恒定链(invariant chain, Ii)是脊椎动物重要的免疫分子，在主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)Ⅱ类分子递呈抗原中起重要作用。为研究鸡(Gus gallus)Ii与MHCⅡ类分子的关系，本研究构建了4个沉默Ii基因的慢病毒表达载体，并比较了其干扰效果。首先，用自行设计合成的4条鸡Ii基因干扰序列，分别经一步退火法获得双链短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)，并将其用双酶切法插入慢病毒载体pLL3.7。4个构建的慢病毒重组载体经酶切和测序鉴定，分别命名为pLL-Ii-shRNA236、pLL-Ii-shRNA376、pLL-Ii-shRNA527和pLL-Ii-shRNA539。然后把这些重组载体分别转染293T细胞(转染腺病毒E1A基因(lethal infection gene)的人肾上皮细胞系)，进行病毒包装，再用包装的慢病毒感染鸡源巨噬细胞HD-11。结果表明，重组载体感染的293T细胞表达绿色荧光蛋白，用包装的慢病毒接种293T细胞，其滴度达2.2×107~5.1×107 TU/mL；接种HD-11细胞的感染率均达到95%以上。最后用荧光定量PCR方法检测其沉默鸡源巨噬细胞HD-11的鸡Ii mRNA的效率，与对照组相比，4个重组慢病毒干扰效率分别为37%、52%、88%和78%；其中，pLL-Ii-shRNA527的干扰效率最高。综上所述，本研究从4个构建的重组载体中筛选出1个高效沉默鸡巨噬细胞Ii基因重组载体，并提示shRNA序列是决定沉默特定基因的关键。实验结果为研究鸡Ii在递呈抗原中与其他免疫分子的关系提供了基础资料。

脂质运载蛋白(lipocalin)是一类广泛存在于生物界的小分子蛋白质家族，具备一些抗体所没有的优点。为了构建库容量大、多样性好的核糖体展示模拟抗体Anticalin文库，本研究以脂质运载蛋白家族之一大菜粉蝶(Pieris brassicae)中提取到的胆汁三烯结合蛋白基因(bilin-binding protein, bbp)(GenBank登录号: X76568.1)为模板，设计了包含16个随机突变位点的引物，采用重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR, SOE-PCR)构建bbp基因文库。然后，利用SOE-PCR法引入核糖体展示元件(T片段与P片段)，体外构建核糖体展示模拟抗体Anticalin基因文库。结果表明，本研究成功构建了模拟抗体Anticalin基因文库，其库容达到3.76×1023，文库的可扩增性、完整性及多样性良好，为筛选多种小分子化学残留的模拟抗体提供了基础资料。

植酸是植物种子中肌醇和磷的主要存在形式，由于单胃动物体内缺乏能分解植酸的酶，以植酸磷形式存在的磷难以被单胃动物吸收。植酸酶作为饲料添加剂已经广泛应用，但在食品中的应用研究刚刚开始。本研究以黑曲霉(Aspergillus niger)CICC2462基因组DNA为模板，PCR扩增植酸酶基因片段，并在其两端加上糖化酶基因(glaA)的5'同源臂和3'同源臂，构建农杆菌Ti质粒基因置换载体pSZHG-phy。通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法转化黑曲霉，筛选以植酸酶基因替换糖化酶基因的同源重组转化子，以实现植酸酶基因的高效表达。结果表明，筛选获得4株同源重组转化子，同源重组率为100%，通过分光光度计法测定重组植酸酶菌株的最高发酵酶活为316.2 U/mL，为出发菌株的20.8倍，证明植酸酶phy基因是可以在黑曲霉糖化酶生产菌中实现高效表达。本研究为进一步构建食品级植酸酶工程菌提供了基础资料。

