小菜蛾(Plutella xylostella (Linn.))是十字花科蔬菜为害最重的害虫，对拟除虫菊酯类农药已经普遍产生了严重抗性。为完整了解小菜蛾对拟除虫菊酯类农药抗性特点，本研究采用核苷酸测序法检测了室内饲养种群及小菜蛾田间种群的击倒抗性基因频率，及氰戊菊酯处理后死亡个体的基因型组成。结果显示，本研究中仅检测到L1014F和T929I 两个位点突变；室内饲养的小菜蛾2~4龄幼虫2个位点突变频率均为98.75%~100%，福建、浙江、内蒙古、北京等地小菜蛾田间种群在2个位点突变频率分别为90.00%~100%和88.75%~100%；2010-11~2011-11福州埔垱菜区田间小菜蛾2个位点突变频率相同，均为98.75%~100%；因氰戊菊酯处理死亡的个体在2个位点均为抗性纯合子。研究结果表明，小菜蛾抗性基因型较为单一；不同龄期、同一季节不同地区、同一地区不同季节小菜蛾抗性基因频率变化均较小；T929I突变在L1014F突变基础上产生，但当L1014F突变位点为杂合子时，T929I突变位点便为抗性杂合子或敏感纯合子；突变位点基因型不是小菜蛾对氰戊菊酯敏感性的唯一决定因素。本研究有助于更好了解小菜蛾对拟除虫菊酯类农药抗性的发生特点。

营养期杀虫蛋白3A(vegetative insecticidal protein 3A, Vip3A)对鳞翅目(Lepidoptera)害虫具有广谱杀虫活性，具有重要研究意义。本研究以对玉米螟(Ostrinia nubilalis)具有高毒力的野生型苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringienesis, Bt) NBIC-380 菌株总DNA为模板，PCR扩增vip3Aa (GenBank 登录号: KT307982)全长基因约2.4 kb。将vip3Aa基因插入大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pGEX-6p-1和pET-28a以及Bt表达载体pBMB1A中，构建重组表达载体pGV3、pEV3和pBV3。将pGV3和pEV3转化大肠杆菌BL21 (DE3)，pBV3转化Bt BMB171和枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis, Bs)168菌株。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis, SDS-PAGE)分析表明，vip3Aa基因在BL21(DE3)、BtBMB171和Bs168中均有表达，蛋白质相对分子质量为88 kD。纯化后的蛋白及Bt中表达的蛋白对棉铃虫(Helicoverpa armigera)二龄幼虫进行了生物测定，在大肠杆菌表达的蛋白没有杀虫活性，而在芽胞杆菌中表达的蛋白有杀虫活性，半数致死浓度(medium lethal concentration, LC50)值分别为6.185 6 (Bt BMB171) 和2.984 6 mg/mL (Bs168)。生测结果表明，Bt NBIC-380 菌株的vip3Aa 基因表达的蛋白对棉龄虫具有一定杀虫活性。本研究为丰富Vip的基础研究和构建高效广谱的工程菌提供基础资料。

为探索苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)对重金属镉胁迫下水稻(Oryza sativa)种苗生长及生理生化指标的影响，本研究分别采用直接测量法、表观观察法和紫外分光光度法测定其对镉胁迫下水稻种苗苗高、根长、水稻种子发芽率、剑叶枯黄率与褐斑率以及叶绿素含量的影响。利用原子力显微镜观察镉处理前后的苏云金芽胞杆菌表面的变化。结果表明，经过镉处理的Bt菌的表面出现一些颗粒物，说明镉在细菌表面存在吸附的过程，暗示该菌在水稻田镉污染生物修复中具有潜在的应用前景。此外，在镉胁迫下，水稻种苗的生长受到抑制，其抑制作用随镉胁迫浓度的增大而增强。在50和400 mg/L Cd2+处理组中，根长与苗高的Cd处理与Cd+Bt处理的差异不显著(P＞0.05)，表明，镉胁迫下Bt菌处理的水稻种苗苗高和根长变化较小。在100 和400 mg/L Cd2+处理组中，叶绿素a和叶绿素b的Cd+Bt处理较Cd处理显著提高(P＜0.05)；在200 mg/L Cd2+处理组中，Cd+Bt处理较Cd处理水稻种子发芽率显著提高(P＜0.05)。施用Bt菌前后镉对水稻枯黄率与褐斑率的影响研究发现，50和400 mg/L Cd2+处理组中，Cd+Bt处理较Cd处理枯黄率显著下降(P＜0.05)；50 mg/L Cd2+处理组中未出现褐斑，400 mg/L Cd2+处理组中Cd+Bt处理较Cd处理褐斑率显著下降(P＜0.05)，表明，经Bt菌处理后水稻的剑叶枯黄率与褐斑率均低于未加菌的处理。本研究结果表明，Bt菌可以通过对重金属镉的吸附，减少水稻土中的游离镉的含量，从而减少了水稻种苗对重金属镉的吸附量，缓解镉对水稻的胁迫作用，并提高幼苗叶绿素的含量。本研究为Bt菌株在实际镉污染农田中的应用提供理论基础。

