鸡(Gallus gallus)是重要的模式生物和农业动物，性别是其主要的生长发育性状和经济性状。目前鸡性别决定和分化的分子机制还不十分清楚。已有研究证明，尽管鸡有明确分化的性染色体（ZZ/ZW），性别决定和分化主要由遗传决定，但其性腺和成体性别形成和分化一定程度受到环境因素，特别是机体性激素的调控和影响。此前对鸡性别决定和分化机制的解释，主要集中在W染色体显性效应与Z染色体剂量效应两个假说，分别有一定实验证据支持但都不能令人完全信服。本研究在阐述已有假说及其相关研究的基础上，重点介绍了表观遗传学在鸡性别决定和分化研究中取得的最新进展，以及新近发现的鸡性别决定的细胞自主性问题。

水稻产量性状的遗传机制复杂，在低氮胁迫下进行QTL定位，可为产量性状遗传机制的解释、基因的精细定位和克隆提供参考价值，也可为筛选耐低氮水稻材料提供有价值的参考。本研究以66个水稻籼粳交片段导入系群体[粳稻(Oryza sativa ssp, japonica)楚粳12是供体亲本，籼稻(O. sativa ssp, indica)蜀恢527是受体亲本，采用回交和分子标记辅助选择相结合的方法构建]为定位群体，利用单标记作图法，对正常与低氮胁迫条件下水稻有效穗、单株产量、株高和生物学产量等性状进行QTL定位。共检测到24个QTLs，20个为新检测出的QTL，而qph-1、qpn-1、 qby-2、qby-4与前人研究结果相似，另外，qph-1a和qph-1b为在不同处理下均能影响株高的位点；生物学产量的QTL仅在低氮处理下被检测到；qpn-2b与qyd-2具有共同的连锁标记RM521；qpn-1b、qpn-2a、qpn-2b等加性效应值都小于1。结果表明，低氮胁迫明显影响单株有效穗、单株产量和生物学产量，且导入系群体检测微效QTL的能力较强。

油体蛋白是一类覆盖在油体表面的碱性小分子蛋白。油体蛋白的存在对于维护油体的稳定性非常重要，油体蛋白也是种子作为生物反应器表达重组外源蛋白的重要载体。本研究通过构建花生(Arachis hypogaea L.)未成熟种子的全长cDNA文库，测序得到284条编码油体蛋白的EST。根据编码蛋白分子量的大小可将花生油体蛋白基因分为6个亚族：AhOLEO-16.9、AhOLEO-17.7、AhOLEO-18.6、AhOLEO-22、AhOLEO-18.4 和AhOLEO-14.3(GenBank登录号分别为：EG372527、EG373122、EG373716、EG372719、EE125019和EE124234)，其中AhOLEO-16.9，AhOLEO-17.7和AhOLEO-14.3分别有2个成员，其它家族的各只有1个成员。本研究首次从花生中克隆了分子较大的AhOLEO-22。cDNA芯片和半定量PCR结果表明6个亚族的油体蛋白基因在花生的不同器官和在种子不同发育时期表达模式相似，在根、茎、叶、花中几乎检测不到油体蛋白基因的表达，在种子中表达量高，在果针入土15 d内几乎检测不到油体蛋白基因的表达，随着种子发育成熟油体蛋白基因的表达量逐步提高。本研究为研究花生油体蛋白基因的家族构成和利用花生油体蛋白基因提高花生含油量、生产外源蛋白等提供了有用的信息。

为了准确、稳定、高效的鉴定杂交油菜纯度，本研究在简单重复序列(SSR)琼脂糖电泳高效标准分析技术体系基础上，通过对479对引物筛选，获得扩增效果好、条带清晰稳定、可将化学杀雄杂交油菜品种秦优33及其亲本系三者皆可有效区别的SSR引物3对。利用其中的SA332引物对三者的高纯单株分别进行了单株验证，结果表明，三者的SSR单株图谱表现与各自的标准图谱的一致性对应率极高，分别达到了98%、99.33%和96.67%。同时利用SA332和SA85两对引物对秦优33生产商品种种子进行了实用化检测，并和大田形态结果进行了一一定株吻合率比对，结果显示，两对引物与大田的单株吻合率皆能达到96%以上，最高可达98.67%；两引物之间在两样品上的一致性偏差比较仅为0.67%和2.67%；150株室内较小检验群体和大田300株以上较大考察群体的纯度偏差仅为－2.19%到3.76%。研究结果表明，室内SSR的鉴定结果和大田种子纯度的实际表现基本一致，可用于油菜杂种纯度的鉴定。