PR结构域蛋白1基因(PR domain containing 1, with ZNF domain, PRDM1)作为原始生殖细胞(primordial germ cell, PGC)形成过程中的一个重要起始因子，在胚胎干细胞(embryonic stem cell, ESC)向PGC的发育分化过程中发挥重要作用。为了研究其在成体干细胞诱导分化中的作用，本研究PCR克隆获得小鼠(Mus musculus)PRDM1基因(GenBank 登录号: JX154081.1)，构建了PRDM1慢病毒表达载体pCDH-PRDM1，通过293T细胞包装病毒，用携带有PRDM1基因的病毒颗粒转导脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell, hUC-MSC)。结果表明，PRDM1基因成功在hUC-MSC中超表达；PRDM1基因能引起生殖相关基因胚胎特定时期抗原-1(stage-specific embryonic antigen-1, SSEA-1)、多能性相关蛋白3(developmental pluripotency associated 3 Dppa3, STELLA)、干细胞生长因子受体(stem cell growth factor receptor, C-KIT)和性别决定基因-同源盒2(sex determining region Y-box 2, SOX2)的上调，为进一步研究该基因的功能和提高干细胞向生殖细胞诱导分化研究奠定了一定的基础，并且为hUC-MSC向生殖细胞的诱导分化提供了一个新的思路。

卵母细胞特异性连接组蛋白(oocyte-specific linker histone, H1foo)是组蛋白家族的成员之一，特异性地定位于哺乳动物卵母细胞和早期胚胎中。在小鼠(Mus musculus)、牛(Bos taurus)和猪(Sus scrofa)等体外受精和体细胞核移植过程中均存在H1foo与其它成分的置换，并且这种置换有利于供核体细胞染色质构象的打开，实现基因组的完全重编程，恢复全能性。为了探索H1foo在诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)的过程中对 iPSCs诱导效率的影响，本研究基于对猪H1foo的已有研究积累，选取猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblast cell, PFF)，构建能同时表达八聚体转录因子-4(octamer-binding transcription factor-4, OCT4)、性别决定基因相关转录因子-2(SRY-related high-mobility-group(HMG)-box protein-2, SOX2)、Kruppel样转录因子(kruppel-like factor-4, KLF4)和禽髓细胞瘤病病毒原癌基因(cellular homologue of avian myelocytomatosis virus oncogene, c-MYC)四因子(OSKM)的强力毒素(doxycycline, DOX)调控载体，利用电转的方法在OSKM-PFF中瞬时表达猪pVenus-H1foo后添加DOX开启重编程，瞬时表达猪H1foo，转染得到稳定的OSKM-PFF。通过对所获得克隆进行鉴定，并对所获iPSCs克隆数进行统计分析，结果发现，转染有猪pVenus-H1foo和空载体pVenus的OSKM-PFF细胞中的碱性磷酸酶阳性克隆数目无显著差异。本研究首次证明H1foo对猪iPSCs的诱导效率无显著影响，这为进一步研究体细胞核移植与iPSCs诱导这两种重编程手段的内在机制提供了基础资料。

超数排卵技术是获得大量卵母细胞、受精卵或不同发育阶段胚胎的主要手段之一。本研究选择发情前期昆白系小鼠(Mus musculus)，分别在超排当天的12:00、16:00、20:00和24:00，腹腔注射孕马血清促性腺激素(PMSG)，48 h后腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)，随即以1∶1的比例与单笼饲养的公鼠合笼过夜，并于次日清晨检查配种情况。超排小鼠卵母细胞、受精卵和胚胎回收结果表明，在12:00、16:00、20:00和24:00注射PMSG开始超排的小鼠，获取输卵管卵母细胞的适宜时间分别为注射hCG后16.23 、14.02 、15.93和12.98 h；获取受精卵的适宜时间分别为24.62、23.60、26.53和20.03 h；获取卵裂胚胎的适宜时间分别为42.76、42.39、41.85和40.47 h；获取4-细胞胚胎的适宜时间分别为56.87、57.84、57.31和56.92 h；获取8-细胞胚胎的适宜时间分别为66.89、67.39、66.20和66.07 h；获取桑椹胚的适宜时间分别为76.31、76.21、76.29和75.11 h；获取囊胚的适宜时间分别为100.65、97.14、93.91 和96.86 h；获取孵化囊胚的适宜时间分别为114.57 、112.34、112.11和110.28 h。 在本研究选择的不同时间注射PMSG进行小鼠超排时，超排小鼠的排卵、受精和早期胚胎发育时程基本一致；通过调整超排处理开始时间，可调整超排小鼠卵母细胞、受精卵和不同发育阶段胚胎的回收时间；可以根据不同研究对小鼠卵母细胞、受精卵或不同发育阶段胚胎的需要，合理安排小鼠超排起始时间。本研究为以小鼠卵母细胞、受精卵或不同发育阶段胚胎为研究材料的相关研究提供了技术支撑。