本研究基于一株对小菜蛾(Plutella xylostella)幼虫具有高毒力的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株FH21，利用改进的限制性片段长度多态性聚合酶链反应(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)，从FH21中成功克隆出杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal proteins)基因cry1Bb3、cry1Da4、cry1Ja3 和cry1Id3，GenBank登录号分别为KJ619659、KJ619660、JQ228425和KJ619661。将上述4个基因插入表达载体pEB，转化大肠杆菌(Escherichia coli) 菌株Rosetta (DE3)，在低温条件下经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)诱导表达。FH21总蛋白与4种蛋白的表达产物采用饲喂法分别对小菜蛾、棉铃虫(Helicoverpa armigera)和亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)进行杀虫活性测定。结果表明，FH21总蛋白对3种昆虫均有较好的杀虫活性，致死中浓度(lethal concentration 50, LC50)分别为0.801、0.502和2.858 mg/L。Cry1Bb3、Cry1Ja3和Cry1Id3蛋白对小菜蛾和亚洲玉米螟有较好的杀虫活性，LC50分别为1.860、1.697、1.538、1.800、2.270和0.840 mg/L。本研究表明，Bt FH21菌株对多种农业害虫具有很高的杀虫活性，同时对其进行杀虫基因测定并对杀虫基因进行了杀虫活性测定，几种cry1类基因的发现为重要农业害虫的防治提供了更多的选择。

水稻矮缩病毒(Rice dwarf virus, RDV)主要由介体昆虫黑尾叶蝉(Nephotettix cincticeps)以持久增殖型方式传播。在RDV侵染介体黑尾叶蝉培养细胞时，病毒编码的非结构蛋白Pns11参与形成病毒原质，但Pns11的具体功能尚不知晓。本研究应用RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术，将体外合成靶向Pns11基因的dsRNA转染黑尾叶蝉培养细胞，可显著降低Pns11的表达，并抑制病毒的积累和侵染。用显微注射技术将体外合成靶向Pns11基因的dsRNA导入到黑尾叶蝉，可显著抑制病毒在昆虫体内的侵染和扩散，最终降低介体传毒效率。结果表明，RDV Pns11是病毒在介体昆虫体内侵染和复制所必需的，是病毒复制的关键因子，可作为阻断病毒在介体内的复制和传播提供有效靶点。

细菌素(Bacteriocin)是由某些细菌通过核糖体途径产生的一类具有抗菌活性的多肽或蛋白质，因其无致畸变作用，也不易产生耐药性，在食品及卫生安全中备受关注。本研究以经过全基因组测序的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt) BRC-ZYR2为出发菌株，预测得到一个假定的细菌素基因AOI-3。PCR扩增获得231 bp目的基因片段，利用无缝克隆技术将目的基因片段连接到pET32a载体，转入大肠杆菌(Escherichia coli)JM109，筛选克隆子进行酶切以及测序验证。基因序列比对结果显示，该基因与Bt HD-789全基因组中一段未被注释的核酸序列(GenBank 登录号: CP003763.1)同源性达99%。氨基酸序列比对结果显示，与一个假定的Bt细菌素(Bt bacteriocin biosynthesis protein)(GenBank 登录号: WP_033699510.1)的同源性达100%。此外，该细菌素的保守结构域属于未知功能域家族蛋白(domain of unknown function, DUF)亚族蛋白DUF2762，可能具有类似穿孔毒素BhlA的作用。氨基酸组成分析表明，该基因序列编码76个氨基酸，分子量为8 813.62 Da，等电点为4.82，无信号肽，含有1个跨膜区，将重组表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)，异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)诱导表达。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)结果表明，在上清中检测到预期的8.8 kD多肽表达。采用His-tag亲和层析技术纯化目的蛋白。本研究通过对假定的细菌素基因AOI-3克隆、表达和获得多肽纯品，为测定其抑菌谱并了解细菌素结构及作用机理奠定了基础。

