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农业生物技术学报  2015年 23卷 4期  刊出日期:2015-02-02
 
研究论文与报告
番茄热激转录因子(Hsf)基因家族鉴定及表达分析
Identification and Expression Analysis of Heat Shock Factor (Hsf) Gene Family in Tomato (Solanum lycopersicum)
陈勇兵 王燕 张海利
2015, 23(4): 492-501  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (6823 KB)  ( 1150 )
摘要
热激转录因子(heat shock transcription factor, Hsf)已经被证实是广泛地存在于植物细胞内的一类重要的转录调节基因,对植物抵抗高温逆境伤害和其他生命活动具有重要作用。本研究利用番茄(Lycopersicon esculentum)全基因组测序结果,鉴定番茄Hsf家族成员;通过生物信息学方法,分析其系统发育关系和染色体定位;利用已有的番茄芯片数据和qRT-PCR进行组织表达谱和基因表达响应分析。结果表明,番茄基因组含有25个Hsf基因家族成员,序列比对揭示其均具有转录因子特有的DNA结合域(DNA binding domain, DBD);根据拟南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)和黄瓜(Cucumis sativus L.)Hsf的基因结构和系统发育树将这些转录因子分为3个分支(A、B和C),细分为15个亚分支(A1~A9、B1~B4以及C1~C2)。染色体定位结果表明,25个Hsf基因除Chr.1和Chr.5外,其余不均匀分布在剩余10条染色体上。各个发育阶段表达谱分析表明,Hsf基因具有不同的表达模式,近一半的基因处于高表达水平。qRT-PCR分析表明,大多数Hsf家族成员参与番茄苗期应对高温热激反应。研究结果为揭示番茄Hsf基因的功能提供基础资料。
鲨烯环氧酶基因(SQEs)的克隆及其在温度胁迫下与枇杷悬浮培养细胞中熊果酸(UA)含量的相关性
Cloning of Squalene Epoxidase Genes (SQEs) and Correlation Analysis Between Their Expression and Ursolic Acid (UA) Content in Suspension Cells of Loquat (Eriobotrya japonica L.) Under Temperature Stress
李惠华 徐剑 刘小英 王伟 常强 苏明华
2015, 23(4): 481-491  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (837 KB)  ( 552 )
摘要
熊果酸(ursolic acid, UA)是枇杷(Eriobotrya japonica L.)中重要的生物活性成份,鲨烯环氧酶(squalene epoxidase, SQE)是UA等五环三帖生物合成途径中的限速酶之一。为了克隆SQEs基因,寻找枇杷细胞悬浮培养获取UA合适的胁迫温度,建立此胁迫温度下SQEs的差异表达及其与UA含量的联系,本研究以枇杷悬浮培养细胞为材料,在对数生长期中后期设置低温15 ℃和高温35 ℃处理,研究收获时(12 d)细胞生长与目标产物UA的相互关系。同时,采用同源克隆方法分离SQEs,研究15 ℃处理中,两个枇杷鲨烯环氧酶基因(ejSQE1和ejSQE2)的差异性表达。结果表明,ejSQE1(GenBank登录号: JQ294053.2)与ejSQE2(GenBank登录号: JQ294054.2)氨基酸序列的相似度为69.89%,序列的两末端差异最大;15 ℃下,距离收获48 h的处理中UA总含量最高;ejSQE1和ejSQE2的表达量均出现峰值。ejSQE1和ejSQE2的表达量均出现峰值。15 ℃下,距离收获24 h的处理,两者表达量显著下降(P<0.05);距离收获长于24 h的处理,枇杷悬浮细胞中ejSQE1和ejSQE2两个基因的表达量之和以及ejSQE2基因与UA的含量呈现出显著正相关(P<0.05)。本研究获得了SQEs基因序列及胁迫温度下的表达特征,为枇杷细胞悬浮培养UA调控机制的研究提供基因源及参考资料。
