生长激素(GH)是调控动物生长的重要激素，GH分泌水平的高低主要受正性调控因子生长激素释放因子(GRF)和负性调控因子生长抑素(SS)的双向调节。SS通过生长抑素受体(somatostatin receptor, SSTR)发挥作用，减少GH的分泌水平。本研究设计了3条SSTR2的短发夹RNA(shRNA)，构建猪(Sus scrofa)SSTR2真核表达质粒(pcDNA3.1(-)-SSTR2)和SSTR2 慢病毒RNA干扰质粒(pshRNA-copGFP lentivector, LV-shRNA)，并共转染中国仓鼠(Cricetulus griseus)卵巢细胞系(CHO)，通过对转染细胞的荧光观察、Real-time PCR和酶联免疫法(ELISA)检测，结果表明，CHO转染细胞中猪SSTR2 mRNA表达水平不同程度的抑制，分别为90.4 %、28.3%和86.3%，(P<0.05)。其中，LV-shRNA1表现出最高的沉默效率：转染效率在80%左右时，猪SSTR2 mRNA水平沉默效率为90.4 %，蛋白质水平降低了33.3%。本研究成功地筛选到了降低猪SSTR2基因表达的shRNA，为利用shRNA技术下调动物基因表达，构建转基因模型提供思路。

肌肉生长抑制素(MSTN)能够限制肌纤维的增粗增大，而突变的肌肉生长抑制素前肽(Pro-MSTN-D75A)能阻止MSTN与相应受体的结合，从而解除MSTN对肌纤维的抑制作用。猪是我国最重要的肉用家畜，通过操作MSTN 提高其瘦肉产量，将对我国生猪生产具有特殊意义。本研究用通城猪妊娠3个月的胚胎为材料，提取背最长肌RNA并以此为模板，用反转录PCR扩增猪MSTN前肽cDNA序列(不含信号肽)，并将其连接到原核表达载体pGEX-6p-1上。通过定点突变将编码天冬氨酸的密码子变为丙氨酸密码子(D75A)，构建了原核表达载体pGEX-ProM(SP-)和pGEX-ProM(SP-)D75A。重组质粒转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21感受态细胞并经IPTG诱导表达，结果表明，转化pGEX-ProM(SP-)质粒的E.coli BL21工程菌用终浓度为0.6 mmol/L的IPTG诱导5 h表达情况最好；而转化pGEX-ProM(SP-)D75A 的工程菌在1 mmol/L的IPTG诱导6 h的条件下表达情况最好。用GST-Trap蛋白纯化系统纯化回收总分子量大小约为51 kD融合蛋白(GST蛋白标签分子量为26 kD，MSTN前肽蛋白分子量为25 kD)。纯化蛋白的浓度ProM(-SP)为1.87 mg/mL，ProM(-SP)D75A为1.21 mg/mL。本研究建立了大肠杆菌表达猪MSTN前肽的最佳条件，提高了生产效率，并为研究MSTN前肽在动物体内的生物学功能以及制备单克隆抗体提供基础资料。

为进一步研究海参(Stichopus japonicus)溶菌酶基因(SjLys)(Genbank登录号: EF036468)中不同片段表达产物的生物特性，本研究通过对其cDNA片段的分析，发现C端基因区域所对应的蛋白质序列中含有非酶活性。根据已知的海参溶菌酶的cDNA序列，设计出含有NcoⅠ和EcoRⅠ酶切位点的特异性引物，从新鲜的海参肠中提取总RNA，以其为模板利用RT-PCR扩增出长度为259 bp的溶菌酶C端(SjLys-C)基因。将该目的基因连接到pET-32a(+)载体上，构建重组质粒pET-32a(+)-SjLys-C, 再转化至大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta(DE3)pLysS，成功地构建了重组蛋白SjLys-C的基因工程菌。利用该工程菌诱导发酵，结果显示它能高效表达出26 kD左右的重组蛋白SjLys-C。经过Western blot分析，该重组蛋白在26 kD左右能够与Penta-His抗体发生特异性免疫反应。对纯化的重组蛋白SjLys-C进行了抑菌特性的分析，结果发现它对溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)有较高的抑菌活性。此外，将该重组蛋白经100℃、40 min处理后，其抑菌能力提高了5%~21%。研究结果表明，重组蛋白SjLys-C基因工程菌能够制备出具有可溶性的、并具有抑菌活性的重组蛋白SjLys-C，在农业和医药等行业中有潜在应用和开发价值。