水稻齿叶矮缩病毒(Rice ragged stunt virus, RRSV)由介体褐飞虱(Nilaparvata lugens)以持久增殖型方式传播。RRSV编码的非结构蛋白6 (nonstructural protein 6, Pns6)是病毒原质的组分，但其在介体昆虫传毒中的功能未知。本研究利用dsRNA诱导的RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术研究Pns6蛋白在病毒侵染介体昆虫中的功能。通过膜饲喂法将源于Pns6基因的dsRNA (dsPns6)以及源于绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)基因的dsRNA (dsGFP)分别导入2龄褐飞虱体内，并以饲喂10%蔗糖的处理为对照，之后于病株上获毒2 d。应用免疫荧光标记技术检测发现，昆虫获毒9 d后，dsGFP和10%蔗糖处理组褐飞虱的带毒率分别为27%和30%，而dsPns 6处理组褐飞虱的带毒率仅为10%；同时qRT-PCR检测发现，Pns6蛋白的表达量受到抑制后，病毒编码的结构蛋白P8和P9的表达量也显著下降(P＜0.05)。此外，dsGFP和10%蔗糖处理组褐飞虱的传毒率分别为20%和22%，干扰Pns6蛋白的表达后褐飞虱的传毒率仅为6%。研究结果表明，Pns6是RRSV在褐飞虱体内增殖的重要蛋白，抑制Pns6的表达显著降低褐飞虱的带毒率并抑制病毒的增殖，同时削弱褐飞虱的传毒能力，明确了Pns6可作为理想的靶标用于阻断RRSV在褐飞虱体内的增殖。

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)制剂是目前产量最大、应用最广泛的微生物杀虫剂，但在施用过程中易受紫外线的影响而缩短持效期，成为Bt制剂应用受限的主要原因之一。本研究以纳米Mg(OH)2为载体，将其与Bt杀虫晶体蛋白进行负载，研究纳米Mg(OH)2负载Bt杀虫晶体蛋白后的生物杀虫活性及抗紫外能力。以共沉淀法制备纳米Mg(OH)2，利用X-射线粉末衍射(X-ray powder diffraction, XRD)对其尺寸进行表征，通过谢乐公式计算得出合成的纳米颗粒在101面的尺寸为12 nm。扫描电镜(scanning electron microscope, SEM)的结果表明，纳米颗粒为较规则的片状结构且分散均匀，与Cry蛋白负载后，其形貌没有发生明显的变化。以高效杀蚊Bt菌株LLP29为供试菌株，利用碱溶法获得Bt杀虫晶体蛋白。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulfonate - polyacrylamide gelelectrophoresis, SDS-PAGE)和生物活性测试结果表明，Bt杀虫晶体蛋白与纳米Mg(OH)2进行一定负载后，能有效地提高其Cry蛋白的杀虫活性，同时增强抗紫外辐射能力，有效地保护蛋白结构免受破坏。本研究为获得生物相容性好、环境友好的纳米Bt高效制剂提供了理论基础。

凝集素属于β-半乳糖苷结合蛋白家族，广泛存在于昆虫的体内，对其免疫调控起重要作用，研究埃及伊蚊(Aedes aegypti)中的凝集素具有重要理论意义。本研究以埃及伊蚊凝集素galectin12基因序列设计引物，通过qRT-PCR扩增获得埃及伊蚊凝集素galectin12基因片段，将其连接到pMD-18T克隆载体，筛选阳性克隆子进行酶切以及测序验证，根据酶切位点将目的基因片段连接到pET-32a载体进行原核表达，获得23 kD的目的蛋白，并采用His酶亲和层析技术对目的蛋白进行纯化，获得纯化蛋白，并进行生物活性测定，结果表明，Galectin12能够抑制Bt对蚊虫的毒力。研究结果为进一步验证凝集素参与埃及伊蚊抵御Bt Cry毒素过程的机理奠定分子基础。

