猪(Sus scrofa)对饲料中植酸磷的消化利用效率很低，其粪便中排放大量未吸收的磷，对环境产生严重污染，在猪唾液腺中表达分泌植酸酶是解决猪粪磷污染的一条新途径。为了制备唾液腺特异表达植酸酶的新型减磷排放转基因猪，本研究构建了一条由猪腮腺分泌蛋白基因(parotid secretory protein, PSP)启动细菌源植酸酶基因appA(acid phosphoanhydride phosphohydrolase)表达的转基因载体，并利用体细胞核移植技术获得14头原代(F0)转基因克隆猪，经PCR鉴定，其中8头为阳性猪。PCR分析显示，appA基因在转基因猪的唾液腺组织特异表达，但在肾脏、肝脏、心脏、十二指肠等组织中不表达。营养代谢分析证明，转基因猪粪磷排放量比非转基因猪显著减少了16%(P＜0.05)，而转基因猪对干物质和能量的表观消化率以及对Ca、P的消化率均高于野生型猪，但未达到显著水平。外源基因从F0转基因猪稳定遗传至F1，并且Southern blot分析显示，外源基因是以单拷贝形式整合至转基因猪基因组。F1转基因猪的appA表达模式与F0转基因猪相似，其只在唾液腺中特异表达，且以颌下腺表达最高，其次是腮腺和舌下腺，在肾脏、心脏、肝脏等组织不表达。本研究成功获得唾液腺特异表达植酸酶转基因猪，为培育新型减磷排放的环保转基因猪新品种提供了科学依据。

毛乳头细胞(dermal papilla cells, DPCs)，对毛囊再生具有诱导能力，并一定程度上决定毛囊的大小，在毛囊周期变化过程中发挥关键作用。本研究旨在优化陕北白绒山羊(Capra hircus)次级DPCs培养液体系，探讨miR-206对次级毛乳头细胞表达模式影响，分析miR-206与次级毛囊周期性发育关系，探索其在陕北白绒山羊皮肤毛囊发生过程中的作用。本研究采集陕北白绒山羊生长期皮肤样本，采用钝性分离与中性蛋白酶及胶原酶Ⅱ消化相结合的方法分离单根毛囊并剥离毛乳头；配制5组细胞培养液，利用细胞免疫荧光染色的方法检测毛乳头细胞中α-平滑肌激动蛋白基因(α-smooth muscle actin, α-SMA)和CD133的表达；利用脂质体3000介导miR-206模拟物转染次级毛乳头细胞，qRT-PCR检测7个与毛囊周期变化相关基因的表达情况。本研究成功进行了毛乳头细胞原代和传代培养，毛乳头细胞3 d即可贴壁并伴有迁出；同时添加双抗、雌二醇(β2 estradiol, β2)、胰岛素-转铁蛋白-硒 (insulin-transferrin-selenium, ITS)和表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)的培养液中毛乳头细胞从贴壁时间和迁出效率及细胞活力上均优于其他组，建议绒山羊次级毛囊生长期毛乳头细胞培养液为改良杜氏伊格尔培养基(dulbecco's modified eagle medium: nutrient mixture F-12, DMEM/F12)(1∶1)、10% 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、双抗(100 IU)、β2(0.3 μg/mL)、ITS(5.0 μg/mL)、EGF(7.0 μg/mL)。与对照组相比，miR-206转染毛乳头细胞后，蛋白络氨酸磷酸酶N1基因(protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 1, PTPN1)、骨形态发生蛋白2基因(bone morphogenetic protein 2, BMP2)表达量极显著升高(P＜0.01)，BMP4表达量无显著差异(P＞0.05)，与BCL-2相关的永生基因(BCL-2 associated athanogene 4, BAG4)、MAX二聚蛋白4基因(MAX dimerization protein 4, MXD4)、胰岛素样生长因子1基因(insulin like growth factor 1, IGF-1)和成纤维细胞生长因子受体2基因(fibroblast growth factor receptor 2, FGFR2)表达量极显著下降(P＜0.01)。经筛选分析BAG4可能是miR-206的候选靶基因。本研究成功对毛乳头细胞培养液进行了优化，转染的miR-206能够在绒山羊次级毛乳头细胞中稳定表达，初步判断其过表达对生长期毛囊的发育具有一定的抑制作用。本研究为进一步研究miR-206在毛囊周期发育中的分子机制提供了理论依据。