脂肪特异性磷脂酶A2基因(adipose-specific phospholipase A2, AdPLA)在脂肪组织甘油三酯水解过程中发挥着重要的调节作用，为了构建黄牛AdPLA基因原核表达系统，本研究通过Overlap PCR方法从黄牛(Bos taurus)基因组DNA中得到了AdPLA基因编码区全长，将其克隆到pGM-T载体上，阳性克隆经测序表明，与NCBI公布的序列(GenBank No. NM_001075280)完全一致。阳性质粒经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后，将其定向重组到pET28a(+)原核表达载体上，转化感受态大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中，用IPTG诱导融合蛋白表达。SDS-PAGE电泳表明，融合蛋白His-AdPLA在大肠杆菌中表达，证明成功构建了AdPLA基因原核表达系统，为进一步研究黄牛AdPLA基因的功能和AdPLA蛋白产品开发提供了依据。

伪狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)传统诊断方法具有程序繁琐、周期长、成本高、特异性差等缺点，本实验建立了敏感、特异的PRV的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)检测方法，并在此基础上应用金属离子指示剂羟基萘酚蓝(hydroxy naphthol blue, HNB)进行反应结果判定。实验选取保守性较高的gB基因(glycoprotein B, 糖蛋白gB)筛选引物，确定反应体系后，可在45 min内完成检测。LAMP方法特异性与PCR方法一致，敏感性是PCR方法的100倍，最低能够检测10个拷贝的目的基因。在HNB的应用试验中，发现LAMP反应体系中，HNB浓度为150 μmol/L时，阴阳性的颜色对比明显且反应的敏感性最高，可用于LAMP扩增产物的判断。临床样本的检测结果表明，PCR方法和LAMP方法的检出率一致。因此，本研究中所建立的LAMP方法是一种高度特异敏感的，可替代PCR方法的检测技术。

体外成熟的卵母细胞存在核成熟与胞质成熟不一致的情况，从而使得体外成熟的卵母细胞质量不高。本实验采用cdc2激酶抑制剂丁内酯-Ⅰ(butyrolactone Ⅰ, BL-Ⅰ)抑制猪卵母细胞核体外成熟，期望解决卵母细胞体外培养过程中细胞核与细胞质发育的不同步问题。结果表明，分别用0、10、20、40和80 μmol/L BL-Ⅰ处理猪卵母细胞44 h后，对卵母细胞成熟的抑制程度与BL-Ⅰ浓度的升高成正比。用20、40和80 μmol/L处理时，处于生发泡(GV)期的卵母细胞分别为25%、47%和67%，与对照组(5%)相比差异极显著(P＜0.01)；而到达MⅡ期的卵母细胞分别为38%、9%和0，与对照组(67%)相比差异极显著(P＜0.01)。将20、40和80 μmol/L处理44 h后的卵母细胞，再在不含BL-Ⅰ的卵母细胞体外成熟培养液中培养44 h后，到达MⅡ期的卵母细胞为57%、41%和5%，与抑制44 h时相比均有显著差异，表明BL-Ⅰ对卵母细胞成熟的抑制作用是可逆的。20 μmol/L BL-Ⅰ抑制培养20 h再正常培养24 h(20 h＋+24 h-处理组)后卵母细胞的成熟率显著低于对照组(正常培养44 h)(65.6 % vs 70.1%， P＜0.05)。对20 h＋+24 h-处理组成熟的卵母细胞进行孤雌激活，其卵裂率、囊胚率和囊胚总细胞数均好于对照组，但无显著差异；对20 h＋+24 h-处理组成熟的卵母细胞进行核移植(NT)，获得重构胚的卵裂率、囊胚率和囊胚总细胞数均优于对照组，并且卵裂率有显著差异(68.9 % vs 62.4%， P＜0.05)。结果提示BL-I处理对猪卵母细胞的核成熟有明显抑制作用，这种抑制作用是可逆的，对猪卵母细胞孤雌胚胎发育能力和核移植胚胎的发育能力有一定的提高。