茶假眼小绿叶蝉(Empoasca vitis Gothe)是危害我国经济作物茶叶(Camellia sinensis)的优势种，其发生最广、危害最重。为寻找利用生物农药解决虫害问题，提高茶叶产量质量，同时初步探索苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt) Crystal (Cry)毒素与叶蝉中肠的互作机制，本研究以前期噬菌体文库筛选得到的能与靶标昆虫中肠Cry潜在受体结合的短肽序列设计引物，通过PCR扩增大小为750 bp的短肽序列，与pMD-18T克隆载体连接，构建重组表达载体pT-egfp-32a并进行诱导表达，采用His-tag亲和层析技术对融合蛋白进行纯化，最后通过免疫印迹实验验证表达的短肽与叶蝉中肠刷状缘膜囊泡(brash border membrane vesicle, BBMV)的结合活性。本研究成功克隆了短肽序列，并诱导纯化目的蛋白，成功获得具有结合活性的短肽片段，为活性片段定向改造Cry domain获得对叶蝉有毒性作用的新型毒素提供了工作基础，为进一步了解毒素与受体间互作关系提供依据。

DEAD-box RNA解旋酶(RNA helicase, RH)普遍存在于绝大多数的生物体中，参与到RNA新陈代谢的各个方面。本研究从日本晴水稻(Oryza sativa L. japonica. cv. Nipponbare) 叶片RNA中成功克隆DEAD-box RNA解旋酶基因OsRH37的CDS全长序列。序列比对发现，OsRH37的氨基酸序列与拟南芥(Arabidopsis thaliana) DEAD-box RNA解旋酶17、37和52的氨基酸序列一致性＞70%，与来自于不同动物体内DEAD-box RNA解旋酶的氨基酸序列一致性普遍＜60%。构建了OsRH37的水稻超表达和RNAi干扰载体，通过水稻遗传转化体系成功转化水稻获得OsRH37超表达和RNAi T0转基因水稻阳性植株。sqRT-PCR分析表明，与野生型日本晴水稻中OsRH37表达量相比，OsRH37超表达T1转基因水稻中OsRH37表达量均明显上调，而OsRH37 RNAi转基因水稻中OsRH37的表达量均显著下调。构建青色荧光蛋白的瞬时表达载体CFP-OsRH37，经农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)接种导入本氏烟 (Nicotiana benthamiana) 叶片表皮细胞，激光共聚焦显微观察结果显示，OsRH37蛋白定位于细胞核、染色质核仁和细胞质中的点状结构。OsRH37的生物信息学分析、超表达和RNAi转基因水稻的获得以及亚细胞定位分析将为研究其在水稻生长发育和胁迫反应中发挥的重要作用提供线索。

多杀菌素(spinosad)为土壤放线菌刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)经有氧发酵产生的次级代谢产物，是一种广谱、高效、低毒的生物杀虫剂，已在农药、兽药和卫生用药领域得到广泛应用。刺糖多孢菌对长效碳源淀粉的利用能力很低，这给多杀菌素的工业化发酵带来了困难。本研究在刺糖多孢菌高产菌株ASAGF73中表达阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)的麦芽糖转运系统基因(maltose transporter gene)malE、malF和malG，以提高菌株利用淀粉的能力。将整合型载体pSET152::malEFG通过接合转移转化ASAGF73，获得的转化子成功表达了malEFG基因。单一碳源发酵实验结果表明，转化子利用糊精和麦芽糖的能力显著提高。以糊精或麦芽糖为单一碳源的条件下，malEFG的表达显著促进了菌体生物量的提高，进而提高多杀菌素的产量。本研究对于以淀粉为主要碳源发酵生产多杀菌素的工艺研究具有理论指导意义及应用价值。

