拷贝数变异(copy number variation, CNV)是近年来发展起来的和SNP互补的一种重要的基因组遗传变异形式。它不仅与畜禽的疾病及发育异常有关，还与许多体型外貌特征及经济重要性状相关联。联合使用SNP 和CNV这两种遗传标记，将为深入理解畜禽复杂性状的分子机制和遗传基础提供新的思路，并在标记辅助育种中有着广阔的应用前景。全基因组范围内的CNV研究的技术方法主要有比较基因组杂交芯片(CGH)、高密度SNP分型芯片及基于近年来正在兴起的新一代测序技术的全基因组重测序，对于已经检测出的CNV，根据序列特点可以采用基于PCR和杂交的技术方法对其基因型进行判定。2008年以来，利用CGH芯片、高密度SNP芯片和新一代测序等技术对畜禽的基因组CNV开展了一系列研究。本文综述了目前全基因组范围内CNV检测方法及特定CNV的分型方法，并列举了CNV在畜禽中的所取得的一系列研究进展，为从事同类研究的人员提供一定的参考资料。

成熟脂肪细胞在天花板培养(ceiling culture)条件下可自发去分化为不含脂滴的成纤维细胞(dedifferentiated fat cell, DFAT)，这种细胞体外可向多个谱系分化，因此近年来备受人们关注。为研究猪成熟脂肪细胞去分化过程中关键基因表达规律，本研究先分离、鉴定了猪成熟脂肪细胞，然后采用一种新的天花板培养法使其发生去分化，再用实时定量PCR(RT-qPCR)技术分析了猪成熟脂肪细胞去分化过程中关键基因的表达变化，最后用1 μmol/L罗格列酮(Rosiglitazone)处理猪成熟脂肪细胞，研究增强成脂对去分化的影响。结果显示：分离的猪成熟脂肪细胞的纯度高达98.7%，并且新式天花板培养法能够高效的使其发生去分化；在去分化的过程中中后期成脂关键基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ (PPARγ)、脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(aP2)和脂蛋白酯酶(LPL)的mRNA水平分别上调了8、3和7.5倍，而脂肪分解关键基因激素敏感脂酶(HSL)和脂肪组织甘油三酯脂肪酶(ATGL)的mRNA水平分别上调了40倍和10倍；罗格列酮处理能够显著抑制猪成熟脂肪细胞去分化(P<0.05)。这些结果说明，成熟脂肪细胞去分化是一个以脂解为主并伴有一定水平成脂的脂代谢过程，这为进一步研究成熟脂肪细胞去分化机理提供了理论依据。

为阐明miR-128a在大鼠前体脂肪细胞分化过程中的功能，本实验检测了大鼠(Rattus norvegicus)前体脂肪细胞成脂分化过程中miR-128a的表达，明确其在分化过程中的表达趋势；构建miR-128a的腺病毒过表达载体并侵染大鼠前体脂肪细胞，随后采用Real-time PCR和Western blot分别在mRNA和蛋白水平检测了成脂标记基因过氧化物酶体增生物激活受体γ (peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ)和脂肪酸结合蛋白2 (adipocyte protein 2, aP2)的表达；过表达miR-128a的大鼠前体脂肪细胞在第10天进行油红O染色，从形态学上观察成脂分化情况。结果显示，miR-128a的表达量在脂肪细胞诱导分化第二天降到最低点，随后维持在第0天的水平。在过表达miR-128a后，大鼠前体脂肪细胞成脂标记基因PPARγ和aP2的蛋白表达量与对照相比显著下降，脂滴明显少于对照组。实验结果表明：在大鼠前体脂肪细胞中过表达miR-128a能够抑制前体脂肪细胞的分化；并且通过PPARγ mRNA和蛋白水平的差异性变化，结合miRNA的作用机理，推测PPARγ有可能是miR-128a的靶基因。本实验也为研究miR-128a在脂肪细胞分化中发挥作用的机理提供了理论基础

植株茎叶茸毛在抗逆性所起的作用正在引起人们越来越多的关注。本研究以多毛辣椒(Capsicum annuum L.)PM702和无毛甜椒(C. annuum L.)FS871为双亲构建的F9代重组自交系(RILs)为实验材料，利用主基因+多基因混合遗传模型，联合双亲对主茎和叶片表面茸毛密度进行了遗传分析。结果显示，辣椒主茎表面茸毛密度分布符合E-2-3模型，即受2对连锁的主基因控制，并有多基因的修饰。2对主基因以加性效应为主。主基因遗传率为53.00%，多基因遗传率为25.30%。两基因座间的重组率r=0.6226。叶片正面茸毛密度分布符合E-1-7遗传模型，即受2对具有互补作用的主基因控制，并有多基因同时起作用。主基因以加性效应为主，并有互作。主基因遗传率50.65%，多基因遗传率8.86%。结果为抗逆甜辣椒新品种的选育提供了一定的理论依据。