本实验通过牛生发泡(GV)期无卵丘细胞卵母细胞-裸卵(denuded oocytes, DOs)与小鼠卵丘细胞(mouse cumulus cells, mCCs)共培养，研究异种mCCs对牛DOs体外成熟和孤雌激活后发育的影响，进而探讨卵丘细胞对卵母细胞的作用机制，为牛卵母细胞体外成熟效率提高提供实验依据。牛卵母细胞分为COCs(cumulus-oocytes complexes)组、DOs+bCCs(bovine cumulus cells, bCCs)组、DOs+mCCs组和DOs组4个组合，体外成熟22~24 h后，检测各组卵母细胞第一极体排出率、MⅡ期卵母细胞中谷胱甘肽(glutathione，GSH)含量和孤雌激活后的发育能力，以及卵母细胞内骨形态发生蛋白15(BMP15)和生长分化因子9(GDF9)mRNA相对表达水平。结果表明：(1) DOs+mCCs组和DOs+bCCs组卵母细胞核成熟率[(68.48±5.71)%，(71.00±4.27)%]显著低于COCs组(84.70±3.41)%(P<0.05)，但均显著高于DOs组(54.26±5.03)%(P<0.05)；(2) DOs+mCCs组MⅡ卵母细胞GSH含量和孤雌激活囊胚率[(2.48±0.24) pmol/oocyte，(44.19±4.03)%]与DOs+bCCs组[(2.49±0.18)pmol/oocyte，(48.57±5.20)%]和DOs组[(2.40±0.17)pmol/oocyte，(43.47±7.34)%]之间没有差异，但分别显著低于COCs组[(9.67±0.18)pmol/oocyte，(59.93±6.13)%](P<0.05)，各组孤雌激活卵裂率之间没有显著差异[(98.85±4.32)%，(92.11±2.00)%，(95.40±4.11)%，(93.18±3.19)%](P>0.05)；(3)DOs+mCCs组、DOs+bCCs组和COCs组卵母细胞中BMP15和GDF9 mRNA相对表达水平均显著性高于DOs组(P<0.05)，其中，DOs+mCCs组和COCs组GDF9 mRNA相对表达水平显著高于DOs+bCCs组(P<0.05)。实验结果表明，mCCs能提高牛DOs的核成熟率及BMP15和GDF9 mRNA相对表达水平，但对牛DOs的细胞质成熟和MⅡ卵母细胞孤雌激活胚胎囊胚发育没有促进作用，说明卵丘细胞通过一些旁分泌因子促进卵母细胞核成熟，且这些因子的作用可能没有种属特异性。

转植酸酶基因玉米检测是对转植酸酶基因玉米释放进行有效监管的重要前提和技术支撑。本研究根据转植酸酶基因玉米(Zea mays)外源植酸酶基因phyA2序列设计基因特异性引物，进行了定性、定量PCR检测。定性结果显示，该引物可有效检测植酸酶玉米中phyA2基因，而在其他不含植酸酶基因的材料中则检测不到相应基因，表明该引物具有很高的特异性。以玉米内标准基因玉米淀粉合酶异构体zSTSII-2基因(zSSIIb)和植酸酶基因phyA2为对象，进行SYBR GreenⅠ染料法荧光定量PCR反应，绘制2种基因扩增循环数-拷贝数标准曲线图，根据混合样品中(zSSIIb)和植酸酶基因phyA2的拷贝数计算样品中的转基因含量，并做熔解曲线分析。结果表明，zSSIIb和phyA2标准曲线相关系数分别为0.998和0.995，相关性较好，两个基因的熔解曲线均呈单峰型，表明引物特异性较强，混合玉米样品(植酸酶玉米含量分别为1%、0.5%和0.1%)中植酸酶玉米含量分别为1.1%、0.54%和0.17%，实测值与理论值接近。本研究建立了转植酸酶基因玉米定性、定量PCR检测体系，可有效地对转植酸酶基因玉米进行检测。