二穗短柄草MADS-BOX基因AGL6和FUL1的可变拼接和表达模式分析
Alternative Splicing and Expression Pattern Analyses of Two MADS-BOX Genes AGL6 and FUL1 in Brachypodium distachyon
窦艳华 韩萌萌 孙其信 李海峰
2015, 23(4): 459-468  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (1944 KB)  ( 631 )
摘要
MADS-BOX基因家族是一类调控植物发育的重要转录因子,AGAMOUS LIKE 6(AGL6)和FRUITFULL(FUL1)属于其亚家族。本研究克隆了二穗短柄草(Brachypodium distachyon)2个MADS-BOX基因BdAGL6和BdFUL1的cDNA序列,分析了这2个基因的可变拼接和表达模式。结果表明,BdAGL6基因在转录过程中,由于内含子部分保留机制,发生可变拼接,形成了3个转录本(BdAGL6-1、BdAGL6-2和BdAGL6-3);BdAGL6-3与水稻(Oryza sativa)、玉米(Zea maize)等禾本科植物中的AGL6转录因子序列高度同源;和BdAGL6-3相比,BdAGL6-1在C末端结构域插入额外的7个氨基酸;BdAGL6-2在C末端结构域插入额外的5个氨基酸。qRT-PCR结果显示,BdAGL6在花中高水平表达,其中BdAGL6-3表达最强,BdAGL6-1和BdAGL6-2表达较弱。BdFUL1基因的前体mRNA同样发生了可变拼接,产生2个转录本(BdFUL1-1和BdFUL1-2);两者的表达模式相似,除了在花和茎中表达之外,在幼苗的叶中也有表达。研究结果为进一步了解MADS-BOX基因家族的生物学功能提供了参考资料。
石蒜Ty1-copia类反转录转座子反转录酶基因(RT)的克隆与分析
Cloning and Analysis of Reverse Transcriptase Gene (RT) of Ty1-copia Retrotransposons in Lycoris radiata
周芬静 高燕会 童再康
2015, 23(4): 469-480  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (14579 KB)  ( 258 )
摘要
gaoyanhui408@126.com 摘 要 目前石蒜基因组的进化机制尚不清楚,而反转录转座子是植物基因组进化的主要来源。本研究以二倍体(2n=2x=22)和三倍体(2n=3x=33)石蒜(Lycoris radiata)为实验材料,利用Ty1-copia类反转录转座子反转录酶基因(reverse transcriptase, RT)序列的简并引物克隆RT片段,并对其进行相关分析。其中,从二倍体和三倍体石蒜中分别获得了16条(2RA1~2RA16, GenBank登录号: KP275626~KP275641)和17条(3RA1~3RA17, GenBank登录号: KP275642~KP275658)RT序列。这些序列长度范围为248~266 bp,二倍体石蒜核苷酸序列相似性为49.05%~87.83%,三倍体石蒜为40.75%~89.73%;二倍体石蒜氨基酸序列相似性为18.60%~91.95%,三倍体石蒜为18.07%~88.51%。从这两种石蒜中获得的RT序列均具有多态性和高度异质性,且三倍体石蒜序列差异较二倍体大。33条氨基酸序列构建的N.J.系统进化树,表明二倍体和三倍体石蒜反转录转座子之间不仅发生了横向传递,而且发生了纵向传递,证明石蒜RT序列的分类情况与倍性没有直接相关性。