转基因动物的外源基因通过使用体细胞克隆与胚胎移植的方法将表达载体转入细胞后获得，大多以随机整合的形式存在于受体动物的基因组中，而转基因动物中外源基因的整合拷贝数是影响外源基因表达水平及遗传稳定性的重要因素之一，作为转基因动物遗传稳定性的鉴定指标，获得存活的转基因动物后便有必要对其外源基因拷贝数进行检测。为了研究转基因阿尔巴斯白绒山羊(Capra hircus)基因组内外源海葵红色荧光蛋白(red fluorescence protein from Discosoma sp., DsRed)基因的拷贝数与其表达量之间是否存在一定的联系，本研究采用较鉴定外源基因拷贝数的传统方法DNA印迹杂交（Southern blot）更为高效率、高灵敏度、高准确性的绝对定量qRT-PCR法检测了6只转基因白绒山羊外源DsRed基因表达框中3个不同片段的拷贝数。结果表明，外源基因3个片段的拷贝数分别为巨细胞病毒(Cytomegalovirus, CMV)启动子：2.80±0.38~13.68±0.16；DsRed基因：1.34±0.04~11.84±0.02；CMV启动子与DsRed连接处：1.58±0.04~19.22±0.38。通过qRT-PCR中相对定量的方法检测了6只转基因白绒山羊外源DsRed基因mRNA表达量，将其与外源基因中3个不同片段的拷贝数数据分别使用SPSS软件进行相关性分析后，相关性系数P值的结果为：CMV启动子为P=0.763；DsRed基因为P=0.665；CMV启动子与DsRed连接处为P=0.803，3组P值均大于0.05，无显著性相关。上述结果表明，在所检测的6只转基因阿尔巴斯白绒山羊中外源CMV启动子启动的DsRed基因的表达量与其在转基因白绒山羊基因组内的拷贝数在0.05的水平没有显著相关性。另外验证了绝对定量qRT-PCR法在大型转基因家畜的外源基因拷贝数的研究中的可靠性：其重复性良好，误差可控，可以成为检测转基因动物外源基因拷贝数的首选方法。

摘要 超长链脂肪酸延伸酶6(elongase of very long chain fatty acids 6，ELOVL6)主要催化C12-C16饱和或单不饱和脂肪酸的延伸，是长链脂肪酸延长反应的限速酶。本研究根据云南黑山羊的基因组序列（ Gene ID:NW_005100691.1）设计引物，以血液DNA组织为模板，利用PCR技术克隆获得西农萨能奶山羊ELOVL6基因启动子的全长序列，通过生物信息学分析，构建了10个包含ELOVL6启动子不同缺失片段的荧光素酶报告基因载体，与pRL-TK内参载体共同转染乳腺上皮细胞，利用双荧光素酶系统检测不同片段的启动子活性。结果表明，克隆得到ELOVL6基因启动子全长序列2 370 bp(包含转录起始位点上游2 168bp)，与牛、人和鼠的基因组序列同源性分别为94%、81%和80%，ELOVL6启动子上无典型的真核生物启动转录元件TATA框。缺失突变研究发现，ELOVL6基因启动子前端存在负调控元件，启动子核心区域位于转录起始位点上游109～40 bp，该序列包含PPAR、LXR、SREBP-1、Sp1及NF-Y等转录因子的结合位点，为ELOVL6基因启动子功能研究奠定的基础。