作为精原细胞和卵原细胞的祖细胞，由于其全能性的特点可作为体外胚胎发育研究的良好模型，而禽类独特的生理和发育特点使得其原始生殖细胞(PGCs)在转基因研究中有着巨大价值。本研究通过对孵化5.5 d的梅岭土鸡(Gallus domesticus)胚生殖腺中分离得到的PGCs，接种于24孔培养板在温度37℃、95%空气和5%CO2的培养箱中进行体外培养；借助组织化学及免疫组织化学染色对PAS (高碘酸希夫氏染色)、AKP (碱性磷酸酶染色)、SSEA-1 (胚胎阶段特异性表面抗原-1)以及TERT (端粒酶反转录酶)进行了鉴定；采用荧光定量PCR技术对PGCs阶段特异性表达基因Cvh(鸡Vasa基因同系物)、Cdh (鸡死端同系物)、Dazl (类无精症缺失)和干细胞多能性相关基因PouⅤ (POU结构域Ⅴ类转录因子1)、Nanog(nanog 同源异型盒)、Sox-2 (性别决定区Y盒2)基因表达进行了分析；利用脂质体介导法，将绿色荧光蛋白(pEGFP-N3)基因导入鸡PGCs细胞，结果表明，PGCs集落有典型的鸟巢状结构，且PAS、AKP、SSEA-1以及TERT染色阳性；PGCs阶段特异性表达基因Cvh、Cdh、Dazl和干细胞多能性相关基因PouV、Nanog和Sox-2在鸡PGCs中均远远高于在鸡成纤维细胞(CEF)中的表达；转染24 h后，绿色荧光蛋白均匀的充满细胞质和细胞核，转染效率最高为16％，研究结果为禽类PGCs分化过程中基因调控及基因标记、转基因动物克隆等技术提供了良好基础。

探讨沉默信息调节因子1(Sirt1)对小鼠脂肪沉积的抑制作用和雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路的影响。用Sirt1的激动剂白藜芦醇(100 mg·kg-1·d-1)和抑制剂尼克酰胺(500 mg·kg-1·d-1)灌胃处理小鼠(Mus mussulus)15 d，记录小鼠体质量变化，测定小鼠皮下脂肪、附睾脂肪和肾周脂肪的沉积量，试剂盒测定血脂指标，同时利用Real-time PCR分析与脂肪生成密切相关的转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、固醇调节元件结合蛋白1 (SREBP1)和脂解基因甘油三酯水解酶(ATGL)、激素敏感性脂肪酶(HSL)、围脂滴蛋白(Perilipin)及生脂基因脂肪酸合成酶(FAS)mRNA的表达水平，检测mTOR通路关键因子雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、核糖体S6蛋白激酶1(S6K1)和真核启动因子4E结合蛋白1(4EBP1)mRNA表达水平。与对照组相比，白藜芦醇处理组小鼠体质量增加量和体脂含量均显著降低(P<0.01)，血清中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白(LDL-C)浓度均显著降低(P<0.01)，而高密度脂蛋白(HDL-C)浓度升高(P<0.01)，mTOR通路关键因子mTOR、4EBP1和S6K1 mRNA表达水平降低(P<0.01)，脂代谢相关基因PPARγ、SREBP1及成脂基因FAS mRNA表达水平显著降低(P<0.01)，脂解相关基因ATGL、HSL和Perilipin mRNA表达水平显著升高(P<0.01)；烟酰胺处理组小鼠体质量、附睾脂肪以与皮下脂肪沉积量增加缓慢(P>0.05)，肾周脂肪沉积量增加(P<0.05)，血清中LDL-C浓度升高(P<0.05)，HDL-C浓度降低(P<0.01)，mTOR通路关键因子mTOR和4EBP1 mRNA表达水平升高(P<0.01)，而脂代谢调控相关因子PPARγ和SREBP1 mRNA水平升高(P<0.05)，ATGL mRNA表达量显著降低(P<0.05)，FAS、HSL和Perilipin mRNA表达量变化不显著(P>0.05)。表明激活Sirt1可减少脂肪合成，增加脂肪分解，从而降低体脂沉积，而mTOR信号通路参与这个过程。