为了从新转染方法与传统转染方法的比较中找出更为高效的转染方法，本研究以绿色荧光蛋白(GFP）质粒DNA为外源基因，分别采用核转染法、电穿孔法和脂质体法转染牛的3种常用核移植供体细胞(胎儿成纤维细胞、胎儿输卵管上皮细胞、卵丘颗粒细胞)。针对不同类型的细胞，实验首先对核转染法和电穿孔法的转染参数进行了系统的摸索和优化，然后将优化后的核转染法、电穿孔法与脂质体法在可控实验条件完全一致的情况下进行了转染对比实验，分析比较了转染48 h后的绿色荧光比率和细胞存活率。结果显示，核转染法转染胎儿成纤维细胞、胎儿输卵管上皮细胞和卵丘颗粒细胞的优化程序分别是V013、T023和U023；在电穿孔法中，当电场强度为90 V/mm，脉冲时间为10 ms时，胎儿成纤维细胞和卵丘颗粒细胞的转染效率最高，胎儿输卵管上皮细胞则在电场强度为80 V/mm，脉冲时间为5 ms时获得了最佳转染效率；最后通过转染对比实验得出，核转染法在3种细胞中都获得了最高的转染效率，分别为(98.78±0.30)%、(88.43±2.10)%和(71.31±0.77)%，均显著高于电穿孔法和脂质体法；转染后的存活率则为脂质体法最高，电穿孔法最低。研究结果说明，核转染法可以成为一种结合牛体细胞克隆技术生产转基因牛更有效的转染方法。

为了筛选与绵羊(Ovis aries)毛性状基因座连锁更强的分子标记，本研究选择9个多态性丰富的绵羊皮肤源EST-SSR位点，检测了德国美利奴羊与中国美利奴羊级进杂交F2代群体的遗传多态性，并分析了标记与毛性状间的关联性。分析结果显示，所选的9个EST-SSR位点在供试群体中共检测到 39 个等位基因，多态性丰富，其中的6个位点基因型间存在显著差异；其中，与自然长度关联的位点有5个，与伸直长度关联的位点有4个，与纤维直径关联的位点有3个。6个EST-SSR位点基因型间存在显著差异；关联性标记对羊毛性状相关效应的F检验结果表明：33176918位点和33176988位点分别对羊毛自然长度、纤维平均直径具有显著的遗传效应(P<0.05)。研究结果提示，与羊毛性状相关的6个位点中，33176918号位点对羊毛的自然长度有较大的标记效应，该位点的CD基因型是羊毛自然长度的有利基因型；33176988号位点对羊毛的纤维直径有显著地标记效应，该位点的BC基因型是纤维直径的有利基因型。这两个位点可能与控制毛形状的基因座紧密连锁。

梨火疫病菌(Erwinia amylovora)可引起梨、苹果等蔷薇科植物的火疫病。双精氨酸运输系统(Tat)与致病相关蛋白的转运有特定的联系。本研究在梨火疫病菌全基因组中发现了同源基因，通过同源重组的方法，构建了梨火疫病菌的tatC基因突变体以及互补子。研究结果表明，tatC基因影响着梨火疫病菌的致病性、胞外多糖、鞭毛运动、游动性、趋化性、生长情况等多种生物学特性。然而，EaΔtatC仍能引起烟草过敏性反应，并且在胞外纤维素和生物膜的生成方面与野生型菌株相比没有明显差异。说明梨火疫病菌tatC基因对病菌的生长、游动性以及致病性方面具有关键作用。