花生β-1,3-葡聚糖酶基因启动子(Arachis hypogaea promoter of β-1,3-glucanase, Ah-Glu-Pro)属于诱导型的启动子。为分析该启动子序列中对外源信号分子响应的重要顺式调控元件，利用交错式热不对称PCR(thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction, TAIL-PCR)方法扩增得到长度为970 bp的Ah-Glu-Pro序列。PLACE 和 PlantCARE在线预测结果表明，该启动子序列中含有对病原菌及水杨酸(salicylic acid, SA)响应的顺式调控元件，如GRWAAW、GT1-motif、W-box、RAV1AAT、INRNTPSADB、AMMORESIVDCRNIA1和BIHD1OS。根据预测结果，在5'端设计5个正向引物Glu-F、Glu-P4、Glu-P3、Glu-P2和Glu-P1，3'端设计一个反向引物Glu-R，5个引物对扩增得到该启动子序列Ah-Glu-P以及5'端4个缺失片段Ah-Glu-P4~Ah-Glu-P1，长度分别为931、767、650、376和217 bp。将这5个片段分别克隆到pCAMBIA1301-xylA载体中，构建以木糖异构酶基因(xylose isomerase gene, xylA)作为安全筛选标记、以β-葡萄糖苷酸酶基因(β-glucuronidase gene, GUS)作为报告基因的相应5个植物表达载体pCAMBIA1301-xylA-Glu-P~pCAMBIA1301-xylA-Glu-P1。将这5个表达载体分别转化洋葱(Allium cepa)表皮细胞，进行GUS蛋白组织化学染色及GUS酶活性检测，结果表明，经SA诱导后，转入Ah-Glu-P~Ah-Glu-P3 3个载体的洋葱表皮细胞中的GUS酶活性分别提高1.45、2.16和1.27倍，转入Ah-Glu-P2~Ah-Glu-P1载体的洋葱表皮细胞在SA诱导前后GUS酶活性无明显差别。结合软件预测结果推测，在启动子Ah-Glu-P、Ah-Glu-P4和Ah-Glu-P3内部存在的RAV1AAT、MYBCOREATCYCB1和INRNTPSADB为对SA响应的正调控元件；在Ah-Glu-P~Ah-Glu-P4之间存在的GT1-motif和AMMORESIVDCRNIA1为对SA响应的负调控元件。对这些重要顺式调控元件功能的进一步确认将为通过调控实现花生内源β-1,3-葡聚糖酶基因的高效表达、提高花生(Arachis hypogaea)的抗病性、以及在花生遗传转化过程中特异诱导表达启动子的有效利用提供理论依据。

由小麦条锈菌(Puccinia striiformis f. sp. tritici, Pst)引起的小麦条锈病是我国小麦(Triticum aestivum)最严重的流行病害之一。中国小麦条锈菌表现出高度的遗传多样性和毒性变异，现已研究表明小麦条锈菌经有性生殖可发生致病性变异并产生新的小种。冬孢子作为小麦条锈菌有性阶段的开始，是小麦条锈菌生活史中完成有性生殖过程必不可少的阶段。为分析小麦条锈菌产冬孢子时期寄主植物的叶片总蛋白表达变化，探究寄主植物如何响应冬孢子产生，本研究利用三氯乙酸(trichloroacetic acid, TCA)/酚抽提法提取产冬孢子时期和同时期未接种的小麦叶片总蛋白，经双向电泳技术分离后，利用PDQuest软件进行分析并选取显著上调表达的蛋白进行Orbitrap质谱鉴定。结果表明，在产冬孢子时期的寄主叶片总蛋白图谱中发现22个蛋白点(上调表达大于1.5倍且符合t检验)，经功能注释发现这些差异蛋白参与糖代谢、抗逆境以及植物衰老相关代谢途径。之后利用qRT-PCR技术对蛋白水平的结果进行验证，结果发现这22个蛋白点中有16个差异蛋白的基因在转录水平上调表达(相对表达倍数大于1.5倍)，证实了蛋白结果的可靠性。本研究通过双向电泳技术发现小麦条锈菌冬孢子的产生影响了寄主叶片参与糖代谢、抗逆境及植物衰老相关代谢过程蛋白的表达，并推测小麦条锈菌冬孢子的产生可能与寄主植物的衰老有关。本研究为进一步深入了解小麦条锈菌冬孢子阶段寄主植物与病原菌的互作机制提供了一定的理论基础，对于揭示冬孢子的形成机制和全面了解小麦条锈菌的有性阶段有重要意义。