为摸索一种简单有效的小鼠(Mus musculus)卵母细胞去核方法，本研究对压电脉冲装置(Piezo)辅助显微操作条件下的小鼠中期Ⅱ(metaphaseⅡ, MⅡ)卵母细胞去核方法进行了改进，比较了改进的去核方法和常规去核方法，在无蔗糖或含蔗糖去核操作液中的去核效果及核移植重构胚的后续发育能力；用改进的去核法在无蔗糖的去核操作液中对卵母细胞进行去核，比较卵母细胞去核操作液及核移植操作液中添加不同浓度胎牛血清(FBS)时核移植重构胚的后续发育能力。结果显示，MⅡ期卵母细胞在无蔗糖和含3%蔗糖的去核操作液中通过调整显微镜物镜距离显示MⅡ期纺锤体区域的方法进行显核，显核率分别为98.4%(184/187)和98.7%(153/155)(P＞0.05)。在无蔗糖或含蔗糖的去核操作液中，用改进的去核法，即去核针穿过透明带后，紧贴MⅡ期纺锤体区域的质膜，施加负压将MⅡ期纺锤体区域吸住并将其直接拉出卵母细胞，去核率分别为84.6%和88.2%；用常规去核法在这2种去核操作液中去核，去核率分别为83.1%和88.6%，各组之间差异均不显著(P＞0.05)；用改进的去核法比常规去核法吸出的胞质少。用改进的去核方法在无蔗糖的去核操作液中去核后，构建的核移植重构胚发育到8-细胞、桑椹胚和囊胚的比率最高，桑椹胚发育率(16.3%)和囊胚发育率(5.8%)显著高于用该法在含蔗糖的去核操作液中去核组(5.1%和0)。用常规去核法在无蔗糖操作液及含蔗糖操作液中去核后，核移植重构胚的桑椹胚发育率分别为3.3%和1.2% (P＜0.05)，且均未获得囊胚发育。去核操作液和核移植操作液中添加20%FBS时，重构胚囊胚发育率显著高于添加10%FBS组(10.9%对 4.9%)(P＜0.05)，表明用改进的去核方法在添加20% 胎牛血清(FBS)的操作液中进行去核及核移植操作是可行的，而且对重构胚后续发育的支持能力较好。本研究为进一步提高小鼠体细胞核移植效率做出了有益的探索。

成熟卵母细胞的细胞质对供体细胞的重编程有作用，卵母细胞的成熟状态成为核移植过程的关键因素。为了研究卵母细胞体外成熟过程中卵母细胞生发泡破裂(germinal vesicle breakdown, GVBD)发生前后脱卵丘细胞对卵母细胞的影响，本研究采用猪(Sus scrofa)卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes, COCs)于体外培养，每隔5 h取卵母细胞采样，置于地衣红染液中染色，根据卵母细胞染色体构型的变化确定卵母细胞的分期，然后在21、27和42 h的卵母细胞进行脱卵丘细胞处理，观察极体数。体外培养不同时间压片观察结果表明，直径2~6 mm卵泡卵母细胞在体外培养时，2~17 h大部分卵母细胞处于GV期(88.30%~52.38%)；22 h有63.25%的卵母细胞处于生发泡破裂至前中期(germinal vesical breakdown~premetaphaseⅠ, GVBD~pre-MⅠ)；27 h处于中期Ⅰ(metaphaseⅠ, MⅠ)的卵母细胞最多(42.25%)；32 h处于后期Ⅰ(anaphaseⅠ, AⅠ)的卵母细胞比例最多(29.90%)；37 h处于末期Ⅰ(telophaseⅠ, TⅠ)的卵母细胞比例最多(40%)；42 h绝大部分卵母细胞达到了中期Ⅱ(metaphaseⅡ, MⅡ)(72.81%)。分别采取21、27和44 h的卵母细胞进行脱卵丘细胞处理，发现21 h脱卵丘细胞后卵母细胞成熟率为25.56%，低于27 h处理卵的成熟率(34.33%)，42 h脱卵丘细胞的卵母细胞的成熟率最高达到84.33%。结果说明，体外卵母细胞成熟过程中，卵丘细胞对卵母细胞的成熟具有重要意义，为进一步探讨和分析猪卵母细胞体外成熟培养的方法，改良体外培养体系，提高猪卵母细胞体外培养成熟率，进而提高胚胎体外培养质量提高奠定基础。