和其他植物的系统进化分析表明石蒜RT序列与草本植物亲缘关系较近,与藻类植物团藻(Volvox carteri)、苔藓植物曲尾藓(Dicranum scoparium)、蕨类植物桂香蕨(Osmunda cinnamomea)和蔺木贼(Equisetum scirpoides);单子叶植物玉米(Zea mays)、小麦(Triticum aestivum)、荸荠(Eleocharis quinqueflora)、铁皮石斛(Dendrobium officinale);双子叶植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)、番茄(Lycopersicon esculentum)、杨树(Populus ciliate)、欧洲云杉(Picea abies)、水葡萄(Beta procumbens)、大豆(Glycine max)同源性较高,且来自于二倍体石蒜的2RA16是石蒜Ty1-copia反转录转座子序列中最古老的一条。此外,研究表明二倍体石蒜很可能是石蒜复合体中的原始类群,三倍体石蒜为同源三倍体。研究结果对石蒜种内进化以及三倍体石蒜的起源有了更深入的了解,为进一步揭示石蒜核型进化机制提供科学依据,同时也为石蒜属的多倍体育种提供了理论基础。
两种不同耐贮性桃果实采后乙烯合成和果实软化相关基因表达的差异
The Difference of Ethylene Biosynthesis and Expression of Softening-related Genes Between Two Peach (Prunus persica) Cultivars with Different Storage Property After Harvest
苏素香 赵彩平 曹丽军 李金金 李芳 韩明玉
2015, 23(4): 450-458  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (876 KB)  ( 544 )
摘要
以商业成熟期的桃(Prunus persica)栽培品种秦王(极耐贮) 和沙红(不耐贮)为试材,采用气相色谱测定乙烯释放量;利用实时荧光定量PCR(quantitative Real-time PCR, qRT-PCR)技术分析乙烯合成关键酶和果实软化相关基因在两个品种中的表达差异。研究结果表明,秦王果实在贮藏期间ACC合成酶基因(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase gene, PpACS1)相对表达量极低,乙烯释放速率也极低,一直保持较高的硬度;而沙红果实在贮藏过程中 PpACS1 的相对表达量随软化进程迅速增加,释放大量乙烯,果实硬度下降快。 秦王果实中ACC氧化酶基因(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase gene, PpACO1)虽有一定的表达量,但没有随贮藏时间而增加;而 PpACO1 在沙红桃中随果实的软化表达量呈显著上升的趋势。 秦王果实中细胞壁降解酶果胶甲酯酶基因(pectin methylesterase gene, PpPME)和多聚半乳糖醛酸酶基因(polygalacturonase gene, PpPG)的表达量都极低;而在沙红果实中其表达量均呈持续增加趋势。此外,秦王果实中扩张蛋白基因(expansin gene, PpEXP)的表达量也较低;而在沙红中表达量较高。N-聚糖加工酶α-甘露糖苷酶基因(α-mannosidase gene, Ppα-Man)和β-氨基己糖苷酶基因(β-hexosaminidase gene, PpHex1, PpHex2)在沙红和秦王贮藏期间均有较高表达量,且秦王中的表达量显著高于沙红(P<0.05)。这表明秦王果实采后不软化是由于 PpACS1 的转录受阻,不能产生乙烯,从而致使细胞壁水解酶 PpPME 和 PpPG 几乎不表达,果胶代谢受阻,因而果实一直保持较高硬度;而沙红果实在采后贮藏中释放大量乙烯,促进了PpEXP、PpPME和PpPG的表达,引起细胞壁果胶的大量降解,导致果实迅速软化。而 Ppα-Man、PpHex1 和 PpHex2 可能不是秦王软化过程的关键基因。本研究为阐明桃果实成熟软化机理及其高效培育耐贮品种提供基础资料。
湖北乌羊与3个地缘邻近山羊品种间的遗传趋异性研究
The Genetic Difference Between Hubei Black Boned-goat (Capra hircus) and the Other Three Neighboring Goat Breeds
赵勤涛 刘桂琼 姜勋平 黄勇富 王党伟 王高富 王建国