为丰富南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus, SRBSDV)的预测预报体系，本研究利用Gateway原核表达系统，将SRBSDV结构蛋白P10和非结构蛋白P9-1进行了大量表达，纯化的表达蛋白分别免疫新西兰大白兔(Oryctolagus cuniculus)获得抗血清，抗血清的间接酶联免疫吸附分析(indirect enzyme-linked immunosorbent assay, in-ELISA)效价分别为1∶6 400和1∶3 200，Western blot检测结果表明，制备的2种抗体均具特异性。利用免疫捕获RT-PCR(immunocapture RT-PCR, IC-RT-PCR)和斑点酶联免疫吸附分析(dot enzyme-linked immunosorbent assay, dot-ELISA)方法比较两种抗体检测水稻(Oryza sativa)和白背飞虱(Sogatella furcifera, WBPH)带毒率的应用效果，结果表现一致，说明SRBSDV结构蛋白P10和非结构蛋白P9-1均可用于病毒的田间检测，为病害的预测预报奠定了基础。

磷脂酰肌醇转运蛋白Sec14是最先在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中发现的磷脂酰肌醇转运蛋白，含有一个典型的SEC14保守结构域。Sec14p磷脂酰肌醇转运蛋白广泛存在于真核生物细胞中，并参与膜运输途径、质膜发育、脂肪酸代谢、根毛的生长等生命活动，但未见此蛋白在作物逆境胁迫的有关报道。为研究Sec14p基因在小麦(Triticum aestivum)发育及逆境胁迫中的功能，本研究采用电子克隆方法从小麦京花9号中得到一个Sec14p基因，命名为TaSEC14p-5 (GenBank登录号: KU639968)。氨基酸序列分析表明，该基因ORF全长为984 bp，编码327个氨基酸，相对分子质量为37.1 kD，理论等电点为7.70。在植物中该蛋白有典型的SEC14类基因家族保守域SEC14和一个CRAL_TRIO_N结构域。进化和聚类分析表明，小麦TaSEC14p-5基因与粗山羊草(Aegilops tauschii)磷脂酰肌醇转运蛋白AeSEC14p基因和水稻(Oryza sativa)磷脂酰肌醇转运蛋白Os02g0200000基因亲缘关系较近，蛋白相似度分别为96.45%和88.38%。采用qRT-PCR技术，对小麦孕穗期不同组织和不同非生物胁迫幼苗进行表达分析。发现该基因在根、茎、叶、颖壳、雄蕊和种子中均有表达，且在茎中表达量较高，雄蕊次之，根最低；该基因受高盐的强烈诱导，同时也受到脱落酸(abscisic acid, ABA) (200 μmol/L)、干旱(PEG6000)和低温(4 ℃)不同程度的胁迫诱导。TaSEC14p-5在NaCl、ABA、PEG和4 ℃四种不同胁迫处理下，总体趋势为先上升后下降。结果推测，TaSEC14p-5基因可能参与了NaCl、ABA、PEG6000和4 ℃等不同程度的非生物胁迫处理，为进一步改良小麦抗逆性等分子机理研究提供了新的依据。