肝脏在机体蛋白质代谢调控中起着重要的作用。为了揭示不同精粗饲料比条件下山羊肝脏蛋白质代谢与乳蛋白合成和分泌的关系，本研究选用8只健康的泌乳中期山羊(Capra hircus)，随机分为两组，日粮精粗比分别为4∶6(低精料组)和6∶4(高精料组)，采用2×2拉丁方设计，2次重复。取乳样，测定产奶量和乳中蛋白质含量。肝脏活体穿刺取样，二维凝胶电泳结合MAIDI-TOF-TOF质谱的方法分析肝脏内蛋白质代谢相关蛋白/酶表达的差异。与低精料组相比，高精料组山羊日平均产奶量显著增高(P<0.05)，而乳中蛋白质含量无显著差异(P>0.05)。蛋白组学结果表明，当精料比例提高时，肝脏参与蛋白质代谢的延长因子-Tu、谷氨酸脱氢酶、腺苷高半胱氨酸酶上调；而26S蛋白酶体调节亚基7和血清前白蛋白下调，即肝脏本身合成血清前白蛋白和小肽能力下降；同时氨基酸分解代谢和抗氧化应激作用加强。高精料饲喂泌乳期山羊，其肝脏中氨基酸消耗增多，同时小肽合成减少，竞争消耗了乳蛋白合成的原料，可能不利于乳蛋白的合成。本研究结果为研究肝脏对乳蛋白合成的影响提供了线索。

为探讨生长轴生长激素(GH)、生长激素受体(GHR)和胰岛素样生长因子1(IGF-Ⅰ)基因在鸭早期生长发育中的作用，本研究采用实时荧光定量PCR方法研究生长速度不同的高邮鸭和金定鸭(Anas platyrhynchos Domestica) 13、17、21、25、27胚龄和出雏后7日龄时垂体GH基因与胸肌和腿肌GHR和IGF-Ⅰ mRNA的表达水平。结果表明，这3个基因在两个鸭种中均有表达，且同一基因在不同鸭种的同一组织中有相似的表达规律。两个鸭种垂体GH mRNA表达水平均随着胚龄(或日龄)的增加而增加，且在7日龄时高邮鸭极显著高于金定鸭(P<0.01)。GHR mRNA在胸肌和腿肌中的表达均不存在品种差异。两个鸭种胸肌IGF-Ⅰ mRNA表达量，除27胚龄时高邮鸭略低于金定鸭外，其它各胚龄均是高邮鸭高于金定鸭，且在13、 21胚龄和7日龄时呈显著或极显著差异(P<0.05或P<0.01)；两个鸭种腿肌IGF-ⅠmRNA表达量均是高邮鸭高于金定鸭，但不存在显著的品种效应(P>0.05)。研究结果提示，这3个基因在鸭早期生长发育中具有重要作用，mRNA的表达具有明显时空性，GH和IGF-Ⅰ mRNA表达还存在品种差异性。

鸡(Gallus gallus)与鹌鹑(Coturnix coturnix)属间杂交胚胎早期死亡与性别分化存在着一定的关系，寻找简单、准确的早期胚胎性别鉴定方法是深入研究其死亡分子机制的前提。本实验室前期使用Wpkci引物从mRNA水平对早期胚胎进行准确的性别鉴定，而RNA提取对样品质量要求较高，鉴定程序较复杂。因此需要建立更加简单快捷的方法，对鸡与鹌鹑属间杂交早期胚胎进行准确性别鉴定。本研究采集孵化不同时期(2.5~5 d) 杂交活胚116枚，以10 mg胚胎组织DNA为模板(3 d时，约占整个胚胎的1/20)，依据CHD(chromobox-helicase-DNA binding)基因保守区设计引物2550F/2718R进行PCR反应；用相同胚胎组织提取的RNA为模板，用Wpkci(W-linked protein kinase C inhibitor)基因设计为特异性引物，对杂交早期胚胎进行RNA水平的验证。结果表明，2550F/2718R引物可以准确鉴定杂交胚胎的性别，雄性胚胎组织中扩增出1条约613 bp片段，雌性胚胎组织中扩增出2条分别为613和446 bp的片段，与预期结果一致。本研究为鸡与鹌鹑属间杂交种性别决定机制的研究提供了基础研究资料。

硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)是脂肪酸合成过程中的一个主要限速酶，为了研究奶牛脂肪合成的基因调控机制，本研究首先从奶牛组织中克隆得到4个不同长度的SCD基因启动子片段(分别为212、380、416和760 bp)，采用生物信息学的方法分析了启动子上不同的转录因子结合位点，将克隆片段与pGL3-basic荧光素酶报告基因载体进行KpnⅠ和XhoⅠ双酶切，连接形成重组启动子载体pGL3-SCD1、pGL3-SCD2、pGL3-SCD3和pGL3-SCD4。将载体纯化后，瞬时转染到HepG2细胞，对细胞施加胰岛素(10 IU/mL)和亚油酸(120 μm)处理，通过双荧光素酶报告基因检测启动子荧光素酶相对活性，结果发现，在SCD启动子序列上存在Sterol-regulated element(SRE)转录因子的结合位点，随着SCD启动子片段长度的延长，启动子活性也显著提高，pGL3-SCD4具有最高的启动子活性。与对照组相比，pGL3-SCD1~4启动子的活性在胰岛素刺激下都显著增强(P<0.05)，其中pGL3-SCD4的启动子的相对活性最高，达到了46.93。在亚油酸刺激下，pGL3-SCD1~3的启动子活性没有显著变化，而pGL3-SCD4的活性显著减弱(P<0.05)，研究表明pGL3-SCD4启动子上增加的片段(-398~-742)可能对于SCD基因的表达调控具有重要作用。

30K蛋白是一类家蚕(Bombyx mori)血淋巴中具有最强抗细胞凋亡活性的蛋白，家蚕Bm30Kc6蛋白作为30K蛋白家族的成员之一，也具有较强的抗细胞凋亡作用，但其抗细胞凋亡的作用机制还不十分清楚。本研究将本实验室成功构建的重组病毒Bacmid-Bm30Kc6接种家蚕BmN细胞大量表达后，利用Ni-NTA蛋白亲和层析柱纯化重组蛋白Bm30Kc6。SDS-PAGE和Western blot检测结果显示纯化蛋白的纯度较高。然后利用不同浓度(0.1、1、5和10 mmol/L)的H2O2处理家蚕BmN细胞，诱导细胞发生凋亡，结果表明，在培养基中加入终浓度为5 mmol/L H2O2孵育4 h后即可成功诱导BmN细胞凋亡。在上述建立的H2O2诱导的家蚕BmN细胞凋亡体外损伤模型的基础上，分析了Bm30Kc6蛋白的抗细胞凋亡的活性及作用机制。首先利用Cell death Detection ELISA试剂盒检测了细胞内的DNA片段化程度，检测结果表明， Bm30Kc6蛋白(终浓度5 μg/mL)可明显降低H2O2诱导的家蚕BmN细胞内的DNA片段化程度。然后利用Cell proliferation ELISA试剂盒检测了细胞的增殖情况，结果表明，Bm30Kc6蛋白可以显著增强家蚕BmN细胞的活力。进一步利用8-isoprostane EIA 试剂盒检测细胞内氧化应激标志物8-isoprostane的浓度变化，结果显示，家蚕Bm30Kc6蛋白可以显著降低胞内8-isoprostane的浓度。此外，Western blot分析结果显示，Bm30Kc6蛋白可显著抑制家蚕BmN细胞中细胞色素c从线粒体中释放进入细胞质。Bm30Kc6蛋白一方面可以通过降低BmN细胞内的氧化应激水平从而起到抑制细胞凋亡的作用；另一方面，Bm30Kc6蛋白也可以通过阻断H2O2诱导激活的线粒体通路来抑制细胞发生凋亡。本研究将为进一步深入研究家蚕Bm30Kc6蛋白的抗凋亡机制提供基础资料。

为获得可以区分自然感染和疫苗免疫且毒力较弱的布鲁氏菌候选疫苗株，本实验研究了磷酸葡萄糖变位酶基因(pgm)对布鲁氏菌(Brucella melitensis)M5-90疫苗株毒力的影响，并对其进行了免疫评价。本实验构建了重组质粒pGEM-7zf-Δpgm，电转化布鲁氏菌M5-90感受态细胞，筛选获得布鲁氏菌疫苗株M5-90的pgm基因缺失株(Δpgm)，并对获得的M5-90 Δpgm株进行遗传稳定性、免疫原性检测。结果显示，Δpgm能稳定传15代； Δpgm组的抗体含量较亲本株M5-90组差异不显著；Δpgm在诱导机体产生IL-2的能力要强于M5-90，产生INF-γ的能力低于M5-90；该基因缺失株采用虎红平板凝集试验和试管凝集试验不发生凝集反应；Western blot证实，Δpgm不能诱导小鼠产生抗pgm蛋白的抗体。本研究构建的Δpgm具有很好的遗传稳定性和免疫原性，为研制布鲁氏菌基因缺失疫苗提供了实验依据。

