的平均期望杂合度(He)分别为0.636 0、0.698 9和0.775 1，Shannon多样性指数(I)分别为1.206 3、1.402 0和1.612 2，平均多态信息含量(PIC)分别为0.570 1、0.645 8和0.720 7，表明3个群体都具有较高的遗传多态性(PIC＞0.5000)，但地方品种的遗传多样性水平高于选育品种。3个群体各个微卫星位点上的遗传分化指数(Fst) 值介于0.044 0~0.246 8，平均值为0.102 8，表明群体间的遗传变异水平中等。群体间遗传分化指数(Fst) 配对比较结果显示，选育群体F5与乐昌群体的遗传分化指数值最大(0.182)，乳源群体和乐昌群体2个地方群体间则最小(0.058)。实验结果表明，人工选育加快了华南鲤选育品种与地方品种的遗传分化，也导致了选育品种遗传多样性下降，但选育品种遗传多样性水平依然较高，还具有进一步选育的潜力。本研究结果为下一步制定华南鲤新品种选育计划提供基础遗传数据。

摘 要 由于抗生素的大量使用和滥用，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)出现了耐药性，甚至是多重耐药性，因此开发新的抗生素和疫苗迫在眉睫。为深入了解肺炎链球菌的耐药机制，从而为开发新的抗生素和疫苗提供依据，本研究从肺炎链球菌TIGR4菌株中克隆1个耐药相关基因SP_0010(GenBank登录号: A0A0H2UMY6-1)至表达载体pET28a(+)中，并转化至大肠杆菌(Escherichia coli) Rosetta (DE3)菌株，实现基因SP_0010的异源表达。通过蛋白电泳结果显示，该重组蛋白Sp_0010的最佳诱导温度为16 ?C；镍柱纯化条件为20 mmol/L咪唑除杂蛋白，250 mmol/L咪唑洗脱重组蛋白。亲和层析后的重组蛋白Sp_0010在溶液状态为单体，且纯度较高；而肽聚糖结合实验揭示重组蛋白Sp_0010能结合肽聚糖，且与去磷壁酸的肽聚糖结合能力更强。该研究揭示了蛋白Sp_0010与肺炎链球菌肽聚糖代谢相关，为后续阐明其在肺炎链球菌耐药机制的作用提供了数据支持。

摘 要 锌指结构蛋白(zinc finger protein, ZFP)是一类在植物生长、发育和逆境胁迫响应中发挥重要作用的转录因子。为了挖掘桉树(Eucalyptus)抗寒分子响应中的重要基因资源，为桉树抗低温分子辅助育种提供理论依据，本实验对巨桉(Eucalyptus grandis)在低温处理下受到强烈诱导表达的锌指结构蛋白基因EgrZFP7(Eucalyptus grandis zinc finger protein 7)编码蛋白结构及其功能进行了研究。该基因是典型的C2H2型锌指结构蛋白基因，编码蛋白序列中含有2个锌指结构基序、1个L-Box基序和1个乙烯响应元件结合因子(ethylene response factor, ERF)相关双性抑制子(ERF-associated amphiphilic repression, EAR)基序。通过构建EgrZFP7∷GFP表达载体，用基因枪轰击洋葱表皮的方法，进行基因表达蛋白的亚细胞定位，结果表明，EgrZFP7表达蛋白定位于细胞核。构建35S∷EgrZFP7超表达载体，转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)，得到超表达转基因纯合株系EgrZFP7-OX1和EgrZFP7-OX2。与野生型相比，其正常生长条件下侧根的数目和长度增加。以-8 ℃低温处理3 d、再缓苗恢复3 d，结果显示，超表达转基因株系恢复速度慢，同时幼苗因受低温胁迫的死亡率远高于野生型，说明该基因超表达增加了拟南芥转基因植株的低温敏感性。酵母双杂交文库中筛选到1个与EgrZFP7互作的乙烯响应因子蛋白EgrERF4(Eucalyptus grandis ethylene response factor 4)。上述研究结果表明，EgrZFP7可能通过与乙烯响应因子的相互作用，在巨桉低温胁迫响应中发挥负调控。本研究为进一步了解桉树抗寒分子机理提供了基础资料。