成纤维生长因子18(fibroblast growth factor 18, Fgf18)是一种分泌型的信号分子，参与小鼠(Mus musculus)和绒山羊(Capra hircus)毛发生长及毛周期的调控。本研究克隆了小鼠Fgf18基因CDS区的片段，并将其连接于超高硫角蛋白(ultra-high sulfur keratin, UHS)启动子的下游。SacⅠ、BglⅡ、SphⅠ和EcoT14Ⅰ的酶切鉴定结果表明，成功构建了Fgf18基因毛囊特异表达载体pUHS-Fgf18。原核注射线性化pUHS-FGF18，共获得3只转基因小鼠。RT-PCR检测结果表明，Fgf18基因在转基因小鼠皮肤中的表达明显高于对照小鼠(P＜0.05)。转基因小鼠NO. 205皮肤中Fgf18的表达量明显高于对照小鼠(P＜0.05)，而肝脏、肾脏、心脏、睾丸、骨骼肌、脾、脑、肺、胃和小肠等组织则与对照小鼠无显著性差异(P＞0.05)。Western blot的结果表明，转基因小鼠皮肤的Fgf18蛋白水平显著高于对照组(P＜0.05)。同时本研究利用RT-PCR的方法检测了转基因小鼠中Fgf18基因的拷贝数，其拷贝数在8~210。本研究成功建立了毛囊特异表达Fgf18基因的转基因小鼠模型，不仅可为进一步研究Fgf18基因在毛周期及毛发生长中的功能及其作用机理提供必要的工具和手段，也可为生产Fgf18基因修饰的转基因绒山羊提供一定的理论基础。

为了探讨野鸭的遗传多样性和与家鸭的亲缘关系，本研究利用短串联重复序列(short tandem repeat, STR)分型技术对绿头野鸭(Anas platyrhynchos)、西湖野鸭(A. platyrhynchos)、奉化野鸭(A. platyrhynchos)、斑嘴野鸭(A. poecilorhyncha)、针尾野鸭(A. acuta)和赤嘴潜鸭(Netta rufina) 6个野鸭群体(共计269只)，以及家鸭品种绍兴麻鸭(A. platyrhynchos domestic)60个个体在11个位点上的遗传多样性进行了检测。结果表明，在7个群体中共检测到了141个有效等位基因(effective number of alIeles，Ne)，平均有效等位基因为12.821，期望杂合度(expected heterozygosity，He)为0.856，多态信息含量(polymorplism information content, PIC)为0.845。11个位点均为中高度多态位点，适用于鸭的遗传多样性分析。7个群体的遗传多样性丰富，PIC在0.310~0.960之间。F-统计量分析显示，所有位点的Fst在0.047~0.469之间，平均为0.171，表明群体间的遗传变异较大。Nei氏遗传距离分析及系统发育树显示，绿头野鸭、西湖野鸭、奉化野鸭和绍兴麻鸭遗传距离较近，与赤嘴潜鸭、斑嘴野鸭和针尾野鸭的遗传距离较远，同时这3个群体间的遗传距离也较远，并且赤嘴潜鸭单独聚为一类。此外，绍兴麻鸭与绿头野鸭遗传距离远小于其与斑嘴野鸭的遗传距离，提示绍兴麻鸭起源于绿头野鸭的可能性更大。本研究通过对6个野鸭品种的遗传多样性及与绍兴麻鸭的亲缘关系分析，进一步完善了野鸭与家鸭的遗传结构。

如何利用基因组、转录组以及代谢组学等海量信息确定基因功能，并阐述其调控机制是生命科学研究领域的核心内容之一。本研究利用种群间数量性状遗传变异与相应基因表达量差异之间的关联性，尝试一种功能基因筛选的快速方法，首先利用已经发表的拟南芥(Arabidopsis thaliana)生物信息数据，运用线性相关模型，根据拟南芥种群遗传变异导致的叶片表皮毛数量性状差异和对应种群基因表达量差异的相关性，筛选与表皮毛性状功能相关的基因，从33 554个基因中共筛选到1 747个相关基因，其中负相关基因195个，正相关基因1 552个。对筛选基因集合进行基因本体(Gene Ontology, GO)富集分析，结果表明，筛选到的基因主要富集于植物防御、先天免疫、胁迫反应、茉莉酸刺激应答、机械损伤反应和芥子油苷代谢等生物功能，特别筛选到和表皮毛发育及其防御代谢物分泌有关的基因，如诱导叶片表皮毛分化起始的MYB结构域蛋白基因MYB23，对叶片表皮毛发育具有重要影响的缺陷表皮毛因子1 (distorted trichomes 1, DIS1)，参与吲哚芥子油苷合成的细胞色素P450家族蛋白基因(cytochrome P450 family 81 subfamily F polypeptide 2, CYP81F2)和MYB51。将本研究筛选基因功能富集结果与前人对表皮毛的功能研究成果做对比，证明了本研究中所用方法的可行性。因此，在与数量性状有关目的基因筛选的研究中，此方法可以作为参考，对于其他物种的数量性状研究也具有借鉴意义。