彩色马铃薯(指块茎的皮或肉为红、蓝、紫、橙色等)近年来日益为育种工作者所关注，很多彩色马铃薯品种(系)从形态学上难以鉴定是否为同一基因型，给育种工作带来诸多不便。本研究利用SSR标记对50份彩色马铃薯(Solanum tuberosum L.) 材料进行了遗传多样性分析及指纹图谱构建。研究筛选出56对马铃薯SSR引物，对50份材料的基因组DNA进行PCR扩增，共检测出236个等位位点，其中多态性位点230个，多态性比率达97.46%。分析显示，基因型间遗传相似性系数在0.50~1.00之间。UPGMA聚类分析表明，在相似系数0.63处可将全部材料分为3大类。利用5对核心引物构建了50份供试材料的指纹图谱，并证明其属于44个基因型的，为彩色马铃薯资源鉴定和利用提供了依据。

为了探索中国大蒜种质个体的SSR位点的分布情况，为品种鉴定、保存及遗传改良提供分子生物学依据，利用6对SSR引物对40个大蒜(Allium sativum L.)品种进行聚类分析、主成分分析及遗传多样性评价。共检测到21个多态性位点，平均每对引物可扩增出约3.5条多态性片段，多态性百分率为56.76%；SSR引物组合平均有效等位基因数、Nei基因多样度和Shannon信息指数分别为1.5551、0.3414和0.5188。聚类分析显示，6对SSR引物可把40份大蒜种质资源从0.59相似系数水平上3个类群。第一类群包含28份种质，在相似系数为0.73的水平上进一步又被分成了3个亚类；第二亚类仅包含2份种质；第三亚类包含10份种质，在0.68的相似系数水平上分成了2个亚类。主成分分析和UPGMA的结果基本一致。不同地理来源的大蒜种质的Shannon-Weaver多样性指数的变幅为0.0576~0.4179，说明大蒜种质遗传多样性丰富。本研究利用 SSR分子标记技术较准确地解析大蒜不同材料间的亲缘关系及遗传多样性，为中国大蒜SSR分子标记提供基础资料。

为了获得有特色的观赏鱼，本实验室在2003年将含有海葵红色荧光蛋白基因的表达载体(同时含有标记基因新霉素磷酸转移酶基因(NPTⅡ))转入唐鱼(Tanichthys albonubes)的受精卵，获得转红色荧光蛋白基因唐鱼，对其外源标记基因NPTⅡ的表达产物和存在时间进行分析，为评价转基因鱼的生物安全提供依据。本实验对转基因唐鱼和非转基因唐鱼肌肉中抗生素标记基因(NPTⅡ)进行PCR检测和NPTⅡ表达产物的免疫检测试剂条检测，结果显示，转基因唐鱼检测到NPTⅡ基因和表达产物，而非转基因唐鱼中均没检测到该基因和表达产物存在。同时在唐鱼死亡后(水温20~25℃)，应用酶联免疫吸附测定法(ELISA)对死亡0 (鲜活肌肉)、24、48、72、96、120和144 h组的转基因唐鱼肌肉中NPTⅡ蛋白的含量进行定量检测，结果表明，转基因唐鱼鲜活肌肉中NPTⅡ蛋白在肌肉中的含量为9.12 ng/g，随着转基因唐鱼死亡时间增加肌肉中NPTⅡ蛋白含量逐渐减少，死亡96 h组转基因唐鱼肌肉中NPTⅡ蛋白已经接近为0。结果表明，转基因唐鱼肌肉中NPTⅡ蛋白在自然环境中容易降解，推测其对环境安全隐患相对较低。