2015, 23(4): 521-529  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (872 KB)  ( 454 )
摘要
本研究以波尔山羊(Capra hircus)为外缘,研究湖北乌羊与地缘邻近的酉州乌羊、麻城黑山羊、南江黄羊3个山羊品种间的遗传分化程度及基因流动情况。利用14对单核苷酸多态(single nucleotide polymorphism, SNP)位点对5个品种的基因杂合度(allele heterozygosity, h)、香农指数(Shannon-Weiner index, S)和有效等位基因数(the efficient allelic number, Ne)等反映群体遗传多样性的数据进行分析;通过分析湖北乌羊与其他3个地方山羊品种的基因流动(Nm)、遗传分化(genetic differentiation)情况,研究遗传分化和地理距离(D)之间的关系,并利用遗传距离(Ds)构建5个山羊群体的聚类图。结果表明,在5个山羊品种中,湖北乌羊具有最高的遗传多样性,与其他4个品种间的Nm大小在1.571 6~3.178 7之间,表明基因流动较大;群体间分化系数(Fst)在0.072 9~0.137 2之间,呈中度分化。非加权组平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means, UPGMA)构建的聚类图表明,湖北乌羊与其地缘临近的3个品种间存在较大的遗传分化而自成一支。研究还发现,湖北乌羊与其他3个地方品种间的标准遗传距离与地理距离间存在相关(r=0.934),遗传分化程度与地理距离存在直线相关性。研究结果提示,湖北乌羊与其地地缘临近的3个品种间仍存在较大的遗传分化,且遗传变异丰富,但该种群的快速扩散使其与其他品种间有着较大的基因流动,因此有必要采取保种措施以防止该种质遗传资源被杂交、稀释而丢失。本研究结果为湖北乌羊的保护和选育工作提供了参考依据。
印度梨形孢诱导烟草对黑胫病的抗性及其机理的初步研究
Piriformospora indica Inducing Tobacco Resistance to Black Shank and Its Preliminary Mechanism
彭兵 刘剑 惠非琼 王玉平 高其康 楼兵干
2015, 23(4): 432-440  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (1728 KB)  ( 611 )
摘要
印度梨形孢(Piriformospora indica)是分离自印度塔尔沙漠的植物根系内生真菌,能够诱导多种植物对生物和非生物逆境产生抗性,目前已作为一种模式真菌用于内生真菌与植物互作关系的研究。为了研究印度梨形孢对烟草(Nicotiana tobacum) 抗黑胫病的影响,本研究采用烟草疫霉菌(Phytophthora parasitica var. nicotianae)分别接种根部有印度梨形孢定殖与未定殖的烟草,观察接种后根部有印度梨形孢定殖与未定殖的烟草发病情况,测定抗病相关防御酶苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)的活性变化及抗病相关基因的表达量,并通过平皿对峙试验研究印度梨形孢对烟草疫霉菌生长的影响。结果表明,接种烟草疫霉菌后,根部有印度梨形孢定殖的烟草发病严重度要显著低于对照;接种烟草疫霉菌后第1~10 d,根部有印度梨形孢定殖的烟草叶片中防御酶PAL、POD和PPO活性高于对照,在第1 d,PAL活性是对照烟草的3.99倍,在第2 d,POD活性是对照烟草的1.5倍,在第4 d,PPO活性是对照烟草的2.66倍;实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR, qRT-PCR)结果显示,接种烟草疫霉菌后第6~96 h,根部有印度梨形孢定殖的烟草叶片中抗病相关基因PR1b、P450-2、hrs203J、NmIMSP和P450-1的表达量高于对照;在第12 h,PR1b、P450-2、 hrs203J的表达量分别是对照烟草的3.8、15.7和3.1倍,在第48 h,NmIMSP的表达量是对照烟草的2.6倍,在第72 h,P450-1的表达量是对照烟草的1.5倍;平皿对峙试验结果显示印度梨形孢对烟草疫霉菌的生长没有抑制、重寄生作用。研究结果表明,印度梨形孢可显著提高烟草对黑胫病的抗性,对黑胫病的抗性不是通过印度梨形孢分泌的抗菌物质实现的,是与烟草中抗病相关基因表达量的上升、防御酶活性的提高有关。本研究初步揭示了印度梨形孢诱导烟草抗黑胫病的相关机理,为进一步深入研究烟草黑胫病的生物防治及其机理提供基础资料。