菌寄生真菌的几丁质酶有很强的降解几丁质能力，在控制植物病害方面起着重要的作用。为克隆和研究菌寄生真菌黄蓝状菌(Talaromyces flavus)几丁质酶基因(tfchi1)，本研究根据真菌几丁质酶基因的保守序列设计扩增基因中间片段的简并引物，采用RT-PCR、3'-RACE及5'-TAIL的方法获得了该基因的DNA和mRNA 序列(GenBank: GU361769, GU361770)。tfchi1长为2 561 bp，具有6个内含子，长度分别为129、78、68、65、53和59 bp，包含1 194 bp的ORF，编码一个由397个氨基酸组成的蛋白。推导的tfchi1氨基酸序列以及蛋白质结构生物信息学分析表明，该蛋白具有典型的几丁质酶催化区保守序列SXGGW和DGXDXDWE，属于糖苷水解酶18家族几丁质酶，与柄篮状菌(Talaromyces stipitatus ATCC 10500)几丁质酶(XP_002480365)氨基酸序列同源性为96%，分子量为43.47 kD，等电点为4.97。该蛋白无信号肽序列，有15个潜在的N-糖基化位点，Tfchi1的二级结构以无规卷曲和α-螺旋为蛋白的主要结构元件，三级结构中有(α/β)8的圆桶形结构。tfchi1转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，酵母工程菌可分泌具几丁质酶活性的表达产物，重组蛋白的分子量与理论值相符。结果说明，本研究已从T. flavus中正确克隆了1个糖苷水解酶18家族几丁质酶基因。

表皮生长因子受体是雌性生殖功能的关键因子，本研究旨在分析表皮生长因子受体基因(epidermal growth factor receptor, EGFR)的多态性与山羊繁殖性能之间的关系。参考牛的EGFR基因序列设计14对引物，采用聚合酶链式反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术检测在西南地区具有代表性的10个山羊(Capra hircus)品种(马头山羊、波尔山羊、古蔺马羊、川东白山羊、大足黑山羊、贵州白山羊、金堂黑山羊、板角山羊、成都麻羊和南江黄羊)中EGFR基因的单核苷酸多态性，并且在贵州白山羊、古蔺马羊和川东白山羊中分析EGFR基因多态性与山羊繁殖力之间的相关性。结果显示，14对引物中有2对引物(P3和P13)的扩增片段出现多态性。对于P3的扩增片段，在不同的山羊品种中检测到AA、AB和BB三种基因型，测序分析表明BB基因型与AA基因型相比有一处单碱基突变(115837C→T)。在3个品种中，AA基因型和AB基因型的产羔数最小二乘均值差异不显著(P>0.05)，BB基因型的样本非常有限，没有统计意义；对于P13的扩增片段，在不同的山羊品种中检测到GG、HH和GH型三种基因型，测序分析表明HH基因型与GG基因型相比有一处单碱基突变( 173015 G→A)。GG基因型在贵州白山羊和川东白山羊中产羔数最小二乘均值显著高于GH基因型(P<0.05)，而在古蔺马羊样本中只存在GG基因型，HH基因型的样本在三个品种中都很少存在。本研究初步表明，EGFR基因可能是影响山羊产仔数性状的一个主效基因或是与该性状紧密遗传连锁的一个分子遗传标记。

利用高效液相色谱法(denaturing high-performance liquid chromatography, DHPLC)和直接测序法，检测了174只崂山奶山羊(Capra hircus)泌乳母羊的ACACA基因启动子PⅢ位点多态性，采用最小二乘方法分析其与泌乳性状之间的关联效应。结果显示，在启动子PⅢ部分序列中共检测到3个SNPs，即第1206位的B/D，1255位的A/C和1322位的M/N，其等位基因和基因型频率在种羊场(F)和农户(P)两个群体中分布不均衡，均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。在两个样本群中，大部分泌乳性状均存在显著的场别效应(P<0.01或P<0.05)，而位点的基因型效应均不显著(P>0.05)。在F群体的1206位点上，等位基因B为乳蛋白率、乳糖率、非脂肪物性状的有利等位基因，BB基因型与BD基因型的乳蛋白率和乳糖率性状差异极显著(P<0.01)，非脂肪物和乳密度性状差异显著(P<0.05)，乳蛋白率、乳糖率和非脂肪物性状均存在显著的等位基因替代效应(P<0.05)；而在P群体中，两种基因型之间的所有性状则差异不显著(P>0.05)。在F群体的1322位点上，等位基因N为乳糖率的有利等位基因，为300 d产奶量的不利等位基因，MN基因型与MM基因型的300 d产奶量和乳糖率性状差异显著(P<0.01或P<0.05)，其等位基因替代效应分别为－52.22 kg和0.12% (P<0.01)；而在P群体中，等位基因M为乳蛋白率、乳糖率、非脂肪物、乳密度的有利等位基因，基因型MM与MN在乳蛋白率、乳糖率、非脂肪物和乳密度性状均存在显著差异(P<0.05)，乳糖率和非脂肪物的等位基因替代效应分别为－0.25%和－0.44%(P<0.05)。研究结果提示，ACACA基因启动子PⅢ相同等位基因在不同育种群体中，对乳蛋白率、乳糖率、非脂肪物、乳密度、300 d产奶量存在不同程度的影响。