水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)的外壳蛋白(coat protein, CP)参与病毒转录复制等多个过程，病毒蛋白之间的相互作用对病毒活性非常重要。本研究利用酵母双杂交技术(yeast two-hybrid, Y2H)和双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation, BiFC)技术进一步研究了CP的自身互作位点及其在亚细胞定位中的影响。结果发现，CP的C端307~318位氨基酸区域对其自身互作是必需的，缺失或破坏该结构会导致CP无法实现自身互作，其中4个氨基酸(L308, V309, F312和F313)是互作的关键位点。CP定位于细胞膜和细胞质并且在细胞质中聚集成团，而CP点突变在植物叶片中定位被改变，主要定位于细胞膜，细胞质中没有聚集状颗粒物，说明CP的自身互作与其在植物中的定位是有相关性的两个过程。研究结果有助于揭示CP 在RSV侵染过程中所起的重要作用。

植物对线虫病害的诱导抗性是由特殊的激发因子诱导植物增强对线虫的防御能力。本文综述了植物线虫病害诱导抗性的标准、诱导抗性反应的类型、诱导因子的主要类型及其作用的生理生化机制等。对植物线虫病害诱导抗性的研究将对制定植物线虫的综合防治策略，减少化学杀线虫剂的使用，保护农田生态环境等具有重要意义。

为筛选阿特拉津高效降解菌落和菌种资源，本研究利用富集培养法，从黑龙江省伊春市南岔区长期施用阿特拉津(2-氯-4-乙胺基-6-异丙胺基-1,3,5-三嗪, Atrazine)的玉米(Zea mays L.)地中筛选出阿特拉津降解群落NC1，此群落可以在36 h内将100 mg/L阿特拉津降解为无毒的氰尿酸。通过无机盐平板直接分离法，分离出4株形态、颜色各不相同的菌株。通过生理生化和16S rDNA鉴定，菌株YJY1、YJY2、YJY3、和YJY5分别鉴定为肠道杆菌(Enterobacter sp.)、无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和克雷白氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniae)。其中菌株YJY5可以以阿特拉津为唯一氮源生长。降解研究表明，该群落具有良好的阿特拉津降解效果，而且群落各成员间协同作用更接近于自然界阿特拉津的降解方式。本研究结果对阿特拉津污染的生物修复工作提供参考和借鉴意义。

沙雷氏菌属(Serratia sp.)中的许多菌株是一些昆虫的机会致病菌，具有一定的杀虫活性。本研究通过从患败血症的松墨天牛(Monochamus alternatus Hope)尸体中分离出一株BRC-CXG2菌株(KT366770)，并对该菌株进行形态学鉴定、16S rDNA系统发育分析、生理生化反应、药敏分析以及生物测定。结果表明，分离的菌株BRC-CXG2属于沙雷氏菌属的一种新种，且对头孢哌酮、头孢噻肟、头孢他啶等常见药物具有不同程度的敏感性，其中提取的灵杆菌素对苏云金芽胞杆菌以色列亚种(Bacillus thuringiensis israelensis, Bti)LLP29胞晶混合液杀埃及伊蚊(Aedes aegypti)活性具有显著增效作用(共毒系数为128.06)。本研究为开发Bt增效剂及构建新型工程菌提供了理论基础。

短短芽胞杆菌(Brevibacillus brevis) FJAT-0809-GLX是广谱生防菌。羟苯乙酯是该菌株发酵液中主要功能成分之一，为了建立一种快速、简单、有效的纯化分离方法对其进行定量检测，本研究建立了测定短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX发酵液羟苯乙酯的高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)法。以甲醇∶水(65∶35)作流动相洗脱，在波长254 nm进行检测，进样量为10 μL。结果表明，羟苯乙酯在1.0~20 μg/mL的范围内呈良好的线性关系，相关系数达0.998 7，最低检测浓度为1.0×10-15 μg/mL。将营养琼脂(NA)培养基发酵液提取的羟苯乙酯样品，在不同时间进行检测，结果表明，48 h内出峰时间和峰面积稳定，说明该方法在48 h内检测检测发酵液均比较稳定。添加不同水平羟苯乙酯的回收率在96.2%~105.3%之间，平均相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)为0.8%，回收率较稳定。利用优化发酵培养基培养短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX，经该方法检测显示，其羟苯乙酯出峰时间为3.12 min，峰面积为136。根据标准曲线计算得出该发酵液中羟苯乙酯含量约为2.111 μg/mL。该方法简便、快速、灵敏度高，可用于短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX发酵液羟苯乙酯的检测分析。本研究结果为短短芽胞杆菌功能成分的追踪检测奠定基础。