黄芩苷对热应激犊牛睾丸支持细胞胶质细胞源性神经生长因子(GDNF)和干细胞因子(SCF)表达的影响
Baicalin Affects Glial Cell Line-derived Neurotrophic Factor(GDNF) and Stem Cell Factor (SCF) Expression in Heat-stressed Calf (Bos taurus) Sertoli Cells
国晓瞳 张倩 于枫 李华涛 丛霞 曹荣峰 田中杰 于文慧 田文儒
2015, 23(4): 441-449  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (999 KB)  ( 472 )
摘要
黄芩苷(baicalin)具有清热镇静、抑菌抗炎等作用,通过不同浓度黄芩苷对热应激下睾丸支持细胞(sertoli cells, SCs)表达胶质细胞源性神经生长因子(glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF)和干细胞因子(stem cell factor, SCF)的影响,探讨黄芩苷是否可以通过提高SCs的耐热性保护细胞,提高SCF与GDNF的表达。采用二步酶消化法分离犊牛(Bos taurus)睾丸组织获得SCs,4 h差速贴壁纯化,分别采用 RT-PCR鉴定标志性基因GDNF和SCF的表达,福尔根染色鉴定细胞形态。选用第3代对数生长期的SCs,通过噻唑蓝(methyl thiazoletetrazolium, MTT)筛选黄芩苷安全使用浓度;设对照组(37 ℃)、42 ℃单纯热应激组和42 ℃热应激加黄芩苷(0.1, 1, 10和20 μg/mL)组;用MTT检测细胞存活率,提取各组细胞总RNA和总蛋白,分别用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR, qRT-PCR)和酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测GDNF和SCF mRNA及其蛋白的表达。结果显示,第3代原代细胞生长良好,RT-PCR检测可见GDNF和SCF mRNA表达,福尔根染色显示有卫星核小体存在,表明分离培养的细胞为SCs。对第3代SCs进行热应激处理,与对照组(37 ℃)比较,42 ℃单纯热应激组细胞存活率极显著(P<0.01)下降,GDNF和SCF mRNA(P<0.01)与蛋白(P<0.05)的表达也降低。与42 ℃单纯热应激组比较,用浓度为1 μg/mL (P<0.05)和10 μg/mL(P<0.01)黄芩苷作用细胞的存活率升高;浓度在0.1~20 μg/mL黄芩苷作用的细胞,其GDNF和SCF mRNA的表达量均极显著(P<0.01)高于42 ℃单纯热应激组,而在黄芩苷浓度为1 μg/mL时,SCF(P<0.01)和GDNF(P<0.05)蛋白表达量高于42 ℃单纯热应激组,并且基因和蛋白的表达量随着黄芩苷浓度的增加呈现先上升后下降的趋势。结果表明,黄芩苷能提高热应激下SCs的存活率以及GDNF和SCF的表达量。本实验从分子水平研究黄芩苷对SCs的抗热作用,为在实践中增强机体抗热休克能力提供了理论依据。
高效纤维素降解菌的筛选及复合菌系的构建
Screening of Highly Efficient Cellulose Degradation Microbes and Construction of Composite Strains
王海滨 韩立荣 冯俊涛 张兴
2015, 23(4): 421-431  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (2738 KB)  ( 924 )
摘要