为了进一步探索浙江省及周边地区猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2， PCV2)的分子进化特征。本研究运用实验室已建立的PCR方法，采集2007~2012年期间浙江省及周边地区疑似PCV2感染的180份病例的肺脏、脾脏及淋巴结，并制成混合的组织样本，进行猪PCV2感染情况检测，并抽提组织细胞DNA作为模板，进行PCV2目的片段的全基因组扩增及测序，研究结果表明：浙江省及周边地区PCV2在2007~2012年阳性率分别为41.7%、52.0%、44.1%、37.0%、40.5%和33.3%，总阳性率41.4%。与以往相比，PCV2感染率基本保持一致。随机选取的45份阳性病料PCV2全基因组测序结果显示，45个毒株均属于Group 1(PCV2b)，很显然，浙江省及周边地区PCV2的主导基因型依然是Group1。45个毒株中属于1A分支的有11个毒株，属于1B分支的有10个毒株，属于1C分支的有22个毒株，所占比例分别是23.9%、21.7%和47.8%，同时发现随着PCV2在本地区的流行，1C分支从无到有，且在其中的比例也越来赿高，并逐步占据主导地位。对PCV2毒株Cap变异的分析能更好掌握检测区域毒株同源性情况。

小麦(Triticum aestivum L.)杂种优势利用与雄性不育机理的研究，多年来一直是世界性设法攻克的科学难关。为了研究小麦生理型雄性不育与组蛋白泛素化的关系，进而为揭示小麦生理型雄性不育的机理奠定基础。以小麦品种西农1376为供试材料，化学杂交剂SQ-1为雄性不育诱导剂，首先创建其可育与不育等生理系，然后提取两者的组蛋白，采用Western blot 的方法研究其泛素化水平;克隆出催化组蛋白H2B泛素化的E2酶基因RAD6的cDNA功能序列，并对其进行生物信息学分析，同时采用实时荧光定量PCR技术分析RAD6基因的表达特性。结果显示，在小花发育的3个时期，组蛋白H3的泛素化修饰水平在可育株与不育株之间无明显差异。在单核期，组蛋白H2A的泛素化修饰仅发生在可育株中，而不育株中没有发生;组蛋白H2B的泛素化水平在不育株中明显低于可育株，同时不育株中RAD6基因的表达明显受到抑制。这些均表明，在小麦生理型雄性不育败育关键期(单核期)，不育株小花中RAD6基因的表达显著下降，同时其催化的组蛋白H2B泛素化水平也明显下降，以及组蛋白H2A没有泛素化修饰，可能影响某些关键基因的转录而导致小麦败育。由此可见，小麦组蛋白泛素化水平与生理型雄性不育密切相关，这为小麦生理型雄性不育组蛋白泛素化调控机制提供了科学依据，进而为深入探究小麦生理型雄性不育机理提供了坚实的表观遗传研究基础资料。

为实现外源生长激素(GH)基因在特定时间、空间的可控表达，本研究构建四环素(TET-ON)表达载体系统，并在细胞水平对该载体系统进行诱导活性验证。结果表明：(1)成功构建了重组载体pTRE-GH12；(2)筛选建立了可诱导表达GH的细胞系；(3)利用强力霉素(doxycycline, DOX)诱导阳性细胞克隆并检测外源GH的表达，QRT-PCR结果表明，实验组细胞在DOX诱导后表达活性是诱导前264.481倍；对照组细胞在DOX诱导前诱导后表达无明显变化，实验组和对照组细胞间差异极显著(P<0.01)，实验组DOX诱导前后差异极显著(P<0.01)；(4)Western杂交后灰度分析结果和QRT-PCR趋势一致，实验组和对照组细胞间GH蛋白表达量差异极显著(P<0.01)，实验组DOX诱导前后GH蛋白表达量差异极显著(P<0.01)。研究结果提示，四环素(TET-ON)诱导猪生长激素(GH)表达系统实现了可控表达，为以后制备可诱导表达GH的转基因动物提供了技术基础。