多能干细胞(pluripotent stem cells, PSCs)作为一类重要的细胞资源，成为目前国内外的研究热点，获得这类细胞在当今医学研究和生物技术的发展及应用中具有重要的意义。猪(Sus scrofa)由于其生理结构和代谢特征与人(Homo sapiens)较为相似，成为动物多能干细胞建系的重点研究对象。然而目前，猪多能干细胞建系工作仍存在很多难题。本文将从猪多能干细胞建系研究的进展和存在的问题入手，对照小鼠(Mus musculus)和人相关研究的成功经验，总结目前已经报道的猪多能干细胞的培养条件、调控因子、信号通路和基因表达特征，以期为建立猪胚胎干细胞和诱导多能干细胞系提供参考。

建立含有TetO-FUW-OSKM和FUW-M2rtTA的第二代猪(Sus scrofa domesticus)成纤维细胞，使其在添加强力霉素(doxycycline, DOX)而无需再次感染病毒的条件下可以重编程。将慢病毒(Lentiviral)质粒四环素调控基因(TetO)-FUW-OSKM和FUW-M2rtTA同时感染猪胎儿成纤维细胞(porcine embryonic fibroblasts, PEF)，在添加DOX的培养条件下，形成诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)。随后，将iPSCs通过形成拟胚体(embryoid body, EB)再分化为成纤维样细胞，即TetO-PEF细胞。TetO-PEF携带TetO-FUW-OSKM和FUW-M2rtTA两个载体，且外源四因子拷贝数一致，在+DOX条件下调控四因子表达，直接驱动细胞重编程。本研究建立了TetO-PEF细胞系，为优化猪iPSCs培养条件提供了新的细胞资源。

为进一步探讨小麦 (Triticum aestivum L.)T型细胞质雄性不育(T-CMS)育性恢复的遗传机理，并为利用T型不育系选育强优势杂交小麦分子辅助育种提供理论与技术支撑，本研究以小麦 ms(S)矮抗58/R113的F2代分离群体中的极端可育株和极端不育株分别建立恢复池和不育池，采用分布于小麦第一染色体群(染色体1A、1B和1D)及第六染色体群(染色体6A、6B和6D)上的196对SSR引物进行扩增筛选。结果表明，(1)位于1AS染色体上的3个SSR标记和位于6BS染色体上的4个SSR标记均在亲本和基因池间扩增出了稳定的多态性差异条带；(2)定位群体验证结果表明，恢复基因Rf1与1AS染色体上Xgwm136、Xgpw7062和Xgdm33标记的遗传距离分别为4.8、9.6和13.7 cM，3个标记与Rf1之间的顺序依次为Xgdm33、Xgwm136、Rf1、Xgpw7062；(3)恢复基因Rf4与6BS染色体上的Xgpw1079、Xgwm193、Xgpw7011和Xgwm508标记的遗传距离分别为3.4、6.8、13.7和21.5 cM，4个标记与Rf4之间的顺序依次为Xgpw7011、Xgpw1079、Rf4、Xgwm193和Xgwm508。研究还表明，T-CMS恢复系R113的育性是由Rf1和Rf4两对主效恢复基因和多对微效基因共同控制的，筛选的上述7个SSR标记可直接用于T型或者类似T型，如S型杂交小麦分子标记辅助育种，可有效提高对应恢复系的选择效率。