本研究旨在筛选高效纤维素降解菌,组建复合菌系,用于堆肥接种剂的开发。通过纤维素刚果红选择性培养基,从腐殖土、堆肥样品中分离高效纤维素降解常温菌和耐高温菌。经过羧甲基纤维素酶活(carboxymethyl cellulase, CMCase)、滤纸条崩解能力、对稻杆及苦参(Sophora flavescens Ait.)残渣在液态和固态发酵条件下的降解能力测定逐级淘汰,筛选高效菌株组建复合菌系。研究结果表明,通过拮抗作用、单一菌株在复合菌系中作用测定,最终构建了由3 株细菌(弗留明拜叶林克氏菌(Beijerinckia fluminensis)、微杆菌(Microbacterium sp.)和芽胞杆菌(Bacillus sp.)),1 株链霉菌(Streptomyces sp.)和1 株毛壳菌(Chaetomium sp.)组成的木质纤维素降解高效复合菌系。供试菌株在液态发酵条件下对稻杆和苦参残渣的降解效果明显强于固态发酵,稻杆比苦参残渣更容易被大多数微生物降解,供试真菌在稻杆和苦参残渣的降解中普遍表现出较高的降解效果。筛选得到弗留明拜叶林克氏菌XM-3可以在48 h内将滤纸条完全崩解,复合菌系在固态发酵20 d后对苦参残渣和稻秆的降解率分别达到31.4%和63.1%。本研究对堆肥接种剂的开发具有参考和借鉴意义。
龙茭2号耐冷相关差异表达蛋白鉴定及分析
Identification and Analysis of Differential Expression Proteins Realated to Chilling Tolerance in Longjiao 2 (Zizania latifolia)
金晔 崔海峰 安欣欣 李帅 俞晓平 叶子弘
2015, 23(4): 502-512  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (8363 KB)  ( 252 )
摘要
茭白(Zizania latifolia)是我国南方重要的水生蔬菜,温度对其田间生产具有较大的影响。以浙江省主栽双季茭白品种浙茭911为对照,采用双向电泳技术(two-dimensional electrophoresis, 2-DE)对茭白耐冷栽培品种龙茭2号叶片的差异表达蛋白进行比较鉴定分析,获得蛋白点数分布在822~955,差异蛋白点筛选表明,低温及恢复处理中,龙茭2号差异表达蛋白上调数量均高于浙茭911,差异表达蛋白下调数量均低于浙茭911;质谱成功鉴定了6个耐冷相关差异表达蛋白:IAA(indole acetic acid)生长素水解酶(IAA auxin amido hydrolase, IAA-AH)、甲酸四氢叶酸连接酶(putative formate-tetra-hydrofolate ligase, FSH)、苹果酸脱氢酶malate dehydrogenase, MDH)、6-磷酸甘露糖还原酶(mannose-6-phosphate reductase, M6PR)、ATP合成酶(ATP synthase CF1 alpha chain, ATPase)和分子伴侣cpn60-1(chaperonin cpn60-1, cpn60-1),分别与植物激素代谢、核酸合成、能量代谢、光合作用及蛋白折叠等功能相关。IAA-AH、MDH和分子伴侣cpn60-1在两个茭白品种中均表现出低温处理后表达量上调,恢复处理后表达量下调,其他3个蛋白在两个品种间表达变化存在差异;5 ℃低温处理时,龙茭2号中差异蛋白表达较为稳定,并能较好地恢复至对照水平。基于茭白转录组测序信息查询,克隆获得6个差异蛋白点相关基因的编码区序列并进行了荧光定量PCR验证分析。本研究从蛋白和分子水平阐明了双季茭白龙茭2号耐冷相关的部分蛋白及其表达变化,有助于揭示龙茭2号孕茭特性及其耐冷机制,为田间选育不同采收期的茭白耐冷新品种提供理论依据。
猪MiR-148a对肝脏发育调控的初步研究
Preliminary Research of MiR-148a Regulating Porcine Liver Development
李艳华 赵俊生 周辉云 徐宁迎
2015, 23(4): 513-520  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (568 KB)  ( 2971 )
摘要