由于高密度工厂化养殖、海水污染等原因，牙鲆(Paralichthys olivaceus)养殖产业面临前所未有的危机，本研究以历年培育的抗病、速生牙鲆为亲本于2015年建立了57个家系，包括11个F3代和46个F4代家系。选择其中46个家系在146日龄和164日龄分别进行迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)感染实验，配对样本t检验表明，两次实验无显著差异(P＞0.05)。感染后的存活率分析表明，不同家系在抗迟缓爱德华氏菌的能力上存在显著差异(P＜0.05)，从中鉴定出抗病力强的家系5个(F1551, F1503, F1501, F1550和F1505)，其存活率均大于70%。根据46个家系的日增重率确定了4个快速生长家系(F1533, F1551, F1514和F1502)，日增重率均大于0.225 0 g/d。2015年牙鲆抗迟缓爱德华氏菌的抗病遗传力为 0.177±0.020，为低遗传力，抗病性状选育适合家系选育。亲本抗病育种值变化范围为(-1.962±0.646)~(2.110±0.546)，父母本育种值均较高的家系为F1551、F1550、F1501和F1505，其中，存活率最高的F1551家系的父母本育种值是所有家系父母本中最高的，表明具有良好抗病性能的F1551家系的父母本具有很好的育种性能。本研究通过家系选育、细菌感染实验及遗传参数和育种值分析，筛选出了抗病性强、生长速度快及父母本育种值高的家系，为培育抗病、生长快速牙鲆新品种提供了理论支持。

利用生物信息学分析方法挖掘玉米(Zea mays)不同组织间差异表达的基因，揭示玉米生长发育过程的分子机理，本研究从NCBI数据库中下载获得玉米自交系Mo17和B73根和芽的转录组数据，发现了5个在根中高表达的氧甲基转移酶(O-methyltransferase, OMT)基因，在B73全基因组中鉴定到另外的23个拷贝。对玉米的28个氧甲基转移酶基因的结构、保守模体以及进化分析表明，其不同于咖啡酸氧甲基转移酶(caffeic acid O-methyltransferase, COMT)基因和咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶(caffeoyl coenzyme A 3-O-methyltransferase, CCoAOMT)基因，是一类新型的氧甲基转移酶基因家族。这类基因家族含有5个进化分支，其中有两个进化分支分别包含苯并噁嗪类基因7(benzoxazinless 7, Bx7)和Bx10，参与苯并噁嗪类物质的生物合成，表明该类基因在玉米的抗病虫反应中发挥着重要作用。染色体结构与进化分析表明，这类新型氧甲基转移酶基因家族的扩增大多是通过串联重复和片段复制来实现的。对这些基因在玉米的巢式关联定位(nested association mapping, NAM)群体亲本中的表达模式分析表明，其表达模式十分复杂。该研究结果为进一步了解COMT基因的生物学功能及其利用提供了理论依据和参考，并对研究该基因家族的催化机制及其表达调控模式具有重要的指导意义。