转化生长因子β(transforming growth factor β, TGF-β)是一类具有多种功能的蛋白超家族，在细胞免疫、细胞增殖分化和组织损伤的修复中起着关键性作用。本研究从半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)肝脏中克隆获得了TGF-β1和TGF-β3基因。推导的TGF-β1和TGF-β3氨基酸序列均含有多个N糖基化位点和一个TGF-β家族标签。系统进化树分析显示，半滑舌鳎TGF-β1和TGF-β3分别与鱼类的TGF-β1和TGF-β3亲缘关系最为密切。qRT-PCR结果表明，半滑舌鳎TGF-β1和TGF-β3基因在健康鱼的多个组织中均有表达，二者在皮肤中表达量最高，在肌肉中表达量最低。经哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)感染后，TGF-β1在肝脏、脾脏和肾脏中呈现先上升后下降的表达趋势，在感染48 h后的肝脏中表达量达到最大值，是对照组的3.17倍；TGF-β3在脾脏、肾脏和鳃中也呈现先上升后下降的表达趋势，在感染24 h后的鳃中表达量达到最大值，是对照组的4.71倍。以上结果提示，TGF-β1和TGF-β3可能在半滑舌鳎抵御细菌感染的免疫中发挥了重要作用，本研究为证明二者参与机体免疫调节提供了有力证据，为半滑舌鳎分子免疫研究提供了理论依据。

大麦条纹病由麦类核腔菌(Pyrenophora graminea)引起，是一种世界性病害。为进一步探索条纹病与大麦(Hordeum vulgare)的相互作用，以大麦品种甘啤6号和Issto为实验材料，在接种麦类核腔菌(代号DWC)7和21 d后提取叶片蛋白，运用2-DE和质谱分析技术研究条纹病菌侵染后叶片蛋白质组学的变化。结果显示，与对照相比，甘啤6号和Isotta差异表达量在1.4倍以上的蛋白点28个，其中在甘啤6号中表达上调的蛋白点4个，下调的6个，诱导表达的2个，抑制表达的2个；在Isotta中，表达上调的蛋白点3个，下调的4个，诱导表达的4个，抑制表达的3个。质谱鉴定分析发现，表达上调的蛋白包括二磷酸核酮糖羧化酶A(2号蛋白点)、肌动蛋白(9号蛋白点)、核糖体再循环因子(ribosome-recycling factor, RRF)(10号蛋白点)、ATP合酶γ链(11和27号蛋白点)、琥珀酸脱氢酶(辅酶q)黄素蛋白亚基(15号蛋白点)和假定蛋白(26号蛋白点)；表达下调的包括过氧化物还原蛋白(4号蛋白点)、1,5-二磷酸核酮糖羧化酶大亚基(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit, RuBisCo)(3、5、12、14、16和18号蛋白点)、ATP合酶CF1α亚基(13号蛋白点)、Ycf3蛋白(17号蛋白点)和α-1,4葡聚糖蛋白合酶(alpha-1,4-glucan-protein synthase, UTPG)(28号蛋白点)；诱导表达蛋白包括假定蛋白(6号蛋白点)、脂氧合酶2(lipoxygenase 2, LOX2)(7号蛋白点)、捕光叶绿素a/b结合蛋白质(light harvesting chlorophyll a/b-binding protein, LHCP)(19号蛋白点)、3-磷酸甘油酸激酶(3-phosphoglycerate kinase, PGK)(20号蛋白点)、凝集素(21号蛋白点)和ATP合酶γ链(22号蛋白点)；抑制表达的蛋白包括RuBisCo(1、8、24和25号蛋白点)和二磷酸核酮糖羧化酶小链(ribulose bisphosphate carboxylase small chain, RuBPCase)(23号蛋白点)等。按照其功能分类，这些差异表达蛋白点分别参与了光合作用、蛋白质生物合成、植物防卫反应、能量代谢和细胞信号转导、细胞结构和纤维素生物合成等生理功能。这些差异表达蛋白可能与大麦响应条纹菌侵染过程有关，研究结果有助于从蛋白质水平揭示不同抗性大麦品种抗条纹病的抗性机制。