miR-148a是miR-148/152家族中的一员,对细胞增殖、细胞分化、癌症发生等生物过程有重要的调控作用。本研究采用Real-time quantitative PCR(qRT-PCR)方法,定量检测miR-148a在金华猪(Sus scrofa)不同发育时期肝脏中的表达变化,结果显示,miR-148a在胚胎期的肝脏中表达量最高;出生后,随着日龄的增加表达量逐渐降低;为了了解miR-148a的生物学功能和过程,对其进行GO (gene ontology)功能注释和KEGG (kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路分析。结果显示,miR-148a参与肝脏的生长发育调控过程。为了验证miR-148a的靶基因,利用胎鼠(Mus musculus)肝细胞构建miR-148a过表达和抑制表达的细胞模型,以此来探究miR-148a的表达变化对靶基因在mRNA水平的影响。结果发现,在小鼠胎肝细胞中过表达miR-148a可以显著降低CCAAT增强子结合蛋白α基因 (CCAAT-enhancer binding protein-alpha, Cebpa)的表达量(P<0.05)。进一步检测发现,在金华猪肝脏生长过程中Cebpa与miR-148a的表达呈负相关。根据这些结果推测,miR-148a可能在肝脏发育过程中通过降低Cebpa的表达来调控细胞增殖和分化效应之间的平衡。
研究资源与技术改进
稳定表达猪SARM1的MARC-145细胞系的建立
Establishment of a MARC-145 cell line expressing Porcine (Sus scrofa) SARM1
周翔 纪立凯 李振红 王鹏 刘榜
2015, 23(4): 538-545  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (1218 KB)  ( 578 )
摘要
猪(Sus scrofa)SARM1基因是重要的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)候选基因,建立稳定表达SARM1的猴胚胎肾上皮细胞系(MARC-145)是进行SARM1功能研究的基础。本研究成功构建pEGFP-N1-pSARM1真核表达载体,并在MARC-145细胞中瞬时转染,结果显示,猪SARM1-GFP融合蛋白定位于MARC-145细胞的线粒体。使用浓度为800 μg/mL的G418对转染pEGFP-N1-pSARM1的细胞进行加压筛选6 d,并进一步使用单克隆法筛选出稳转细胞系,结果显示,稳转细胞系形态正常,绿色荧光稳定表达。RT-PCR和Western blot检测结果均显示SARM1基因在稳转细胞系中稳定表达。应用qRT-PCR方法在PRRSV感稳转细胞系12 h后可以检测到PRRSV开放阅读框7(open reading frame 7, ORF7)在稳转细胞系中表达,并且稳转细胞系中ORF7的表达量在感染后12、24和48 h极显著低于普通MARC-145细胞中的表达量(P<0.01)。组织半数感染量(50% tissue culture infective dose, TCID50)测定进一步证明PRRSV在稳转细胞系中复制能力较低。本研究为进一步开展猪SARM1在PRRSV感染过程中的功能研究提供了基本材料。
三丁基膦(TBP)和二硫苏糖醇(DTT)在秦川牛肌肉组织双向电泳中使用效果的差异及原因分析
Comparison of Tributyl phosphine (TBP) and DL-Dithiothreitol (DTT) for Two-dimensional Gel Electrophoresis(2-DE) of Qinchuan Cattle (Bos taurus) Longissimus Muscle Tissue
郝瑞杰 赵宪林 李安宁 王嘉力 赵春平 王洪宝 成功 杨武才 昝林森
2015, 23(4): 546-553  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (4411 KB)  ( 561 )
摘要
合适的还原剂对蛋白的完全溶解以及较好双向电泳结果的获得至关重要。三丁基膦(tributyl phosphine, TBP)通常被认为是比二硫苏糖醇(DL-Dithiothreitol, DTT)更为有效的还原剂。本实验首次从图谱质量和蛋白分布两个方面,详细对比了TBP和DTT在秦川牛(Bos taurus)肌肉组织全蛋白和肌质蛋白双向电泳中的使用效果。结果表明,和TBP相比无论是全蛋白还是肌质蛋白,使用DTT作为还原剂的图谱背景均更为清晰,分辨率更高,对高分子量蛋白以及低丰度蛋白的提取也更为有效。因此,DTT比TBP更适用于秦川牛肌肉组织双向电泳。本研究的结果和传统的观点并不一致,初步分析了该原因,可能是TBP较短的半衰期导致了其在双向电泳中较差的使用效果。该实验为双向电泳的样品制备以及牛肌肉组织蛋白质组学研究提供了技术资料。
