黑麦属(Secale)物种是改良小麦条锈病抗性的优良供体，为发掘和利用黑麦属野生种非洲黑麦(S. africanum)所携带的优异抗小麦条锈病基因，本研究在硬粒小麦(Triticum durum)-非洲黑麦双二倍体(基因组为AABBRaRa)和小麦(T. aestivum)杂交的高代材料中发现了一个免疫条锈病的株系HH41。HH41的体细胞染色体数目为2n=42。用小麦D基因组特异重复序列pAs1和秦岭黑麦(S. cereale)基因组总DNA作为探针的顺序原位杂交分析表明，HH41中一对小麦6D染色体被一对非洲黑麦6Ra染色体所代换。利用开发的基于表达序列标签的6R/6Ra特异分子标记也证实了HH41缺少6D特征带，具有6Ra特征带，是6Ra(6D)代换系。条锈菌生理小种(Puccinia striiformis Eriks. f. sp. tritici)接种鉴定结果表明其抗条锈病性源自6Ra染色体。本研究还综合利用分子细胞学证据将来自非洲黑麦的6Ra染色体与栽培黑麦的6R染色体的多态性进行了比较，证实了6Ra(6D)代换系HH41是一种具有古老野生黑麦优异抗性的特殊珍贵材料，是创造异易位系、实现外源基因转移和改良小麦的重要资源

Penicillium expansum是果蔬采后主要的病原真菌，对果蔬的贮藏具有极大的危害，寻找有效的防治方法具有重要的意义。本研究对苹果(Malus domestica)青霉病菌进行了分离及rDNA-ITS法鉴定，确定为P. expansum；利用不同浓度的外源一氧化氮(NO)处理病菌，通过孢子萌发率、芽管长度、菌丝扩展速度等指标以及苹果接种实验，研究了外源NO与P. expansum发育及致病力的关系，并通过进行胞内活性氧水平、蛋白质羰基化、丙二醛(MDA)及ATP含量的检测，对NO的作用机理进行了初步的探索。结果表明，外源NO可以显著抑制P. expansum的发育，且浓度越高抑制作用越强，其抑菌机理可能是通过诱导P. expansum胞内活性氧积累引起氧化损伤。本研究为果蔬采后病原菌的防治提供了新的思路

本文先概述了动物DNA条形码技术的研究现状，统计分析了DNA条形码研究中所选用的基因序列和研究对象等，发现目前并没有DNA条形码技术应用于地方猪的研究报道；随后，分析我国地方猪种的系统发育研究现状表明，当前中国地方猪的分类体系在分子上的证据还很匮乏，研究所涉及的品种较少，分子标记数量有限，分子系统发育学的研究才刚起步；最后，阐述和讨论了DNA条形码技术应用于中国地方猪种保护中的重要意义及其可行性。

启动子是基因表达调控的关键顺式作用元件，也是基因工程表达载体的一个重要元件。对启动子结构和功能的阐释，有助于基因表达的时空控制。选择恰当方法克隆序列未知的启动子有着非常重要的意义和广阔的应用前景。随着PCR技术的问世，基于PCR扩增的染色体步移技术进行启动子克隆具有较好的可操作性，其在基因的分子生物学和基因工程研究方面也是一项重要的技术策略。本文讨论了近年来以PCR为基础的染色体步移技术克隆启动子的方法，主要包括反向PCR、接头介导PCR、半随机引物PCR三大类，归纳比较了其克隆原理和研究进展，为克隆已知序列旁侧未知启动子序列提供参考。

印度梨形孢(Piriformospora indica)是一种根部内生真菌，能够促进许多植物的生长，提高作物的产量，而且还能诱导植物产生对生物或非生物胁迫的抗性。为了研究印度梨形孢对油菜(Brassica napus L.)抗旱性的影响，本研究用20%的聚乙二醇6000(PEG)对有印度梨形孢定殖和无印度梨形孢定殖的油菜植株进行模拟干旱胁迫处理，分析两者在受干旱胁迫后丙二醛(MDA)含量、相对电导率大小、脯氨酸(Pro)含量、抗氧化酶(超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT))活性以及干旱相关基因表达水平的差异。结果表明，接种印度梨形孢的油菜植株叶片中MDA含量和相对电导率均显著低于未接种印度梨形孢的油菜植株；Pro含量显著高于未接种印度梨形孢的油菜植株，在PEG处理后的第72小时，接种印度梨形孢的油菜叶片中Pro含量是未接种印度梨形孢的油菜的1.3倍；SOD、POD和CAT活性明显高于未接种印度梨形孢的油菜植株，PEG处理后的第24小时SOD、POD和CAT活性分别是对照油菜的1.17、1.38和1.27倍。RT-PCR分析表明，干旱胁迫下有印度梨形孢定殖的油菜叶片中编码合成脂质转运蛋白的基因575表达上调，PEG处理后的第9小时其表达量是对照的3.2倍。本研究研究结果表明印度梨形孢提高油菜对干旱胁迫的抗性与MDA含量、质膜透性、Pro含量、抗氧化酶活性和干旱相关基因的表达相关，印度梨形孢可能是通过提高油菜整体抗氧化能力、维持细胞生物膜完整性和细胞内渗透压以及降低膜脂的过氧化水平，从而增强了油菜对干旱胁迫的抗性。本研究初步明确了印度梨形孢提高油菜抗旱性的作用与部分机理，为深入研究印度梨形孢提高油菜的抗逆性作用及其机理提供基础资料。