白菜(Brassica rapa subsp. pekinensis)在种植加工和运输过程中，易遭受各种机械伤害。本研究对白菜叶片进行伤害处理，利用气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)联用、GC和高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)分别测定内源信号分子茉莉酸(jasmonic acid, JA)、水杨酸(salicylic acid, SA)和乙烯(ethylene, ET)的含量或释放量变化，并利用cDNA芯片杂交分析伤害处理后基因表达总体变化，结合半定量RT-PCR分析JA、ET和SA信号途径中标志基因表达量变化。结果显示，大量基因在白菜伤害后上调表达，包括转录因子、小G蛋白、受体蛋白激酶、蛋白激酶、防御相关基因、JA/ET合成途径基因、吲哚芥子油苷降解途径基因、细胞壁修饰相关基因、色氨酸生物合成途径基因、苯丙烷和生物碱代谢途径相关基因、分子伴侣等。对伤害处理后JA含量及其信号途径标志基因表达分析发现，在伤害处理后6、12、24和48 h，叶片JA含量显著高于未进行伤害处理的空白对照叶片中JA含量(P＜0.05)；JA合成途径关键酶基因丙二烯氧合酶(allene oxide synthase, AOS)、丙二烯环氧化酶(allene oxide cyclase, AOC)和脂氧合酶(lipoxygenase, LOX)、JA合成途径上游的磷脂酶D(phospholipase D, PLD)和JA途径的应答标志基因黑芥子酶作用蛋白(myrosinase-associated protein, MYAP)诱导上调表达，表明JA介导的信号途径在白菜伤害应答反应中起了重要作用。对伤害处理后ET释放速度及其信号途径基因表达分析发现，ET在伤害处理后2和6 h大量合成，ET合成途径基因1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶6(1-aminocyclopropane-1-carboxylicacid (ACC) synthase 6, ACS6)和ACC氧化酶(ACC oxidase, ACO)在伤害早期诱导上调表达，乙烯响应转录因子4(ethylene-responsive transcription factor 4, ERF4)在伤害后0.17、0.5、2、6、12和24 h均上调表达，表明ET途径参与了早期的伤害反应。JA和ET共同调控途径的标志基因β-1,3葡聚糖酶(β-1,3 glucanase, BGL)在伤害各时间点均上调表达，表明JA和ET协同调控白菜伤害反应。对伤害处理后SA含量及其信号途径基因表达分析发现，游离态SA和总SA的含量明显下降，SA途径的标志基因病程相关蛋白(pathogenesis-related protein 1a, PR1a)和PR5在伤害后期有一定程度的诱导表达，而在伤害早期其表达受到抑制或未发生变化，表明SA信号途径在伤害早期受到抑制，在伤害后期活化，可能参与了伤害后期的防卫反应。本研究阐明了白菜在伤害处理后，基因表达总体水平产生变化，JA、ET和SA合成及其介导的信号途径标志基因表达产生变化，有助于揭示白菜伤害反应分子机制。

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因(Phosphoenolpyruvate Carboxykinase 1 (Soluble), PCK1)是糖异生及甘油异生的关键基因。为分析PCK1基因在家鸭(Anas platyrhynchos domesticus)驯化过程中是否出现表达差异以及是否受到驯化选择，本研究分别以绿头野鸭(Anas platyrhynchos)、绍兴鸭及北京鸭作为野生品种、蛋鸭及肉鸭品种代表，检测PCK1基因在这3个品种中的表达水平、杂合度(Hp)以及遗传距离(Fst)。表达分析发现，与绿头野鸭相比，PCK1 在绍兴鸭及北京鸭肝脏组织中表达量分别下降了3倍、10倍；在脂肪组织中分别下降了3倍、26倍。根据全基因组Z(Hp)及Z(Fst)分布情况，以Z(Hp)＜-3、Z(Fst)＞2作为选择信号筛选标准。按照此标准发现PCK1基因下游82.4 kb处(KB742479.1: 2 220 079~2 259 967 bp)出现选择信号。与绿头野鸭相比，该区域在绍兴鸭及北京鸭中杂合度均降低，Z(Hp)值分别为-3.92及-3.63；遗传距离均最大，Z(Fst)值分别为3.91及2.54。对该区域临近基因(ENSAPLG00000002901, C20orf85, PCK1)的表达分析发现，仅PCK1基因在鸭驯化过程中出现表达差异。因此，推测该选择信号可能导致了PCK1基因在家鸭与野鸭间的表达差异。本研究首次较深入的探索了鸭的驯化遗传机制；研究发现鸭驯化过程中PCK1存在表达变化，同时其下游82.4 kb处出现选择信号，这些结果为进一步研究PCK1的功能提供了线索。

