mapk-like是一种信号转导相关促有丝分裂激活蛋白激酶家族基因，与线虫(Caenorhabditis elegans)中参与抵御Cry毒素的p38 MAPK含有类似的模序，其是否参与埃及伊蚊(Aedes aegypti)抵御苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)过程有待验证。为简便并大量获得RNAi验证所需的dsRNA，本研究利用RNaseⅢ缺陷型大肠杆菌(Escherichia coli) HT115高效和廉价的优点，根据已测序的促有丝分裂激活蛋白激酶家族基因mapk-like基因序列，设计特异性引物，PCR扩增大小为361 bp的目的片段mapk-like (GenBank 登录号: AAEL003728-RA)，将其连接到克隆载体pMD18-T上，利用限制性内切酶XbaⅠ和XhoⅠ将其插入到原核表达载体pLitmus28i的2个T7启动子之间，成功构建可诱导形成目的双链RNA (dsRNA)的原核表达重组载体 pLitmus28i-mapk-like，并转化大肠杆菌HT115，经IPTG诱导，1 mL菌液的dsRNA产量可达1.18 μg，电泳检测条带清晰，质量良好。此外，利用壳聚糖包裹dsRNA形成纳米微粒，上清经电泳检测表明，壳聚糖的聚沉效率良好，纳米微球可有效防止dsRNA从饲料琼脂块中游离出来，提高dsRNA的稳定性。埃及伊蚊幼虫摄取mapk-like基因的dsRNA后，相对转录表达水平为65.55%，表达量明显下调，饲喂效果良好。研究结果将有利于进一步筛选获得相关抵御基因，为建立一个基于RNA沉默防治蚊媒病的研究体系提供了基础资料。

当前铅资源的粗放式开采和使用对环境造成了严重的污染。利用微生物修复铅污染具有费用低、易操作、环境友好等优点，在水体和土壤铅污染治理中具有很好的应用前景。为了了解微生物对铅的吸附特性，本研究从铅锌矿尾矿坝分离到的一株耐铅节杆菌(Arthrobacter sp.)12-1(GenBank登录号: KM362724)，并研究其对铅的吸附过程和作用机制。研究耐铅节杆菌 12-1在含不同Pb2+浓度LB培养基中的生长情况表明，其最高可耐受800 mg/L Pb2+。在水溶液中，经24 h吸附，耐铅节杆菌 12-1可将Pb2+浓度从105 mg/L降至2.17 mg/L，吸附率为97.93%。显微成像(原子力显微镜, 扫描电镜)观察和能谱分析表明，耐铅节杆菌 12-1吸附铅后在细胞表面形成含铅的矿物。傅立叶变换红外光谱(FT-IR)分析表明，耐铅节杆菌 12-1细胞上的羧基、酰胺和磷酸基团可能参与了铅的吸附和固定过程。以上结果表明，从铅锌矿尾矿坝分离到的耐铅节杆菌 12-1对铅具有较好的耐受和吸附能力，显示其在铅污染环境修复中具有潜在的应用前景。本研究为细菌修复铅污染环境的实践提供了理论基础。

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)是一种已被广泛用于农业害虫生物防治的昆虫病原细菌。本研究从永春天湖山矿区采集的159份样品中分离出1株Bt，光学显微镜检测发现菱形伴孢晶体。以cry1/7/9、cry2、cry3、cry4/10、cry5、cry6、cry8、cry11和cry1I的通用引物对该Bt分离菌进行Cry毒素基因分析，利用SDS-PAGE和双向电泳-质谱法(2-dimensional electrophoresis/mass spectrometry, 2-DE/MS)对Bt分离菌进行蛋白鉴定。结果表明，分离菌含有cry1基因型，经克隆、测序后可知，菌株中的cry1亚基因型与cry1Ac有极高的同源性。分离株表达的晶体蛋白约为130 kD，通过蛋白质谱分析表明，杀虫蛋白为Cry1Ac，与PCR-RFLP所得出的结果一致；通过质谱分析还鉴定出分子伴侣GroEL、F0F1型ATP-β亚基合成酶、延伸因子Tu和丙酮酸脱氢酶。生物信息学分析结果表明，这些蛋白主要参与帮助新生肽的正确折叠、能源生产和转换，以及提高细胞的应激能力以抵御外界不良刺激。本研究从煤矿中分离鉴定出Bt菌，为发现新资源、新型杀虫蛋白基因以及利用微生物治理重金属污染提供基础资料。