趋化因子家族是一类能诱导白细胞激活和迁移的趋化性细胞因子家族，是鱼类先天免疫的重要组成部分。CC类家族是趋化因子家族中最大的家族之一。为研究鲤CC类家族成员的组织表达和进化模式，以及进一步研究鲤CC类趋化因子的免疫调控机制，本研究选择该家族其中的一个基因，CCL-C5a样基因，根据EST序列结合RACE方法从鲤(Cyprinus carpio)脾脏中克隆了该基因的全长cDNA序列(GenBank登录号：JQ026408)。该序列全长830 bp，5端非翻译区174 bp，3端非翻译区296 bp，开放阅读框360 bp，编码一个由119个氨基酸组成的蛋白。结构域分析发现，该蛋白质含有分泌信号肽和保守的趋化因子结构域；Gene Ontology注释该基因参与免疫细胞迁移的生物学过程。CCL-C5a基因在鲤10个组织中表达，其中在脾和肝的表达量最高。脂多糖刺激鲤外周血白细胞和头肾白细胞后，该基因表达量出现显著上升。氨基酸序列保守性分析表明，鲤CCL-C5a样趋化因子与斑马鱼(Danio rerio)的同源性最高，为61%，与蓝鲶(Ictalurus furcatus)、沟鲶(Ictalurus punctatus)和大西洋鲑(Salmo salar)的同源性分别为47%、47%和42%；与人(Homo sapiens)CCL19蛋白的同源性为37%。适应性进化分析发现，鲤与斑马鱼CCL-C5a的Ka/Ks小于1，说明CCL-C5a基因在鱼类的进化过程受到负选择压作用。本研究结果表明，鲤CCL-C5a主要在免疫器官上高表达，并受到脂多糖诱导表达上升；同时该基因在鱼类中受到负选择作用。这些结果提示CCL-C5a可能是一个与免疫相关的基因。

乳酸球菌(Lactococcus lactis)是一种安全级微生物，为活载体疫苗传递抗原的理想选择。嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila, Ah)能引起鱼类等多种动物的败血病，因其血清型众多，寻找共同保护性抗原是进行疫苗研究的重点。为探究嗜水气单胞菌AS1.927株外膜蛋白(OMP)在乳酸乳球菌中的表达和检测其表达产物对小鼠的免疫保护效果，本研究将已克隆的ompA基因经BamHⅠ和XbaⅠ双酶切后连接载体pNZ8048，转化乳酸乳球菌NZ9000，nisin诱导表达，并进行SDS-PAGE分析鉴定。结果显示，重组基因工程菌L.lactis[pNZ-ompA]表达的融合蛋白分子量约为36.2 kD，成熟蛋白分子量约为33.7 kD。将重组基因工程菌L.lactis[pNZ-ompA]口服免疫BALB/c小鼠(Mus mussulus)，用放射免疫法检测末次免疫一周后的各组小鼠肠粘膜分泌型免疫球蛋白A(sIgA)的水平以及用间接ELISA法检测小鼠血清特异性抗体IgG，结果发现，该重组基因工程菌能显著提高sIgA的分泌(P<0.05)；同时在小鼠血清中的特异性抗体含量也显著高于对照组(P<0.05)。末次免疫两周后用100 LD50的Ah AS1.927(3.3×105 cfu/mL)腹腔注射攻击小鼠，口服重组菌对小鼠的相对免疫保护力(relative percent survival, RPS)为87.5%，表明重组基因工程菌可诱导小鼠对Ah AS1.927产生一定的免疫保护作用。该结果将为开发安全有效的口服基因工程鱼用疫苗提供一定的实验基础。

紫色特用小麦(Triticum aestivum)新品种农大3753是由中国农业大学农学与生物技术学院选育的，由组合京冬8号/黑小麦76经系谱法选育而成，系谱号为：97 冬加(2)-0-1-1-3-3-0。2006年通过北京市品种审定委员会审定。该品种为冬性，籽粒紫色，产量高，富含微量元素，强筋，营养品质和加工品质俱佳。本文详细介绍了农大3753的特点、选育过程和栽培措施，并初步分析了该品种株高低于双亲、加工品质优于双亲的原因，为该品种的推广种植，以及小麦新品种的培育开展提供必要的信息和借鉴。