为研究绵羊(Ovis aries)酪氨酸蛋白激酶受体(tyrosine kinase A, TrkA)基因组织表达特征及其SNPs与产羔性状的关联性，本研究以TrkA基因为研究对象，利用qRT-PCR分析其在湖羊心、肝、脾、肺、肾、瘤胃、十二指肠、背最长肌、脂肪、下丘脑、垂体和卵巢等12种组织中的表达水平，同时采用DNA混合池测序和限制性长度片段多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)等技术检测TrkA基因在963只有产羔记录湖羊(n=526)和小尾寒羊(n=437)群体中的多态性，及其与产羔性状的关联性。结果表明，TrkA基因在卵巢、肺和肝脏中的表达水平最高，在心脏中次之，在背最长肌、瘤胃、脂肪、下丘脑、垂体、脾、肾和十二指肠间表达量较低。通过DNA池测序和RFLP分析，在TrkA基因的内含子9和14分别检测到NC_019458.2:g.105281586C＞T和NC_019458.2:g.105284248G＞C两个突变。在NC_019458.2: g.105281586C＞T位点，小尾寒羊和湖羊群体中均检测到3种基因型，分别为CC、CT和TT型，其中CT为优势基因型，C为优势等位基因；在该位点，湖羊群体遗传杂合度(heterozygosity, He)和遗传纯合度(homozygosity, Ho)均为0.50，有效等位基因数 (effective allele numbers, Ne)为1.99；小尾寒羊He=0.51，Ho=0.49，Ne=1.95；多态信息含量(polymorphic information content, PIC)均为0.37，且在小尾寒羊群体中偏离了Hardy-Weinberg平衡状态。在NC_019458.2:g.105284248G＞C位点上同样检测到 GG、GC和CC 三种基因型，其中GC为优势基因型， C为优势等位基因；该位点在湖羊群体He和Ho均为0.50，Ne=2.00;小尾寒羊He=0.49，Ho=0.51，Ne=1.96。PIC均为0.37；χ2适合性检验结果表明，湖羊群体在该位点显著偏离于Hardy-Weinberg平衡状态。多态位点与绵羊产羔数的关联性分析表明，NC_019458.2:g.105281586C＞T与湖羊和小尾寒羊的产羔数显著相关(P＜0.05)，而NC_019458.2:g.105284248G＞C突变位点仅与湖羊的产羔性能显著相关(P＜0.05)。本研究结果表明，TrkA基因可作为绵羊产羔性状早期筛选的候选基因，其SNPs可为绵羊繁殖性状分子标记辅助选择提供依据。

UTX(ubiquitously transcribed tetratricopeptide repeat X chromosome)和JMJD3(jumonji domain containing 3)是组蛋白H3赖氨酸27位三甲基化(histone H3 lysine 27 trimethylation, H3K27me3)去甲基化酶，可以调控动物机体生长、肌肉发育、调节代谢等重要生理功能。本研究根据小鼠(Mus musculus)UTX和JMJD3 mRNA序列设计3对引物，分别构建了体外转录载体pMD19T-T7UTX和pMD19T-T7JMJD3。分别将体外转录 mRNA注射进小鼠卵母细胞，并利用免疫荧光方法对H3K27me3进行检测。转录产物经电泳检测，结果显示，UTX与JMJD3条带清晰与预期大小相符；通过显微注射mRNA的卵母细胞，其H3K27三甲基化修饰明显减少。本研究成功构建了UTX与JMJD3体外转录载体，并在细胞水平证明转录产物能够翻译出具有活性的酶，为利用此载体研究UTX与JMJD3在生长发育及相关疾病发生中的机制提供基础资料。