浓香型白酒的生产是以窖池为基础，窖池窖泥中栖息着庞大的微生物群系，微生物间相互作用形成浓香型白酒的独特风味，尤其以芽胞杆菌为主。本研究从泸州老窖酒厂300年窖池窖泥中分离出23株好氧芽胞杆菌属(Bacilli)，经光学显微镜和菌落形态观察，23株好氧芽胞杆菌形态差异不显著。通过16S rDNA基因扩增，NCBI基因比对，构建系统发育树，结果表明，23株好氧芽胞杆菌主要为苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)、蜡样芽胞杆菌(B. cereus, Bc)和炭疽芽胞杆菌(B. anthrax)，菌种间亲缘关系存在差异；窖泥中分离出的23株好氧芽胞杆菌亲缘关系近，遗传多样性较低。本研结果为了解白酒发酵过程中老窖泥周围环境的变化、提高白酒品质提供基础资料。

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)N-酰基高丝氨酸内酯酶基因(auto inducer inactivation A, aiiA)编码的N-酰基高丝氨酸内酯酶(N-acylhomoserine lactonase, AiiA)能够水解植物病原菌群体效应的信号分子N-酰基高丝氨酸内酯(N-acylhomoserine lactone, AHL)，进而使革兰氏阴性细菌群体感应受到抑制，减弱病原菌的致病性。本研究将aiiA基因连接至分泌型穿梭表达载体pPICZαB，获得重组表达质粒pPICZαB-aiiA，线性化后电击转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，获得重组工程菌GS115-pPICZαB-aiiA。利用定点突变技术，对aiiA基因进行密码子优化，获得重组工程菌GS115-pPICZαB-MaiiA。以终浓度为1%的甲醇、28 ℃条件下诱导表达，重组工程菌GS115-pPICZαB-aiiA和GS115-pPICZαB-MaiiA均成功表达并分泌出AiiA蛋白。抗病性分析表明，分泌表达的AiiA蛋白能有效抑制胡萝卜软腐欧文氏杆菌(Erwinia carotovora)的致病性。AiiA蛋白在毕赤酵母中的分泌表达，拓宽了AiiA蛋白的获取途径，为AiiA蛋白的产业化提供理论依据。密码子优化为今后改造AiiA蛋白，提高AiiA蛋白的表达效率提供了新的思路。

为了解玉米(Zea mays)不同品种根际芽胞杆菌种群多样性信息，本研究采用稀释平板法，对10个玉米品种根际的芽胞杆菌进行了分离，并对其进行16S rRNA序列分析。结果表明，从10个玉米品种根际共分离到69个形态差异的芽胞杆菌菌株；16S rRNA序列分析表明，69个菌株鉴定为23个种，归属于3个属，芽胞杆菌属(Bacillus)、赖氨酸芽胞杆菌属(Lysinibacillus)和嗜冷芽胞杆菌属(Psychrobacillus)，其中芽胞杆菌属的种类和数量最多。玉米不同品种根际的芽胞杆菌的种类数量不同，QB662×QB2219和QB1013×QB446根际分离到的芽胞杆菌种类最多，均为8种；J106×QB572的芽胞杆菌菌落含量最高。玉米根际的优势种群主要为嗜气芽胞杆菌(B. aerophilus)、阿氏芽胞杆菌(B. aryabhattai)、简单芽胞杆菌(B. simplex)和苏云金芽胞杆菌(B. thuringiensis)，其他芽胞杆菌种类仅在一种或少数的玉米品种出现。QB662×QB2219根际的芽胞杆菌种类香农-威纳(Shannon-Wiener)指数(H)最大；QB948×QB48根际的芽胞杆菌种群香农-威纳多样性指数次之，但均匀度指数最高；J106×QB572的多样性指数和均匀度指数皆最低。菌株FJAT-17411、FJAT-17472、FJAT-17430 和FJAT-17442与GenBank中已报道16S rRNA基因序列的相似性为97%~98%，可能为芽胞杆菌的新种。本研究结果表明，玉米根际具有较为丰富的芽胞杆菌种群多样性，并存在一些潜在的新的微生物菌种资源。本研究对芽胞杆菌资源的开发和利用提供良好的实验材料和理论基础。