从水稻(Oryza sativa L.)育种材料广恢128、粳稻Kitaake、蜀恢955和蜀恢881的复合杂交F2群体中发现了一个簇生穗突变体，该突变体命名为TS(top-spikelet-two-grain mutant)。TS最显著的变异为穗部一、二次枝梗顶端表现为2~3个小穗簇生在一起。为了明确TS中所含簇生基因ts的遗传机理及其在水稻育种中的利用价值，本研究利用TS与G2480B(indica)杂交的F1、F2群体进行簇生性状的形态观察和遗传分析；利用3个携带有ts基因的转育纯系分析ts基因的应用前景。结果表明，F1群体表现为全部显性，F2群体出现3∶1显隐性状分离，突变性状受1对隐性单基因控制，能够稳定遗传。采用简单序列重复(simple sequence repeat, SSR)标记技术，将突变基因ts定位于第6染色体上的长臂端，位于RM20323和RM6298之间，遗传距离分别为5.1和5.6 cM。3个转育纯系中，L332在保持簇生性状的同时，与亲本G2480B相比，其产量性状无显著差异，蒸煮食味品质较优。ts基因的表达与水稻的单株穗数、每穗粒数、结实率、千粒重和单株产量无显著相关性。以上结果为ts基因在水稻育种上的利用提供了一定的理论基础。

棉花(Gossypium hirsutum L.)叶片早衰影响棉花产量和棉纤维质量，而乙烯利是一种重要的植物生长调节剂，对促进植物组织衰老有重要作用。DNA甲基化是表观遗传调控的重要组成部分，在高等植物的基因表达调控中发挥了重要作用。本研究应用甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplified polymorphism, MSAP)技术，探讨在不同乙烯利水平处理下，棉花子叶DNA甲基化水平和甲基化变化模式。结果显示，经300、500和700 mg/L乙烯利处理后，棉花子叶DNA甲基化比值分别为32.99%、35.45%和37.49%，都低于对照组(37.92%)；和对照组相比，经不同浓度乙烯利处理后，棉花子叶DNA发生甲基化变化位点的比率分别是2.71%、3.63%和4.88%，而去甲基化位点的比率分别为10.66%、9.84%和9.23%，并且随着乙烯利浓度的增加，棉花子叶DNA甲基化位点与去甲基化位点之比逐渐提高；本研究鉴定了17个MSAP差异基因片段，这些片段与NCBI中已知的功能基因存在同源性，包括果胶甲酯酶基因、细胞色素P450、乙醇脱氢酶基因、肌动蛋白解聚因子、翻译延伸因子等和乙烯利诱导棉花子叶衰老相关基因。研究结果提示，在乙烯诱导棉花子叶衰老的进程中，DNA甲基化参与了棉花子叶衰老的调控，为从基因组水平上揭示乙烯诱导棉花衰老的调控机制提供理论依据。

氨肽酶N(aminopeptidase N, APN)蛋白是猪(Sus scrofa)传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus, TGEV)和猪的流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)等一系列冠状病毒的受体蛋白。为探讨梅山猪APN基因的分子结构特征以及重要的变异位点，本研究通过PCR扩增和测序技术，结合生物信息学分析梅山猪APN基因功能区域和重要变异位点，对其蛋白质结构进行预测和分析。结果表明，梅山猪APN基因cDNA全长2 886 bp (GenBank登录号: KF280271)，含有20个外显子，编码961个氨基酸。与GenBank数据库公布的标准序列(登录号: NM_214277.1)相比，梅山猪APN基因编码区变异共引起10处氨基酸突变与2处氨基酸缺失，其中Phe82Asn、Leu107Phe、Leu108 Ile、Ser330Pro、Trp399Arg和 Glu465 Gly等6处突变位于APN酶催化活性区域，Gln747His突变、748Tyr和749Ser缺失突变位于APN病毒结合区域。蛋白结构和编码产物功能分析发现，pAPN为不稳定的亲水性蛋白，无信号肽，具有1个跨膜螺旋(跨膜区位于12~34氨基酸，二级结构元件以α螺旋和β折叠为主，编码产物主要参与细胞被膜(cell envelope)、中央中间代谢(central intermediary metabolism)、辅酶因子生物合成(biosynthesis of cofactors)等功能。Gln747His、748Tyr和749Ser缺失突变可能与氨肽酶N结合病毒能力有关。本研究对梅山猪pAPN基因功能的分析及变异位点的筛选，为今后筛选猪抗病毒性腹泻的有效遗传标记提供理论基础。