摘 要 植物NAC转录因子CUP-SHAPED COTYLEDON（CUC）亚家族成员在植物茎尖分生组织形态建成、器官边界分离、叶发育方面发挥着重要作用。采用基因同源克隆的方法获得了白菜基因BrcCUC3，并转化拟南芥做了初步的功能鉴定。研究结果表明，白菜BrcCUC3的编码区长1 008 bp，编码335个氨基酸，基因结构分析显示BrcCUC3包含3个外显子、2个内含子，内含子剪接位点符合GT-AG规则。氨基酸序列分析表明，BrcCUC3蛋白具有典型的植物NAC domain结构域。 BrcCUC3编码区氨基酸序列与其它植物的CUC3蛋白有很高的一致性，尤其与甘蓝、萝卜、拟南芥CUC3蛋白高度一致，一致性分别达到98%，97%，83%，在不同物种CUC3的系统进化树上，BrcCUC3归属于双子叶植物分支的十字花科亚组，由不同植物20条CUC3编码区氨基酸序列所建立的系统进化树与真实的植物进化基本一致。荧光定量PCR分析结果表明BrcCUC3在白菜叶深裂株系叶片中的表达量比叶全缘叶片中的高。利用根癌农杆菌浸花法转化拟南芥，获得了转BrcCUC3基因的拟南芥植株。过表达BrcCUC3的转基因拟南芥呈现叶缘出现裂刻、主枝增加的新表型。初步说明该基因参与叶形和主枝的发育调控。

果糖-6-磷酸,2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酯酶(fructose-6-phosphate,2-kinase/ fructose-2,6-bisphosphatase, F2KP)是影响生物碳积累和分配的调控关键酶，同时也是一个具有激酶和酯酶两种催化活性的双功能酶。本研究在已获得甘蔗(Saccharum officinarum)蔗叶 F2KP(命名为SoF2KP-L)的基础上，以蔗茎 cDNA 为模板克隆获得不同长度的同源片段，分别命名为 SoF2KP-S1、SoF2KP-S2和SoF2KP-S3。生物信息学分析结果显示，SoF2KP-L 翻译的蛋白具有完整的激酶和酯酶结构域，SoF2KP-S1、SoF2KP-S2和SoF2KP-S3 所含开放阅读框长度均小于 SoF2KP-L，其中 SoF2KP-S1 翻译的蛋白只具残缺的激酶结构域；SoF2KP-S2 翻译的蛋白具完整激酶结构域但缺失酯酶结构域；SoF2KP-S3 只能翻译数个氨基酸即终止翻译。选择双功能域完整的 SoF2KP-L构建表达载体，农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转化烟草(Nicotiana tabacum)。RT-PCR证实， SoF2KP-L 在转基因植株成熟叶中转录表达。碳水化合物等生理指标测定结果表明，转基因植株成熟叶片中可溶性总糖/淀粉、还原糖/淀粉、蔗糖/淀粉比值均有不同程度的升高，碳水化合物含量和相关分配比率发生改变。研究结果提示，甘蔗中可能存在不同的 F2KP 转录产物，并初步证实甘蔗 SoF2KP-L 在光合组织中对蔗糖和淀粉的分配起到一定的调控作用，为进一步研究甘蔗 F2KP 基因的功能及为甘蔗分子育种提供参考依据。

酸性土壤占世界可耕作土壤的 30%，而铝毒是酸性土壤中植物生长和作物生产的主要限制因素。近年来，在植物中鉴定了一系列抗铝基因，如有机酸通道蛋白基因(ALMT1和MATE)，ABC通道蛋白基因(STAR1和STAR2)和转录因子基因(STOP1和ART1)。通过基因工程手段在植物中过表达有机酸通道蛋白基因、有机酸代谢酶基因和其他铝胁迫响应基因均获得了很大的进展。本文综述了植物抗铝基因的克隆与鉴定，以及通过遗传操作提高植物的抗铝能力。