p53是一种肿瘤抑制基因，在细胞周期阻滞、细胞凋亡、衰老和自噬过程中发挥着调控作用，在机体的各个组织中广泛表达。本研究旨在构建牛p53基因真核表达载体并研究其在牛卵母细胞中的表达和定位。首先从牛(Bos taurus)卵丘细胞中克隆了p53基因并将其连接到pMD19-T载体上，双酶切鉴定后定向连接到pVenus载体上构建了pVenus-p53真核表达载体，经脂质体2000介导转染Hela细胞，确定重组质粒在Hela细胞中的表达定位，主要定位于细胞核。然后用体外转录试剂盒将p53-Venus转录成cRNA，通过显微注射观察其在卵母细胞中的表达定位情况，主要定位于细胞核，但胞质中也有少量表达。最后，取体外培养不同时期的牛卵母细胞，通过实时定量PCR检测p53在体外培养不同时期的表达量的变化，采用2-ΔΔCt法分析p53/β-actin表达水平的变化值，p53的表达从GⅤ期到MⅠ期迅速升高，在MⅠ期其表达量达到最高，随后又逐渐降低。本研究构建了牛p53真核表达载体pVenus-P53，并且体外转录的p53-Venus cRNA能在牛卵母细胞中正确表达定位，检测了p53在牛卵母细胞成熟培养各个时期表达量的变化，为进一步研究p53在牛卵母细胞体外成熟中的作用提供了参考资料。

甘露糖结合蛋白(MBP)是一类包含B-lectin结构域的植物凝集素，通过与糖的结合参与多种生理过程，包括细胞和细胞之间的相互作用以及寄主和病原之间的相互作用等。为了探讨苹果甘露糖结合蛋白在抗轮纹病防御反应中的作用，本研究从苹果(Malus demestica)枝条韧皮部cDNA鉴定了一个甘露糖结合蛋白的编码基因，命名为MdMBP2(GenBank accession No. JX126857)。该基因全长1 553 bp，开放阅读框为1 368 bp，编码一个由455个氨基酸残基组成的蛋白质，分子量和等电点分别为50.4 kD和8.68。该蛋白的氨基酸序列包含保守的B-lectin结构域，N端有27个氨基酸残基组成的信号肽，C端有一个PAN-apple结构域。同源性和系统演化分析显示，MdMBP2蛋白与葡萄(Vitis vinifera)和大豆(Glycine max)的表皮分泌蛋白(EP)及拟南芥(Arabidopsis thaliana)的甘露糖结合蛋白具有较高的序列相似性。包含B-lectin结构域的蛋白可以分成两个群，MdMBP2属于ClassⅠ，与ClassⅡ蛋白相比，ClassⅠ缺少SLP结构域和蛋白激酶结构域。利用荧光定量PCR技术检测MdMBP2基因的表达，发现MdMBP2基因在被检测的几种组织中均有不同程度的表达，但在皮和叶中的表达量较高，这种表达模式表明，MdMBP2可能参与多种生理途径。另外，轮纹病病原菌(Botryosphaeria dothidea)侵染能诱导MdMBP2转录本的积累，且其时序表达变化与轮纹病发病过程相关，暗示该基因参与了苹果抗轮纹病的防御反应。通过体外重组表达MdMBP2基因的重组蛋白，并用重组蛋白进行糖结合实验，发现MdMBP2蛋白能与真菌细胞壁组分高甘露糖型聚糖和甘露寡糖有较高的结合活性，表明MdMBP2蛋白可能参与病原真菌的识别。本研究分离鉴定了一个新的苹果甘露糖结合蛋白的编码基因，认为该基因参与苹果对轮纹病病原的防御反应，可能在寄主对病原的识别过程中发挥作用。