原核注射技术已经是目前制备转基因小鼠(Mus musculus)最有效的手段，但不同实验室所报道的转基因效率差异较大，效率不高仍是该技术的主要缺点。为提高转基因小鼠的制备效率，本研究对转基因小鼠制备过程中的原核注射的多个方面都进行了改进，尤其是在注射针直径、外源基因浓度、单/双原核注射以及胚胎移植等主要步骤上的进行了优化。实验结果表明，不同浓度的外源基因对转基因小鼠的阳性率有很大影响。外源基因为1.00、2.50、3.00和4.00 μg/mL浓度时，转基因小鼠阳性率分别0.67%、14.9%、30.6%和21.4%。其中，外源基因浓度在3.00 μg/mL极显著高于其他各组(P＜0.01)。采用阳性率最高的3.00 μg/mL浓度又进行了单双/原核注射比较，发现转基因阳性率在进行双原核注射组显著高于单原核注射组(24.3% vs. 18.3%, P＜0.01)。将显微注射后的2细胞时期胚胎经输卵管移植到0.5、1.5和2.5 d假孕母鼠体内，产仔率分别为68.6%、67.6%和40.1%，转基因阳性率为17.4%、22.5%和10.1%。比较发现，0.5 d与1.5 d代孕母鼠产仔率没有差异，但1.5 d代孕组转基因阳性率(22.5%)显著高于其他组。结果表明，采用尽可能细的注射针、2~4 μg/mL的DNA载体浓度、双原核注射、1.5 d的假孕母鼠和正确的胚胎移植操作，是获得高效率转基因小鼠的关键。本研究对从事动物转基因技术研究的实验室提供一些有益的借鉴。

异种器官移植是解决供体器官短缺的有效途径之一，猪(Sus scrofa)是人类(Homo sapiens)异种器官移植的理想供体。然而，异种移植物进入受体后将被受体巨噬细胞清除，其主要原因是巨噬细胞表面的受体-信号调节蛋白α(singal regulatory protein α, SIRPα)不能特异地识别异种细胞表面的整合素相关蛋白(integrin associated protein, IAP又称CD47)，导致移植物细胞被受体内的巨噬细胞吞噬并清除。本研究在敲除α-1, 3-半乳糖基转移酶基因(α-1, 3-galactosyltransferase knockout, GTKO)的巴马小型猪基础上，转入hCD47基因，制备表达hCD47基因的GTKO/hCD47巴马小型猪，可避免超急性排斥反应并减弱受体巨噬细胞对移植物细胞的吞噬。首先构建巨细胞病毒增强子和鸡β肌动蛋白启动子(cytomegalovirus early enhancer/chicken β-actin promoter, CAG)调控的hCD47基因表达载体pCAGGS-hCD47-Neo，转染GTKO巴马小型猪的耳成纤维细胞，然后通过体细胞克隆技术制备转基因克隆猪。利用PCR对克隆仔猪进行转基因鉴定，通过qRT-PCR、Western blot和免疫组化等方法分析hCD47在转基因猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰腺等组织的表达。抽取存活仔猪血液进行生理指标检测，监测其健康状况。通过体细胞克隆技术获得了13头转基因克隆猪，PCR鉴定均为hCD47基因阳性猪。qRT-PCR结果显示，hCD47基因在各器官中的表达量由高至低依次为胰腺、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏和心脏。Western blot及免疫组化结果进一步证实hCD47基因在胰腺、肝脏等中均具有较强表达，与qRT-PCR结果一致。血液生理指标显示，存活仔猪健康状况良好。本研究成功制备了表达hCD47基因的GTKO巴马小型猪，确证了hCD47基因在主要器官中的表达特征，将有助于探究hCD47基因在减弱受体巨噬细胞对异种移植各器官的排斥反应。

猪(Sus scrofa)内皮细胞的去唾液酸糖蛋白受体1(asialoglycoprotein receptor 1, ASGR1)是诱发异种肝移植后受体发生血小板减少症的主要诱因之一。本研究在α-1, 3-半乳糖基转移酶基因(α-1, 3-galactosyltransferase, GGTA1)敲除的五指山小型猪基础上，利用规律成簇间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9, CRISPR/Cas9)结合体细胞核移植技术制备ASGR1基因敲除猪，针对猪ASGR1基因设计并构建了靶向表达载体单链导向RNA1 (single guide RNA1, sgRNA1)，将sgRNA1与增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)质粒共同电转染GGTA1基因敲除猪耳成纤维细胞，流式细胞仪富集筛选带绿色荧光的细胞后培养单细胞克隆。实验结果表明，PCR测序检测培养获得的41个单细胞克隆，37个克隆发生基因突变，ASGR1基因突变效率为90%，其中双等位基因敲除的细胞克隆30个，效率高达73%。选择4个ASGR1基因敲除类型不同的细胞为核供体进行核移植，将早期重构胚移植到4头受体猪，2头妊娠至终期，产仔猪6头，Western blot显示ASGR1基因敲除仔猪的肝脏中没有ASGR1的表达。对sgRNA1的13个潜在脱靶位点，分别设计引物进行PCR扩增和测序，结果显示没有脱靶现象。总之，本研究利用CRISPR/Cas9结合体细胞核移植技术快速高效地制备了GGTA1/ASGR1基因敲除五指山小型猪模型，有望解决异种肝移植后出现的血小板减少症，为临床过渡肝的应用研究提供了良好的研究材料。