耳廓是哺乳动物听觉器官的重要组成部分。猪(Sus scrofa)耳廓大小经历长期的人工驯养和选育后变异很大。目前，对猪耳廓大小的研究主要集中在遗传机理的解析，对其在细胞水平的研究还尚未完善。本研究通过酶法分离得到猪耳廓软骨板细胞并在体外培养，将原代猪耳廓细胞连续培养，用流式细胞仪分别检测从3~10代耳廓软骨板细胞的大小和分布情况，以及耳廓软骨板细胞与软骨干细胞阳性标记物CD44和CD90的结合能力。同时，将3~10代细胞分别与Annexin V-FITC /PI(细胞凋亡试剂盒)孵育，用流式细胞仪进行凋亡特性分析。通过流式细胞检测发现，体外培养的软骨板细胞由软骨细胞(P1)和软骨前体细胞(P2)组成。P1细胞占大多数(69.4%)，呈纤维状；P2细胞为少数(11.0%)，呈椭圆状。与CD44和CD90结合分析表明，P1细胞几乎不能与CD44结合，绝大部分P2细胞能与CD44结合，P1和P2细胞均能与CD90相结合，P2细胞结合能力略强于P1细胞。分别对两类细胞进行细胞凋亡分析后发现，P1细胞体外培养只有少量细胞凋亡或坏死，活细胞率达(96.61±1.32)%，说明P1细胞在体外传代过程中能维持稳定状态；P2细胞处于晚期凋亡和坏死细胞的比例＞83%，说明P2细胞在体外培养条件下细胞状态不稳定。本研究结果表明，体外建立一套针对于软骨前体细胞培养的体系很有必要，以保证软骨前体细胞可以持续增殖、并可向软骨细胞转化。本研究为今后以猪耳廓作为模型开展人类弹性软骨再生医学研究提供了基础依据。

探索小麦(Triticum aestivum)叶绿素合成及叶绿体形成发育的遗传和生理机制对小麦高光效育种具有重要意义。为研究叶色变异形成的生理机制及其对叶绿体形成发育的影响，本研究以新创制的3个黄绿小麦近等基因系(near-isogenic lines, NILs)(黄化系1-20YY、黄绿系1-20YG和绿色系1-20GG)为材料，研究不同发育时期的叶片可溶性物质含量和抗氧化酶系统活力等性状，并对其叶绿体形态结构进行了比较分析。结果表明，叶色黄化对叶片可溶性糖含量和可溶性蛋白质含量的影响远大于其对游离脯氨酸含量的影响，除苗期黄化系1-20YY的可溶性糖含量和可溶性蛋白质含量显著低于黄绿系1-20YG和绿色系1-20GG(P＜0.05)，各发育期黄绿系1-20YG的可溶性糖含量和可溶性蛋白质含量与绿色系1-20GG的差异不显著。同时，叶色黄化对叶片抗氧化酶系统的活性有一定的影响，其中对过氧化物酶(peroxidase, POD)活性的影响大于其对超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和过氧化氢酶(hydrogen peroxidase, CAT)活性的影响。从 3个NILs的叶绿体形态结构比较分析结果可以看出，黄化系1-20YY叶绿体多呈不规则状且分布趋向叶肉细胞中央，其基质类囊体和基粒类囊体不发达且联结不紧密，与绿色系1-20GG叶绿体形态结构差异明显；而黄绿系1-20YG叶绿体形态与绿色系1-20GG有差异，多呈近球形，但其超微结构与1-20GG系基本一致，基质类囊体和基粒类囊体较发达且联结较为紧密。研究结果为进一步探讨叶色黄化的生物学机制提供了基础资料。