黑籽南瓜(Cucurbita ficifolia)是云南特有的对病害有较强抗性的一种瓜类作物。为发掘利用其蕴含的优异抗病基因资源，本研究根据已克隆到的植物核苷酸结合位点(nucleotide binding site, NBS)类抗病基因的保守氨基酸结构域基因设计简并引物，通过PCR扩增从黑籽南瓜基因组中分离了8条黑籽南瓜抗病基因同源序列(resistance gene analogous, RGAs)，聚类分析和相似性比较结果显示，黑籽南瓜抗病基因同源序列2(black seed squash resistance gene analogous 2, HQRGA2(GenBank No.: MG946756)单独为一类，且具有核苷酸结合衔接子(nucleotide-binding adaptor shared by APAF-1, R proteins and CED-4; NB-ARC)结构，其余7条序列均不具有NBS保守结构域。核苷酸相似性分析表明，HQRGA2与部分抗病基因序列的相似性达到87%~99%，其中与南瓜(Cucurbita maschata)NBS类抗病蛋白基因13(squash resistance gene analogous, SQRGA-13)和SQRGA-8的相似性分别达到98.0%和97.0%。对HQRGA2编码的氨基酸保守结构域分析表明，其含有NBS类抗病基因的4个保守模块：P-loop、Kinase-2、Kinase-3a和GLPL区，且属于无Toll蛋白或白介素1受体类似的NBS富亮氨酸重复(non toll/interleukin-1 receptor like of NBS plus leucine-rich region, non-TIR-NBS-LRR)类抗病基因同源序列。HQRGA2编码氨基酸的同源性分析结果表明，其与南瓜抗病蛋白基因SQRGA-13氨基酸同源性较高，达到96.6%，与其余抗病基因同源性在16.6%~43.8%之间，NBS区域氨基酸系统进化树分析结果表明，HQRGA2可能是一个新的抗病基因片段。qRT-PCR分析表明，黑籽南瓜HQRGA2片段的表达受尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的胁迫诱导，表现出先扬后抑的表达模式，说明HQRGA2可能为抗病相关基因片段。黑籽南瓜中NBS类抗病基因同源序列HQRGA2的获得为分离克隆其完整抗病基因提供了新线索。

摘 要 紫云英(Astragalus sinicus)作为重要的蜜源植物和绿肥作物，对促进作物增产具有重要作用。根据当地的耕作制度，选育花期适当的品种是紫云英重要的育种目标。LEAFY (LFY)是植物花分生组织的特异基因，而目前关于紫云英LEAFY基因的研究尚无报道。为探究紫云英中LEAFY基因的功能，本研究采用Illumina Hiseq和cDNA末端快速克隆(rapid-amplification of cDNA ends, RACE)技术对紫云英LEAFY基因序列进行克隆；采用生物信息学分析软件对LEAFY基因进行生物信息学分析；采用qRT-PCR揭示该基因在不同组织中的表达特性；采用表达载体构建、侵染以及转基因T2代纯合株系的生长发育表型特征统计分析鉴定紫云英LEAFY基因功能。本研究获得的LEAFY基因全长cDNA长度为1 400 bp (GenBank No. MH352146)，含有1个1 191 bp长的开放阅读框；编码的蛋白质含有396个氨基酸，含22个α螺旋和5个β折叠，其分子量为44.72 kD，理论等电点为6.41；编码的氨基酸序列与蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)、紫花苜蓿(Medicago sativa)、鹰嘴豆(Cicer arietinum)等物种的LEAFY蛋白相似性均在80%以上，具有高度的同源性；qRT-PCR分析结果表明，紫云英LEAFY基因在各组织中的表达量由高到低依次为花芽、花、叶、叶芽、根、茎和荚；超表达LEAFY基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)实验结果发现，超表达LEAFY基因拟南芥株系的出苗至抽薹天数比野生型平均早3 d，出苗至开花天数比野生型平均早2 d，开花数比野生型平均多1.79个。本研究表明紫云英LEAFY基因与豆科物种均有较高的同源性，在其花芽中表达量最高，并证实LEAFY基因可能调控其开花机制，为通过分子技术改良该物种成花提供理论依据，对农业生产具有重要意义。