由于Bt Cry 1Aa、Cry 1Ab和Cry 1Ac晶体蛋白之间具有很高的同源性(82%~90%)，采用常规的单抗制备方法很难制取特异性强的Bt Cry1Ab单抗，为了制备抗Bt Cry1Ab蛋白的特异性单克隆抗体(MAB)，本研究从NCBI获得了Bt Cry1Ab蛋白的氨基酸序列，根据ANTHEPORT和DNAStar软件对其抗原性、亲水性和表位性分析结果选定Bt Cry1Ab特异性肽段进行人工合成，并将其偶联于匙孔血蓝蛋白(KLH)免疫动物，应用细胞融合技术制备了抗该肽段的杂交瘤细胞22株。通过ELISA试验从中筛选出与Bt Cry1Ab天然蛋白产生特异性反应的单克隆抗体杂交瘤细胞株一株(3A10)。经检测，其分泌的抗体亚类为IgG1型;轻链属κ型；杂交瘤细胞株染色体数目为89~108 条；用其制作的腹水对Bt Cry1Ab合成肽的反应效价为1∶1×107；对Bt Cry1Ab天然蛋白的反应效价为1∶1×104；纯化后的抗体对Bt Cry1Ab合成肽的效价为1∶1×108；对Bt Cry1Ab天然蛋白的效价为1∶2×104。抗体的相对亲和力为0.5 μg/mL，对Bt Cry1Ab蛋白的最低可检测值为10 ng/mL。ELISA结果显示，3A10杂交瘤细胞株所分泌的MAB能特异性识别合成肽和Bt Cry1Ab蛋白，而对同源的Cry1Ac和Cry1Aa蛋白无交叉反应;本研究所制备的Bt Cry1Ab单克隆抗体能够对常规棉和抗虫棉(Gossypium hirsutum L.)进行有效的区分，并且能特异性的识别其中的Bt Cry1Ab蛋白。

百合病毒病是影响百合切花和种球产量与质量的关键问题之一，虽然在我国百合病毒检测和脱毒技术的研究已经展开，但是在病毒检测中存在着检测病毒的种类较单一和检测结果出现假阴性等问题；脱毒方面也存在操作难度大、脱毒率不高等缺陷。本研究以麝香百合杂种系品种雷山一号(Lilium longiflorum cv. Raizan 1)组培苗为试材，对侵染百合的3种主要病毒：黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)、百合无症病毒(Lily symptomless virus, LSV)和百合斑驳病毒(Lily mottle virus, LMoV)的多重RT-PCR检测及病毒脱除技术进行了研究。根据百合18S rRNA和3种病毒的基因序列，设计了4对特异引物，并对多重RT-PCR中的dNTPs浓度、Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶浓度、退火温度和反应循环数等因素进行了筛选和优化。结果表明，进行多重RT-PCR的最佳反应体系为：dNTPs(2.5 mmol/L) 1.5 μL，Mg2+(25 mmol/L) 1.5 μL， Buffer 1.875 μL，cDNA 1 μL，CMV、LMoV、LSV、18S上、下游引物各0.5 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，加 H2O补足至25 μL。最佳反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，52.4℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃延伸10 min，4℃终止反应。由此建立了以百合18S rRNA为内参照，同时检测CMV、LSV和LMoV的多重RT-PCR技术。黑暗、变温热处理结合试管鳞茎培养只对脱除百合植株CMV有效，脱毒率达90%以上；黑暗、变温热处理后，切取≤1 mm的茎尖进行光培养能够有效脱除CMV、LSV和LMoV 3种病毒，脱毒率达到93.3%。此脱毒方法具有操作简便、培养周期较短、脱毒率高等优点，可以为百合脱毒苗的生产提供指导。

为了建立特异、敏感、快速检测兔支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica, Bb)的TaqMan荧光定量PCR方法，本研究以Bb的毒力因子CyaA为目的基因设计特异性引物和探针，并将PCR扩增产物克隆测序，测序结果与GenBank上Bb的CyaA的同源性达100%。以阳性克隆质粒作为定量检测标准品建立标准曲线，以提取的Bb基因组DNA为模板，进行特异性、灵敏度和重复性实验。该方法对波氏杆菌基因组DNA检测最低限为0.32 pg，灵敏度是普通PCR的25倍，与临床常见细菌无交叉反应。对45份疑似感染兔波氏杆菌病料的检测表明，TaqMan荧光定量PCR和普通PCR检测阳性率分别为75.6%和66.7%，两者符合率88.2%。结果表明，建立的TaqMan荧光定量Bb检测方法具有较好的特异性、敏感性和重复性。该方法的建立对Bb的临床高效诊断，Bb的防控提供了有效手段。