从海产虾壳上分离筛选拮抗放线菌、研究其抑菌活性具有重要的实践意义。藤黄轮丝链霉菌(Streptomyces luteoverticillatus)T0907-107是分离自海产虾壳上并经初筛和鉴定的一株链霉菌，为了进一步开发和利用该菌，本研究采用极性不同的5种溶剂(丙酮、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇和甲醇)，对该菌株的发酵液菌体活性物质进行了提取，对粗提物的理化性质和抑菌活性进行了初步研究。结果表明，其发酵液活性物质大部分存在于菌体中，采用甲醇和丙酮浸提的效果好，其抑菌圈直径分别为26.20和22.50 mm；对粗提物进行耐热性实验，结果表明，粗提物是一种能够耐60 ℃高温和一定酸碱的物质；粗提物对蛋白酶K稳定；菌体及粗提物对多种植物病原菌物如烟草炭疽病菌(Colletotrichum nicotianae Sacc.)、烟草赤星病菌(Alternaria alternata (Fries) Keissler)、烟草立枯丝核病菌(Rhizoctonia solani Kühn)、枇杷炭疽菌(C. gloeosporioides (Penz.) Sacc.)和白菜炭疽病菌(C. higginsianum Sacc.)有较强抑制作用。研究结果表明，甲醇和丙酮是较合适的萃取溶剂，该菌发酵液菌体粗提物极性强、稳定性好、有较广的抑菌谱，显示出好的开发前景。本研究为进一步鉴定该活性物质及开发和利用该菌提供了基础资料。

多杀菌素(spinosad)作为一种高效、低毒生物杀虫剂，已在农药、兽药、卫生用药等领域得到应用。中国关于多杀菌素的研究起步较晚，进展缓慢，目前仍无法实现产业化生产。本研究旨在分析刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)高产菌株ASAGF73与野生型菌株ATCC49460在发酵过程中多杀菌素合成基因簇(spinosyn biosynthetic gene cluster, spn)的表达变化及差异，初步判断影响多杀菌素合成的关键限速步骤。生物信息学分析表明，spn基因簇含有9个转录子，分别在各转录子中设计引物，进行RT-PCR检测其表达情况。结果显示，突变株ASAGF73中多杀菌素的产量提高可能与spn基因簇中部分基因的高表达有关，其中编码聚酮合酶(polyketide synthase, PKS)的基因和参与大环内联桥形成的基因表达量远高于野生型菌株的。在ASAGF73中编码鼠李糖转移酶的spnG基因在发酵前期过量表达，而在后期大量合成多杀菌素时表达减弱，有可能成为多杀菌素合成的限速步骤。本研究初步阐明能够提高多杀菌素产量的分子机制，为构建多杀菌素高产基因工程菌提供参考。

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)Cry毒素domainⅡ β-折叠顶端的3个loop在靶标昆虫中肠受体识别中有重要作用，这3个loop在影响 Cry毒性中起到的重要性有所不同。本研究利用能够与Cry毒素非靶标的豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)中肠氨肽酶N(amino peptidase N, APN)受体结合的短肽GBP3.1对Cry1Ab蛋白domainⅡ 内3个loop分别进行替换，通过检测loop替换后3株改造蛋白对小菜蛾(Plutella xylostella)幼虫的毒性变化来分析3个loop在Cry1Ab毒性功能中的重要性差异。生物测定结果显示，与野生型Cry1Ab的LC50=0.88 μg/mL 相比，loop 1、2和3分别被替换后的Cry1Ab的LC50为12.17、 32.25和23.00 μg/mL。由此可见，loop 2在Cry1Ab杀虫活性中起到的作用最大，loop 3次之，loop 1对Cry1Ab毒素的毒性作用影响最小。该结论与Cry1A蛋白的三维空间结构分析相吻合，并为进一步了解Bt Cry1A毒素作用机制及其三维结构中功能域的研究提供了依据。