摘 要 钴胺素转运蛋白受体CD320 (cluster of differentiation 320)为低密度脂蛋白受体家族成员，在钴胺素转运过程中发挥重要作用，参与机体多种生理过程的调节。本研究采用RT-PCR克隆山羊(Capra hircus)CD320基因，并对其序列进行生物信息学分析，同时采用qRT-PCR技术分析CD320在成年山羊不同组织(心、肝、脾、肺、肾、卵巢、骨骼肌、睾丸)以及睾丸发育各时期中的表达谱。结果表明，成功克隆获得山羊CD320基因(GenBank登录号：MG560828)，其cDNA序列全长877 bp，开放阅读框为768 bp，编码255个氨基酸，预测分子量约为27.18 kD；与其他物种同源比对及系统发生分析表明，该基因编码的蛋白在低密度脂蛋白受体A型结构域(low-density lipoprotein receptor type A domains, LDLRA)和跨膜域的核心位点高度保守；CD320在成年山羊各个组织中均有表达，在肺、睾丸、肌肉组织中表达水平显著高于其他组织(P<0.01)；在睾丸中，随着发育成熟，CD320的表达量持续升高，性成熟期时表达量最高(P<0.01)，在附睾中不同部位间的表达量也存在差异，整体也以6月龄(性成熟)时表达量最高。本研究表明CD320可能参与了山羊睾丸、附睾的发育和精子生成过程，为进一步探索该基因在山羊生殖细胞发育中的功能奠定了基础。

摘 要 鹅出血性多瘤病毒(Goose hemorrhagic polyomavirus, GHPV)为近年来我国鸭群新发病原。为明确我国鸭源GHPV基因组特征，本研究利用分段PCR扩增技术克隆获得樱桃谷鸭(Anas platyrhynchos domestica)源GHPV(FJ201601株)全基因组序列，并对其进行核苷酸同源性比较和遗传进化分析。结果表明，克隆的GHPV(FJ201601株)全基因组序列长为5 254 bp(GenBank登录号MG544856)，(G+C)%含量为48.01%，编码的6个主要功能基因(ORF-X, VP2, VP3, VP1, Large T和Small T)长度分别为510、981、654、1 062、1 911和483 bp。核苷酸同源性分析表明，FJ201601株和其他不同地区、不同宿主来源GHPV相互之间基因组核苷酸同源性较高(99.7%以上)；其6个主要功能基因和其他不同地区、不同宿主来源GHPV相应基因的核苷酸(99.4%以上)和氨基酸同源性(98.2%以上)均极高。从全基因组及其编码的6个主要功能基因遗传进化关系可见，GHPV各分离株在基因组上亲缘关系较近，6个主要功能基因在遗传进化上差异不大，但北京鸭源GHPV和樱桃谷鸭源GHPV在遗传进化上仍存在细微差别，且不同宿主(多品种鸭和鹅)源GHPV在遗传进化上不存在宿主特异性。本研究丰富了GHPV分子流行病学数据，明确了GHPV基因组分子特征，为后续开展GHPV相关研究提供参考。

摘 要　肌肉生长抑制素(myostatin, MSTN)是肌肉生长负调控因子，MSTN基因突变可造成MSTN生物学功能缺陷，从而引起动物的双肌性状。本研究旨在筛选靶向绵羊(Ovis aries)MSTN基因的高效单导向RNA(single-guide RNA, sgRNA)，并构建可标记表达载体，以提高CRISPR/Cas9(clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)介导的绵羊MSTN基因突变效率。利用Gibson Assembly法将增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)序列与串联表达原件2A序列插入pX330质粒载体中，构建pX330-EGFP质粒载体，并将设计好的12个sgRNA寡核苷酸链以Golden Gate法分别连入pX330-EGFP质粒载体，以构建12个不同的pX330-EGFP-sgRNA质粒表达载体；将构建好的pX330-EGFP-sgRNA表达载体以电转染的方法分别转入12组绵羊成纤维细胞，48 h后提取各组部分细胞基因组，利用SURVEROR分析初选获得3个具有靶向效果的细胞群(T2, T9, Q2)，其对应转染质粒为pX330-EGFP-sgRNA；之后分别提取3组细胞中的阳性转染细胞基因组，扩增MSTN基因并进行测序分析，得出sgRNA-T2、sgRNA-T9、sgRNA-Q2的打靶效率分别为40%、40%、60%。本研究通过构建表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的pX330-EGFP-sgRNA表达载体，成功筛选到高效靶向绵羊MSTN基因的sgRNA，并获得准确的编辑效率，为后续其他基因sgRNA的筛选提供了借鉴，并为MSTN基因编辑羊的生产提供科学依据。