血小板-内皮细胞粘附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule-1, CD31)是内皮细胞表面一种重要的膜分子，常作为特异性标记鉴定内皮细胞。然而，CD31是否可作为纯化猪(Sus scrofa)肝窦内皮细胞(porcine liver sinusoidal endothelial cell, pLSEC)的特异性标记还有待验证。本实验通过CD31流式分选分离纯化pLSEC，观察分离后的pLSEC是否具有标志性的窗孔结构。以α-1,3-半乳糖苷转移酶基因敲除(α-1,3-galactosyltransferase knockout, GTKO)的五指山小型猪为研究材料，采用胶原酶原位肝脏灌注、离体消化，Percoll梯度离心，异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)-CD31标记pLSEC进行流式分选。结果表明，分离得到的pLSEC在倒置显微镜下细胞呈典型的内皮细胞形态，铺路石样排列；通过透射电镜观察到细胞具有窗孔结构，通过环境扫描电镜观察到pLSEC与猪主动脉内皮细胞(porcine arterial endothelial cell, pAEC)细胞表面结构具有明显区别，pLSEC具有特殊的窗孔结构。利用实时荧光定量PCR检测pLSEC、pAEC和猪耳成纤维细胞(porcine ear fibroblast cell, pEFC)的CD31、细胞粘附因子(cell adhesion molecules, CD146)、血友病因子Ⅷ基因(hemophilia factor Ⅷ, Ⅷ-F)、血管性血友病因子基因(von willebrand factor, vWF)的表达。结果表明，pLSEC的CD31、CD146、Ⅷ-F和vWF表达量显著高于pAEC和pEFC。利用免疫荧光法检测到pLSEC具有摄取细胞膜红色荧光探针(1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate, DiI)标记的乙酰化低密度脂蛋白(acetylated low density lipoprotein, Ac-LDL)的内吞功能。总之，利用CD31分离纯化的pLSEC，具有典型窗孔结构和内吞功能，同时高表达CD146、Ⅷ-F和vWF等肝窦内皮细胞的标记分子，为进一步研究异种肝移植的血小板减少症的问题提供了良好的细胞材料。

QuantStudioTM 3D 数字PCR (QuantStudioTM 3D digital PCR, 3D-dPCR)是一种基于超高密度亲疏水微孔芯片实现数字PCR分液原理的新型核酸绝对定量平台，在转基因生物定量领域具有极大的应用前景。本研究基于3D-dPCR平台，以转基因玉米(Zea mays)MON863混合样品为例，建立基于单重和双重数字PCR体系的转基因生物(genetically modified organisms, GMOs)含量分析方法。与传统qRT-PCR比较发现，在缺乏样品纯度、纯合度信息的情况下，数字PCR能够较好地排除这些因素的影响，测定准确的量值。研究结果表明，QuantStudioTM 3D 数字PCR是一种适用于转基因生物含量分析的精确定量方法，还可反映转基因玉米种子的基因型。本研究基于3D-dPCR建立的转基因玉米MON863单重和双重定量方法为转基因检测提供了新的方法和参考。