青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)能够对许多重要作物引起致命性萎蔫病害，广泛分布在热带、亚热带以及温带地区。研究青枯雷尔氏菌的遗传多样性对于了解青枯病的发生和流行具有十分重要的意义。本研究利用青枯雷尔氏菌特异性引物鉴定84株来自福建地区不同寄主的青枯雷尔氏菌，结果表明，这些菌株均在504 bp位置出现特异性条带。同时采用BOX插入因子PCR(BOX-PCR)和重复基因外回文序列PCR(REP-PCR)对这些菌株进行基因多样性研究，基于它们所扩增出的基因指纹图谱表明，BOX-PCR扩增出19条特异性条带，REP-PCR扩增出20条特异性条带。系统聚类结果表明，青枯雷尔氏菌的遗传分化与寄主作物和地理来源都存在相关性，其中，寄主植物是在遗传差异中起主导作用。进一步分析可知，地域性的差异主要由BOX-PCR提供，寄主间的差异主要由REP-PCR提供。不同地理来源的青枯雷尔氏菌在BOX-PCR中可扩增出各自特异性条带，在REP-PCR中同样具有与各个寄主相对应的特异性条带，利用这些特异性条带可以很容易区分不同寄主以及来源的青枯雷尔氏菌。BOX-PCR和REP-PCR多态性分析技术可为我国青枯雷尔氏菌基因多样性的研究提供另一条途径。

为了解福建省稻曲病菌群体的遗传多样性和遗传组成，应用随机扩增多态性RAPD(random amplified polymorphic DNA)技术分析了来自福建省不同水稻种植区的102个稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)的遗传多样性。从100条随机引物中筛选出10条扩增带清晰、重复性好的引物进行稻曲病菌多态性扩增，共扩增出157条带，多态性条带比率为82.17%，遗传距离变化范围为0.02~0.67。遗传多样性分析表明，福建省稻曲病菌具有丰富的遗传多样性，相对于其它地区而言，福建闽西地区分离的菌株遗传多样性水平最高PPB=76.43, H=0.2212, I=0.3383)，晚稻分离的菌株群体遗传多样性(PPB=91.08, H=0.2402, I=0.3655)高于早稻群体(PPB=63.06, H=0.1892, I=0.2870)。聚类分析显示，在遗传距离0.349水平上，供试的所有菌株可被划分成7个遗传聚类组(R1~R7)，聚类组R1为优势聚类组，包含有80个菌株，其内又存有一些亚组。这些菌株的聚类与菌株的地理来源及水稻品种无明显相关性。但是在遗传距离0.330水平上，来自宁化的10个菌株可被明显划分成早稻群体和晚稻群体。初步分析认为菌株的地理来源、水稻品种及其生长季节是影响福建省稻曲病菌遗传多样性的主要因素，在稻曲病菌的遗传变异以及该病的发生和流行中可能起重要的作用。