转基因棉花(Gossypium hirsutum)MON757转化体是孟山都公司研发的转cry1Ac基因的抗虫棉，在美国、加拿大、澳大利亚等国被批准种植或允许用作食品饲料原料，但在我国尚未获得批准种植和应用。目前国内外尚没有转基因棉花MON757特异性的纯杂合检测和定量检测方法报道。为了检测我国棉花中MON757转化体的存在情况，本研究以转基因棉花MON757转化体的插入位点基因组序列和外源插入片段/基因组连接区序列为靶标，建立了特异性的MON757转化体纯杂合定性PCR检测方法和实时荧光定量PCR(quantitative realtime PCR, qRT-PCR)检测方法。所建立的MON757转化体纯杂合定性PCR检测方法的检测引物由分别位于MON757外源基因插入位点两侧基因组和外源插入片段上的3条引物组成，能准确地鉴别棉花植株和种子中MON757转化体的纯合、杂合状态。建立的MON757转化体特异性的qRT-PCR检测方法具有良好的可重复性和灵敏度，其检测下限(Limit of Detection, LOD)为11个拷贝，定量下限(Limit of Quantitative, LOQ)为44个拷贝。用此方法对2014年湖北省的49份商品棉花种子进行了检测，结果有5份种子样品检测到MON757转化体。采用MON757转化体纯杂合定性PCR检测方法对这5份种子样品各60个单粒分别进行了检测，同时采用qRT-PCR检测方法对这5份种子样品进行定量测定。结果表明，有1份含量在1.5%左右，4份含量超过了20%，两种方法的测定结果基本一致。本研究建立的MON757转化体纯杂合定性PCR检测方法和qRT-PCR检测方法在田间棉花植株和种子中MON757转化体纯杂合状态的测定以及混合样品中MON757转化体含量的测定方面都具有重要的应用价值。

由荔枝霜疫霉(Peronophythora litchii)引起的荔枝霜疫霉病是荔枝(Litchi chinensis)生产上的重要病害，建立霜疫霉快速准确检测方法，对于该病的早期诊断和及时防控至关重要。本研究以荔枝霜疫霉三磷酸鸟苷(GTP)结合蛋白基因(GTP-binding protein gene, Ypt1)为靶序列，设计特异性引物，建立了巢式PCR和环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)两种检测方法，并进行特异性和灵敏度验证。特异性检测表明，只有不同来源的21个荔枝霜疫霉菌株经PCR扩增获得249 bp的特异性条带，同时，在钙黄绿素指示剂的作用下，LAMP检测显示绿色，且扩增产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳出现特有的梯形条带，而其他13种不同卵菌近缘种及8种常见病原真菌42个菌株均未观察到这些现象。灵敏度检测显示，将特异引物PvYF1/PvYR1与疫霉属Ypt1通用引物Yph1F/Yph2R进行巢式PCR扩增后，其检测灵敏度在DNA水平上可达100 fg/25 μL，较常规PCR提高1 000倍，而LAMP方法检测灵敏度是巢式PCR的10倍。本研究分别采用常规PCR、巢式PCR和LAMP方法对采集自福建省荔枝霜疫霉病典型症状及可疑症状的荔枝叶片或果实进行检测，并用传统分离方法进行验证。结果表明，在漳州采集的30份样品中，常规PCR、巢式PCR和LAMP方法的阳性检出率分别为17/22(77.3%)、20/22(90.9%)和21/22(95.5%)；在莆田采集的25份样品中，常规PCR、巢式PCR和LAMP方法的阳性检出率分别为15/17(88.2%)、16/17(94.1%) 、17/17(100%)。可见LAMP方法明显提高了检测效率，并且具有检测程序便捷，所需设备简单和肉眼能判断结果的优势，适合基层部门及田间荔枝霜疫霉快速检测。