为了研究决定藏羊不同颜色被毛形成的分子机制，首先对绵羊(Ovis aries)毛色的主要候选基因刺鼠信号蛋白基因(agouti signaling protein (ASIP) gene，Agouti)的多态性进行了检测，然后对该基因外显子2和外显子4的功能突变和该基因的拷贝数变异分别与毛色进行了相关性分析；同时开展实时荧光定量PCR检测皮肤组织中Agouti和小眼畸形相关转录因子基因(microphthalmia-associated transcription factor，MITF)mRNA的相对表达量，分析同一基因在黑色眼圈、棕黑色颈部和白色体侧被毛皮肤组织的相对表达量差异，对两基因在同一个体同一颜色被毛皮肤组织表达量进行相关性分析。结果表明，Agouti基因的外显子的单核苷酸多态性(SNP)多态性与毛色不相关，该基因的拷贝数变异(CNV)与毛色也不相关。同一个体Agouti基因mRNA表达水平为棕黑色皮肤组织显著高于黑色和白色(P<0.05)，MITF基因mRNA表达量为黑色皮肤组织显著高于棕黑色和白色(P<0.05)。通过相关性分析得知，两基因在同一个体同一毛色皮肤组织内mRNA相对表达量无显著相关性。研究结果提示，Agouti基因的多态性与藏羊的毛色不具有相关关系，MITF基因mRNA表达量可能与藏羊眼圈周围黑色被毛相关，Agouti基因mRNA表达量、MITF基因mRNA表达量可能对颈部棕黑色被毛有一定作用，体侧部的白色毛与Agouti和MITF基因mRNA表达量无明显相关。

为阐明PsPⅡ基因与牡丹花芽休眠解除的关系，选用山东菏泽牡丹基地4年生牡丹(Paeonia suffruticosa) '鲁荷红'健壮植株的花芽，获得了PsPⅡ基因的全长，在不同低温时间处理下研究PsPⅡ基因的表达变化及植株的生理生化变化。结果表明，通过拼接得到899 bp的PsPⅡ全长cDNA。其中，5'非编码区(UTR)为70 bp，3' UTR为226 bp，包括24个碱基的poly(A)尾，含有一个603 bp的完整的ORF，编码200个氨基酸；对 PsPⅡ全长cDNA进行生物信息学分析，预测牡丹PⅡ蛋白是一种亲水蛋白，而且与谷氨酰胺合成酶的功能密切相关；同源性分析得出，与牡丹PⅡ蛋白同源性最高的是水稻的PⅡ类蛋白，同源性达83.6%，其次为烟草、拟南芥和松树。实时荧光定量PCR分析结果显示，随着感受低温天数的增加，在整个牡丹内休眠解除的进程中，PsPⅡ基因的表达量不断增加，当低温处理15 d时，该基因的表达量达到最高；相关分析表明，PsPⅡ基因表达水平与α-淀粉水解酶、谷氨酰胺合成酶、可溶性碳水化合物含量均呈显著正相关，表明PsPⅡ在牡丹花芽休眠解除过程中的作用是通过影响酶活性参与休眠解除过程中营养物质的代谢。

植物寄生线虫食道腺分泌蛋白在寄生致病过程中起到至关重要的作用。用 RT-PCR 结合 RACE 的方法从马铃薯腐烂茎线虫 (Ditylenchus destructor)中克隆了一个类毒液过敏原蛋白新基因 Dd-vap-1。 Dd-vap-1 cDNA 全长 1 346 bp，开放阅读框的长度为1 209 bp，推导编码一个含有 402 个氨基酸的蛋白序列(GenBank登录号JQ341057)。推导蛋白Dd-VAP-1预测分子量为 45.3 kD，等电点为 6.68，序列比对分析表明，Dd-VAP-1为富含半胱氨酸分泌蛋白家族成员。原位杂交结果显示，Dd-vap-1在马铃薯腐烂茎线虫的亚腹食道腺细胞特异表达，推测该基因在马铃薯腐烂茎线虫侵染甘薯的早期阶段起重要的作用。

为探讨高、低脂肉鸡肝脏脂肪合成代谢的差异，本研究以东北农业大学肉鸡高、低腹脂双向选择品系第14世代鸡群为实验材料，利用实时荧光定量PCR方法，比较了乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)、固醇调控元件结合蛋白1(SREBP1)、肝X受体(LXR)、甘油磷酸酰基转移酶(GPAT)、载脂蛋白A-1(ApoA-1)、葡萄糖转运蛋白2(GLUT2)和载脂蛋白B(ApoB) 8个与脂肪合成代谢相关的基因在1~12周龄高、低脂系肉鸡肝脏中的表达模式和表达差异。结果显示，从总体上看，ACC、FAS、SREBP1、LXR、GPAT和ApoA-1基因在高脂系鸡肝脏中的表达量高于低脂系鸡的表达，其中，ACC、FAS和SREBP1基因在第10周龄高脂系鸡中的表达量均极显著高于低脂系鸡(P<0.01)；LXR基因在第9和10周龄高脂系鸡中的表达量极显著高于低脂系鸡(P<0.01)；ApoA-1基因在第6、8和10周龄高脂系鸡中的表达量极显著高于低脂系鸡(P<0.01)，在第11周龄高脂系鸡中的表达量显著高于低脂系鸡(P<0.05)；同时，研究发现，GLUT2基因在第5、8周龄低脂系鸡的表达量显著高于高脂系鸡(P<0.05)，并且ApoB基因在7周龄低脂系鸡肝脏的表达量也显著性的高于高脂系鸡(P<0.05)。本研究表明，高、低脂系肉鸡肝脏脂肪合成相关基因的表达存在着明显的差异，高脂系肉鸡肝脏具有更强的脂肪合成能力。本研究结果为进一步揭示肉鸡脂肪性状形成的分子机制提供了基础研究资料。