番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus, TAV)可侵染包括藜科(Chenopodiaceae)、茄科(Solanaceae)等在内的24个双子叶家族和3个单子叶家族的100多种植物，是具有重要经济价值的植物病毒之一。为研究TAV BJ株系(Tomato aspermy virus, TAV-BJ)的基因组功能，本实验对TAV-BJ基因组克隆测序，并构建侵染性克隆。以TAV-BJ侵染心叶烟(Nicotiana glutinosa)的总RNA为模板，RT-PCR获得其RNA2和RNA3；以TAV-BJ的dsRNA为模板，RT-PCR获得全长RNA1，目的片段PCR产物克隆测序获得TAV-BJ基因组全序列信息。RNA1全长3 409 nt，编码994个氨基酸的1a蛋白；RNA2 全长3 023 nt，含2个开放阅读框(open reading frame, ORF)，2a ORF编码829个氨基酸的2a蛋白，2b ORF编码78个氨基酸的2b蛋白；RNA3全长为2 216 nt，包含2个ORF，3a ORF 编码247个氨基酸的3a蛋白，外壳蛋白(coat protein, CP)ORF编码219个氨基酸的CP蛋白(TAV-BJ基因组RNA1、2和3 GenBank登录号分别为HQ424163，HQ424164和HQ424165)。TAV-BJ基因组cDNA克隆体外转录成RNA并接种于心叶烟上，结果表明转录产物在寄主上的症状反应和TAV-BJ病毒粒子RNA的接种相一致，TAV-BJ基因组cDNA侵染性克隆具有活性。由TAV-BJ各个基因片段与缺失2b基因的黄瓜花叶病毒Fny株系(Cucumber mosaic virus, CMV-FnyΔ2b)构建的假重组病毒接种于心叶烟，结果显示TAV-BJ的RNA2和RNA3能恢复CMV-FnyΔ2b在寄主上症状反应。嵌合型RNA3F3aTcp和RNA3T3aFcp的症状反应结果表明，F1F2Δ2bRNA3T3aFcp在寄主上产生花叶症状与F1F2Δ2bT3相一致。本研究获得TAV-BJ的基因组序列，成功构建侵染性克隆，同时发现TAV-BJ的3a基因具有CMV-Fny的2b基因的某些功能。

木霉的纤维素酶系中通常缺少β-葡萄糖苷酶，导致了终产物抑制，木霉生长速度明显没有青霉快，因此，来源于青霉的纤维素酶受到了越来越多的重视。通过热不对称交错PCR(TAIL-PCR)技术从草酸青霉(Penicillium oxalicum)M菌株中克隆得到外切葡聚糖酶基因cbh1(GenBank登录号: HQ843504)。该基因全长为1 641 bp，无内含子序列，编码547个氨基酸，具有Glu236，Asp238和Glu241典型催化残基，推测属于糖基水解酶第7家族。将cbh1克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9中，构建重组表达质粒pPIC9-cbh1，电击转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115菌株。阳性重组子经测序及活性分析表明，cbh1基因成功分泌表达，表明来源于草酸青霉的外切葡聚糖酶基因首次在毕赤酵母中获得成功表达。重组酶活性分析表明，其活性可达56 IU/mg，最适反应pH、温度分别为6.0和55℃，且pH和温度稳定性均较好。研究结果认为，cbh1基因的克隆丰富了纤维素酶的基因资源，其在毕赤酵母中的成功表达也为该类纤维素酶基因高效工程菌株的构建提供了基础。

纤维素酶的工业应用一直受酶活性低，成本高的限制，为了提高中性内切葡聚糖酶的活性，本研究利用易错PCR技术对来自枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)C-36的内切葡聚糖酶基因进行定向进化研究，在酶分子水平上改造内切葡聚糖酶分子。实验获得了最佳突变株b-15和b-28，其内切葡聚糖酶活力比亲本酶分别提高了2.1和3.6倍。序列分析表明：突变体b-15有6个碱基发生了突变，分别是A360G、T402A、A419T、T648A、A1208G和A1397T，导致4个氨基酸突变，分别是N134K、Q140L、N403S和Q466L；b-28只有1个碱基发生了突变，导致了398位Lys突变为Arg。通过SWISS-MODEL服务器模拟酶的三维结构,分析表明，b-15改变的4个氨基酸分别位于催化结构域的第4和第5个α螺旋之间的转角和结合结构域的第5个β折叠及第9和第10个β折叠之间的转角；b-28的突变位于结合结构域的第4个β折叠。同时，对获得的两株突变株b-15 和b-28用正交试验优化产酶条件，优化后的酶活分别达到4.542和5.136 U/mL，是优化前的2.2和1.5倍。实验获得了酶活性提高的内切葡聚糖酶菌株，为进一步在分子水平研究内切葡聚糖酶的功能和其应用打下了基础，也为高酶活酶分子在其他高表达系统的表达提供了基础材料。