基因打靶技术可以定向改变细胞或生物遗传信息，正逐步成为功能基因组学研究的重要分子生物学手段。其中，类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease, TALEN)技术已在多个农作物中实现基因的定点修饰，其已成为作物分子育种一种有效的技术手段。本研究利用TALEN技术，将水稻(Oryza sativa)基因组中已知的苯达松 (bentazone) 抗性基因CYP81A6进行定点突变，以创制苯达松敏感突变体育种材料。通过农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)介导转化粳稻品种武运粳7号(Oryza sativa subsp. japonica ‘Wuyunjing 7’)愈伤，共获得110株T0水稻阳性转化苗，利用改良的PCR模板快速制备方法并结合高分辨率溶解曲线(high resolution melting, HRM)检测技术筛选T0代阳性植株，获得3株CYP81A6基因突变体材料，定点突变效率约为2.73%。基因测序分析及田间测试结果表明3株材料存在不同形式的基因序列变异，且均为嵌合体材料。对T1代群体继续进行苯达松敏感测试，发现该群体仍会出现大量的苯达松敏感植株，但未能筛选到纯合突变体。本研究虽未能获得稳定遗传的苯达松敏感基因纯合水稻突变体材料，但为下一步优化试验方案及继续筛选突变体积累了丰富的经验。

基因芯片标准化是其特异灵敏检测病原的基本保障，本研究针对金标银染可视化基因芯片制备中点样缓冲液的使用、点样次数、杂交温度、杂交时间、胶体金浓度以及银染时间分别进行优化实验，分析其对金标银染可视化共检基因芯片杂交信号的影响。分别选取猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)的S和M基因，猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis of swine virus, TGEV)的N和S基因，A型猪轮状病毒(Group A porcine rotavirus, GAR)的VP7和NSP4基因设计引物。根据目的基因片段设计5'端修饰有15个T碱基的60-mer寡核苷酸探针，分别以1∶1混合点样缓冲液和直接进行喷样两种方式，利用芯片点样仪喷样分别喷样1 次、2 次、3 次于醛基玻片上制成基因芯片。应用不对称PCR对实验室构建保存的三种腹泻病毒的阳性质粒进行生物素掺入标记，分别在40、45、50和55 ℃与基因芯片杂交30、60、90和120 min。利用生物素-链霉亲和素的特异性链接，分别将稀释10、20、30、40、50及60倍的链霉亲和素修饰的纳米金颗粒引入反应体系，通过不同银离子染色时间后后，直接眼观实验结果。应用优化后的标准化可视化芯片和RT-PCR同时对173份临床送检病料进行检测，以评价芯片临床应用。结果表明，应用探针和点样缓冲液1∶1混合的方法进行1次喷样制作的基因芯片，在50 ℃环境中杂交90 min后，与4 μg/mL链霉亲和素修饰的纳米金颗粒结合，再进行12~14 min银染，经过10 次重复性实验，可确定为金标银染可视化基因芯片的最佳优化条件。临床病料可视化芯片检测结果与RT-PCR检测结果一致。本研究确定了病毒性腹泻可视化共检芯片的最佳反应条件，为该技术的临床应用标准化研究奠定了基础。

DELLA蛋白是GRAS蛋白家族中的一个亚家族，在赤霉素(gibberellin, GA)信号转导通路中起负调控作用。DELLA不仅参与了GA信号转导，也参与其他激素如生长素、脱落酸(abscisic acid, ABA)、乙烯、茉莉酸(jasmonic acid, JA)等信号转导和生物合成，在植物生长发育过程中扮演了重要角色。本文综述了DELLA蛋白编码基因的克隆、表达情况，并阐述了DELLA蛋白参与的激素信号转导和与其他因子的互作，以便更好地揭示DELLA信号网络系统及其作用机制。

随着分子生物学技术的快速发展，动物育种已经步入了以数量遗传学、分子遗传学等多学科理论指导的分子育种时代。动物生物育种展现出重大的应用价值和产业化前景，有利于推动我国畜禽养殖业良种的选育和本土化进程。本文主要综述了国内外动物全基因组选择和动物基因组编辑技术等生物育种技术的发展历程、研究进展和应用情况，并从技术创新和技术产业化角度，分析了我国动物种业发展现状和存在的问题，提出了促进生物种业发展的对策和建议。