前期对固始鸡1日龄和36周龄下丘脑miRNA的Solexa测序分析表明，let-7a为鸡(Gallus domesticus)下丘脑发育过程高丰度差异性表达miRNA。为全面了解鸡let-7a的功能，采用实时定量PCR检测了1日龄和36周龄固始鸡两个发育阶段13种组织中let-7a的表达情况。结果表明：let-7a在所检测的组织中呈广泛性表达，其在下丘脑中的表达趋势与高通量测序结果一致；1日龄时，let-7a在下丘脑和肾脏中高丰度表达，在肺中低丰度表达，其他组织中适度表达；36周龄时，let-7a在各组织中的表达量都较低，除了在肺中的表达量较1日龄上升外，其余各组织的表达量都下降。同时，采用两种算法预测了let-7a的靶基因，并对107个共有靶基因进行了基因本体功能(GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG) 通路分析，结果显示：靶基因主要在生物学过程调节相关的生物学过程中富集，尤其是与矿物质和磷代谢相关的调节过程；且在粘着斑、细胞外基质受体互作、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路等3个通路中显著富集(P<0.01)。这些结果为进一步研究let-7a功能提供了有益线索。

唐菖蒲伯克霍尔德菌洋葱致病型(Burkholderia gladioli pv. alliicola)，是重要的植物病原细菌检疫性有害生物。本研究的目的是建立特异、灵敏、快速的 TaqMan 探针荧光定量 PCR 方法用于检测洋葱腐烂病菌(B. gladioli pv. alliicola)。利用洋葱腐烂病菌保守基因序列设计和筛选特异性引物和TaqMan探针，优化PCR反应体系和反应条件。荧光定量PCR菌液检测灵敏度达到1.02×102 CFU/mL，DNA检测灵敏度达到1.73×10-4 ng/μL，反应时间仅需1 h左右，对14种伯克氏菌属(Burkholderia)参比菌种的特异性检测结果显示，洋葱腐烂病菌具有明显的扩增曲线生长，表明建立的荧光定量PCR体系具有非常高的特异性。同时对洋葱(Allium cepa)种子进行了模拟带菌检测，结果表明，建立的洋葱腐烂病菌荧光定量PCR检测体系能够检出模拟样品中的洋葱腐烂病菌，验证了检测体系的实用性。本研究建立的洋葱腐烂病菌荧光定量PCR检测体系能够有效用于洋葱腐烂病菌的鉴定，为进出口口岸和基层检验检疫部门提供了一种简便、快速、准确的洋葱腐烂病菌分子检测手段。

泡菜中乳酸菌(Lactobacillus plantarum)活菌的数量是评价其营养价值的重要指标。DNA染料(Ethidium bromide monoazide, EMA)结合定量PCR(EMA-qPCR)是一种定量活细胞快速有效的方法。本研究建立了快速精准的检测泡菜中乳酸菌活菌的EMA-qPCR方法。对于乳酸菌死菌，EMA浓度为10 μg/mL时，ΔCt值(经EMA处理-未经EMA处理)最大，而乳酸菌的ΔCt值在不同EMA浓度下(10, 25, 50 和 100 μg/mL)没有显著差异(P>0.05)。并且，随着10 μg/mL EMA的光活化时间由0 min增加到20 min，ΔCt值也随之增加，但是这种现象没有在活细胞中产生，所以EMA处理不会影响活细胞计数。因此最适宜的EMA处理条件(10 μg/mL，光照20 min)可以有效的区分乳酸菌活细胞和死细胞。在此条件下EMA-qPCR方法(活乳酸菌数量分别为109、108、107、106、105 和 104 CFU/mL)与平板计数法的检测结果相关性良好(R2=0.999)，PCR效率为104%。由于泡菜中乳酸菌随着发酵时间延长会出现亚致死性损伤，EMA-qPCR方法会低估活菌的数量，在检测前将菌体在MRS培养基中孵育30 min会完全消除这种偏差。本实验建立的EMA-qPCR方法，可成功地检测不同发酵时间泡菜中乳酸菌活菌的数量。通过摸索适宜条件，这种检测死活菌的方法可应用到更多的食品与环境检测中。