建立稳定的精子载体法技术体系对家畜的转基因育种等研究具有重要意义。为获得公猪精子与DNA最佳共孵育时间，优化建立猪精子载体法技术体系，本研究通过定量PCR、荧光显微镜检测和精液常规分析方法等，研究分析猪精子与DNA不同共孵育时间对猪精子活力、活率、DNA转染率、吸附DNA和内化DNA量的影响。结果表明，多聚乙烯亚胺(polyethyleneimine, PEI)包裹的标记DNA与精子共孵育15、30、60 和90 min后，随着孵育时间的延长，精子活力和活率有极显著下降(P<0.01)，而精子转染率呈极显著(P<0.01)或显著(P<0.05)上升，吸附外源DNA量和内化外源DNA量也呈上升趋势，但是30 min后不同孵育时间之间差异不显著(P>0.05)。此外，随着共孵育时间的延长，与精子转染率提高幅度相比，精子活力和活率的下降幅度更明显。综合考虑精子活力、活率、转染率、吸附DNA量和内化DNA量等参数，猪精子与外源DNA共孵育时间以30 min为最佳。

为提高牛性别分离精子体外受精的效率，比较精卵共孵育8和22 h受精卵的体外发育能力，使用G-1/G-2序贯培养液和SOFaa培养液培养牛性控受精卵，筛选出一种适合牛性控胚胎体外培养的培养液。精卵共孵育22和8 h，牛性控受精卵的卵裂率分别为(55.9±4.52)%和(50.88±4.44)%，囊胚发育率分别为(35.05±5.02)% 和(41.16±5.12)%，差异均不显著(P>0.05)；精卵共孵育8 h组的囊胚孵化率(52.56±6.95)%显著高于22 h组(39.81±6.38)% (P<0.05)。用SOFaa 和G-1/ G-2培养牛性控受精卵，其体外发育率无显著差异。但G-1/G-2液中受精卵发育到第7 天 时囊胚内细胞数(113.9±9.46)显著高于SOFaa组 (102.0±9.97)(P<0.05)。性控精子与卵子共孵育8 h可提高牛性控受精卵的囊胚孵化率，G-1/G-2培养液更利于牛性控受精卵的体外培养。

用质粒制备绝对定量PCR标准曲线存在着作为标准品的双链环状质粒分子与待测样品单链线性cDNA分子结构不一致的问题。为了消除二者之间的差异，确保绝对定量PCR测定方法的准确性，我们在用质粒制备标准曲线和测定未知样品中特定基因mRNA分子拷贝数时进行了两个改进：1)用酶切的方法使环状质粒线性化，用线性质粒制备标准曲线；2)将未知样品cDNA扩增出一条正义链，再与作为标准曲线的质粒标准品同时开始荧光定量PCR循环。实验结果表明，1)具有相同拷贝数的环状和线性质粒在一起进行定量PCR测定时，环状质粒所得的Ct值大于线性质粒所得的Ct值(P <0.05)；2)本研究测定的cDNA样品中先扩增一次测出的起始拷贝数均大于未先扩增一次的测定结果。样品起始拷贝数两次测定结果的差异分析表明5个样品中有3个样品的测定差异达到了显著水平(P <0.05)。应用该方法改进的鸡GATA5基因绝对定量PCR的标准曲线能够准确地反应目的产物扩增。经改进的质粒制备绝对定量PCR标准曲线的方法更为简便易行，并提高了测定的准确性。

本研究通过把构建的短发夹结构 RNA(shRNA)真核表达载体导入鸡胚，检测鸡胚性腺分化期质粒载体在鸡胚体内代谢情况及雌性鸡胚性腺中芳香化酶基因(CYP19A1) mRNA表达效率，进而探讨利用该方法在鸡胚体内进行特定基因干涉的可行性。实验针对CYP19A1基因构建了4条特异性表达载体，一条非特异性表达载体。每个实验组选取45个新鲜种蛋作为实验材料进行胚盘下腔注射，并设立空白对照组。鸡胚发育12 d时，检测各处理组鸡胚肝脏组织中质粒存在情况，并取其左侧性腺组织进行目标基因的荧光定量分析。研究结果表明，导入组在12日胚龄时所有鸡胚基因组中均可检测到绿色荧光蛋白基因(EGFP)；荧光定量结果显示，导入特异性表达载体cyp-580、cyp-1083和cyp-1295 后，对应雌性鸡胚性腺CYP19A1 mRNA表达效率显著低于空白对照组，干涉效率分别为：73%、52%和85%；特异性表达载体cyp-1403组CYP19A1 mRNA表达效率与空白对照组相比有所降低但无显著性差异。本实验为诱导鸡胚性反转提供了新方法并建立了鸡胚发育期特定基因体内干涉新平台。