基于M蛋白检测犬瘟热抗体ELISA方法的建立
Establishment of an Indirect ELISA Based on Matrix Protein of Canine distemper virus
张敏 黄京书 娄亚萍 赵阿勇 王晓杜
2015, 23(4): 554-560  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (1045 KB)  ( 444 )
摘要
犬瘟热病毒(Canine disremper virus, CDV)是导致犬科等多种属动物发热、腹泻、幼仔死亡等症状的传染病病原体,建立针对CDV的快速灵敏的诊断方法对于该病的防治具有重要意义。本研究利用RT-PCR方法扩增得到CDV-M基因,构建原核重组表达载体pET-28(a)-CDV-M,并在大肠杆菌(Escherichia coli)中实现了该蛋白的表达和纯化,Western blot验证重组蛋白的抗原性,用纯化的重组蛋白his-CDV-M作为抗原包被酶标板,ELISA方阵实验确定该重组蛋白的包被浓度,建立了检测临床犬血清样品的CDV-M蛋白抗体的间接ELISA方法,比较本实验方法与其他试剂盒之间的特异性和灵敏性。结果表明重组蛋白his-CDV-M得到较好表达,纯化后蛋白浓度为2.840 mg/mL。Western blot结果表明重组抗原能与犬瘟热阳性血清进行反应。方阵实验确定抗原最佳工作浓度为8.88 μg/mL,抗体最佳稀释度为1∶160,应用本方法检测223份犬血清样品,与进口CDV诊断试剂盒检测结果符合率为96%。本研究建立的基于M蛋白的犬瘟热病毒抗体检测方法具有较高的特异性和灵敏性,为犬瘟热病毒的诊断及M蛋白的功能研究提供了工具。
研究评述与展望
钙-钙调素信号通路调节热应激蛋白70表达的机制
The Mechanism of Calcium and Calcium-activated Calmodulin Modulating the Expression of Hsp70
齐晓楠 赵园 田文儒
2015, 23(4): 530-537  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (638 KB)  ( 3365 )
摘要
随着温室效应的加剧,全球气候变暖已经成为现代畜牧业生产体系所面临的严峻挑战。高温炎热气候已成为影响畜禽生长繁殖的一种主要的非生物胁迫。热应激刺激时,动物体产生一系列生理变化来提高机体的耐受性,而本文旨在阐述钙(calcium, Ca2+)-钙调蛋白(calcium-activated calmodulin, CaM)参与的耐热信号的转导机制,即热应激蛋白(heat shock proteins, Hsps)的表达机制。热应激时,细胞内Ca2+浓度上升,激活CaM及其表达量的增加,随即CaM作用于其下游的2种靶蛋白,即2条信号转导支路来提高热激转录因子1(heat shock factor 1, HSF1)的转录活性,进而调节热应激蛋白70(Hsp70)的表达。热应激时,Hsps表达的2条具体通路:① Ca2+-CaM激活下游的靶蛋白—钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ, CaMKⅡ),CaMKⅡ通过促进HSF1(230)的磷酸化来提高HSF1的转录活性,进而诱导Hsp70的表达;② Ca2+-CaM激活下游另一个靶蛋白Hsp70,Hsp70通过与增多的CaM形成复合物,释放HSF1单体,增多的HSF1形成有活性的HSF1三聚体,并入核与热激元件(heat shock element, HSE)结合,使HSF1具有转录活性,进而诱导Hsp70的表达。本文系统完整地综述了Ca2+-CaM-HSF1-Hsp70热应激信号系统,在感受、传导和响应热应激刺激时的机制。
 
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