摘 要 五羟色胺(5-hydroxytryphtamine, 5-HT)是机体重要的单胺类神经递质，广泛分布于动物体各组织器官并参与机体多种生理功能。色氨酸羟化酶(tryptophan hydroxylase, TPH)1是5-HT合成的限速酶，在5-HT调控机体代谢过程中起关键作用。本研究旨在利用CRISPR/CAS9技术建立稳定敲除TPH1基因的山羊(Capra hircus)乳腺上皮细胞系，为研究山羊乳腺中5-HT调控山羊乳腺上皮细胞(goat mammary epithelial cells, GMEC)钙离子代谢的分子机理提供实验材料。首先根据GenBank中山羊TPH1基因序列(GenBank No.: 102184739)，设计靶向TPH1基因第一外显子的单导链RNA (single guide RNA, sgRNA)，用pX458和pX459分别构建重组真核表达载体pX458-sgRNA和pX459-sgRNA，将重组质粒转染山羊乳腺上皮细胞，使用嘌呤霉素(1 μg/mL)进行阳性细胞筛选，挑取单克隆细胞进行培养，用Western blot、T7E1酶切、基因组DNA测序等方法鉴定基因敲除效果。结果显示：通过CRISPR/CAS9技术成功在TPH1基因第一外显子打靶产生10 bp碱基缺失。本研究成功构建并筛选获得了TPH1基因稳定敲除的单克隆山羊乳腺上皮细胞系，为5-HT调控乳腺生理的功能研究提供了重要材料。

摘 要 牛支原体(Mycoplasma bovis, Mb)是牛(Bos taurus)的重要致病性支原体，其生物被膜的形成在宿主细胞中产生持续性感染，使养牛业造成重大的经济损失。因此，本研究旨在通过对Mb不同菌株生物被膜形成能力的鉴定，筛选出1株生物被膜形成优势菌株，并对其培养条件进行优化，以期为Mb生物被膜相关的研究提供生物材料。首先应用微孔板定量检测法鉴定Mb PG45株、湖北株(HB株)、武威株(WW株)、定西株(DX株)和临洮株(LT株)生物被膜的形成能力；进而以生物被膜形成能力强的菌株作为模式菌株，完成对Mb生物被膜形成培养条件的优化。结果显示，Mb不同菌株形成生物被膜的能力不同，其中临洮株生物被膜形成能力最强，湖北株生物被膜形成能力次之，PG45株、武威株和定西株生物被膜形成能力最弱。取浓度为1.7E+08 CFU/mL的Mb液体培养物，按1∶10转接种于含0.01 mg/mL DNA、20%马血清和1%葡萄糖的Eaton培养基(pH 8.5)，于37 ℃、5% CO2条件下培养72 h，Mb生物被膜的形成最佳。本研究筛选获得1株生物被膜形成能力强的Mb，并通过培养条件的优化，使之形成稳定且明显的生物被膜，从而为Mb生物被膜相关研究提供了良好的生物材料。

摘 要 长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)为长度大于200个核苷酸且基本不编码蛋白质的转录本，最初发现时被认为是基因表达产物中的暗物质。近些年的研究表明lncRNA在疾病发生、细胞周期、干细胞分化等生物进程中发挥作用，相关的分子机理大致分为四种(信号分子、诱饵分子、引导分子和支架分子)。由于长链非编码RNA数量庞大和复杂的作用机理，这个领域仍然需要科学家们不断地探索。本文结合近年的研究进展，从lncRNA的定义与分类、分子机理、生物学功能、发展前景等方面进行综述，为长链非编码RNA的机制与功能研究提供参考。