额尔齐斯河中蕴藏着丰富的冷水鱼类种质资源，江鳕(Lota lota)是其中之一，建立其精子冷冻保存技术和精子冷冻库，对种质资源保存具有重要意义。本研究利用无机盐、葡萄糖、蔗糖、胎牛血清等配制7种精子稀释液，以5∶1的比例稀释精液，激活后观察统计精子活力。结果显示，江鳕精子仅在SS、D15和CM中具有(13.33±2.89)%~(8.33±2.88)%活力。在此基础上配制22种梯度稀释液(SS-00~SS-10和D15-0~D15-7)，以同样的方法稀释和观察精子活力。结果显示，SS-0(56.67±5.77)%、 SS-2(63.33±5.77)%、SS-5(53.33±5.77)%和D15-7(63.33±5.77)%中精子活力较高，与鲜精活力(76.67±5.77)%接近(P＜0.05)。将二甲基亚砜(DMSO)和甲醇(MeOH)以3∶2比例配制成混合抗冻剂(DM)，分别以5%~12%浓度加入到精子稀释液SS-5和D15-7中，以5∶1比例稀释精液，冷冻保存精子。结果显示，冷冻前，5%DM的SS-5和D15-7中精子活力(73.33±5.77)%与鲜精无显著差异(P＞0.05)，当DM浓度升高到10%~12%时，精子活力接近于0；冷冻后，在DM浓度为6%的SS-5中，精子活力较高为(26.67±5.77)%(P＜0.05)；在DM浓度为7%的D15-7中，精子活力较高为(26.67±5.77)%(P＜0.05)。本研究结果为额尔齐斯河江鳕精子冷冻保存提供了一定的理论和技术依据。

甲状腺激素在鲽形目仔鱼的变态过程中起着重要的作用，而甲状腺激素的生物效应是由甲状腺激素受体(thyroid hormone receptors, TRs)介导的。本研究利用RACE技术克隆了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)TRβ基因的全长，并对其功能进行了生物信息学分析。结果显示，TRβ 基因(GenBank登录号: No. KJ499433) cDNA全长为2 345 bp，开放读框(open reading frame, ORF)长1 188 bp，编码396个氨基酸，5'-UTR 和3'-UTR 分别长454和703 bp。通过氨基酸序列比对发现，TRβ 氨基酸序列铰链区有一段由9个氨基酸残基组成的插入序列，推测这段序列可能为硬骨鱼类TRβ 基因所特有的。实时荧光定量PCR技术分析结果显示，TRβ 基因在各组织中均有表达，且在肝组织中的表达量显著高于其他组织(P＜0.05)；因此推测TRβ 基因在半滑舌鳎成鱼各组织中具有多样性的功能，而且其在肝脏的新陈代谢中起到重要的调节作用。在半滑舌鳎仔鱼变态时，TRβ基因的表达量随变态开始而迅速增加，在变态高峰期到达最高。药物处理实验结果显示，正常变态和提前变态的仔鱼TRβ 基因的表达水平均随变态开始而迅速上调，而变态被抑制的仔鱼中TRβ 基因的表达量则未出现显著变化，表明TRβ 是调控半滑舌鳎仔鱼变态过程的重要基因，在半滑舌鳎生长发育早期阶段起较关键作用。本研究为深入解析半滑舌鳎变态的分子机制提供了理论依据和参考。