水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus, RGDV)是呼肠孤病毒科(Reoviridae)植物呼肠孤病毒属(Phytoreovirus)的一个成员，由介体电光叶蝉(Recilia dorsalis)和黑尾叶蝉(Nephotettix cincticeps)以持久增殖型方式传播。其基因组编码6个结构蛋白和6个非结构蛋白。已知结构蛋白P8是病毒外层衣壳的主要成分，但其在病毒侵染介体细胞过程中的功能尚未弄清。本研究利用体外合成的dsRNA诱导的RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术，研究RGDV P8蛋白在病毒侵染电光叶蝉培养细胞中的功能。通过免疫荧光标记技术对dsP8处理后的电光叶蝉培养细胞进行RGDV侵染观察，发现dsP8处理不仅抑制了P8在细胞内的正常表达，同时也抑制了病毒在细胞内的积累。随后通过SDS-PAGE凝胶电泳和Western blot分别检测病毒的dsRNA基因组和病毒蛋白水平的变化，发现dsP8处理显著降低了病毒双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)基因组的合成水平和病毒P8蛋白的表达量。由此推测RGDV P8蛋白参与了病毒粒体的组装过程和病毒在介体昆虫细胞内的有效增殖和侵染过程。本研究结果为利用RNAi技术控制水稻瘤矮病的传播提供了重要的理论依据。

插入序列 (insertion sequence, IS)元件可以插入到基因或DNA序列，其可能在生物体进化中起着重要的作用。ISRso21是在青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)FJAT-1458菌株中发现的一个新的插入序列。根据序列分析可知，该插入序列是属于ISL3家族中的一个成员。本研究发现，福建闽北地区菌株ISRso21的阳性率高于其他地区的趋势，不同地区的青枯雷尔氏菌ISRso21的分布有显著性差异，ISRso21的分布可能与菌株分离个体的地理来源有关。不仅如此，由于ISRso21在青枯雷尔氏菌插入位点的不同，从而导致青枯雷尔氏菌致病性的差异。研究表明，由于ISRso21的插入导致表现型转换系统转录调控因子A(phcA)的重排可能在青枯雷尔氏菌的致病性起着极其重要的作用。在所有菌株中，ISRso21在phcA基因上游中插入的检出率达到4.71%，其中无致病力菌株和强致病力菌株中的检出率分别为28.57%和0.00%。而ISRso21在二氨基庚二酸脱羧酶基因中的插入可能是为了更好地适应环境。ISRso21在不同致病性青枯雷尔氏菌中的插入位点的研究，可能为揭示青枯雷尔氏菌致病性机制提供新的研究途径。

金线莲(Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl)是中国传统中药，具有重要的药用价值，现代医学用来治疗糖尿病和癌症。金线莲作为兰科植物，与内生菌在长期的生长过程中建立起和谐的共生关系，内生菌产生多种次生代谢产物，帮助宿主植物抗菌防虫。现有实验条件下，环境中绝大多数的微生物不能培养，而宏基因组学是认识环境中不可培养微生物的重要手段。本研究对福建金线莲根部内生菌富集进行探索，提取混合内生菌样品宏基因组DNA，并对宏基因组DNA纯化，PCR扩增微生物16S rDNA片段，克隆至大肠杆菌(Escherichia coli)并测序。根据16S rDNA信息初步对富集的内生菌群落分析，内生菌主要是不可培养细菌(uncultured bacterium)、不可培养堆肥细菌(uncultured compost bacterium)、肠杆菌科(enterobacteriaceae)、类芽胞杆菌属(Paenibacillus sp.)、芽胞杆菌属(Bacillus sp.)和短芽胞杆菌属(Brevibacillus sp.)的微生物。本研究为挖掘金线莲内生菌资源提供基础资料。

采用生物测定的方法比较Prima蛋白饵剂和自行研制蛋白饵剂的引诱效果。结果表明，两者对橘小实蝇(Bactrocera dorsalis (Hendel))引诱效果相当，但水解后的同种蛋白饵剂引诱效果高于水解前。采用柱前衍生高效液相色谱法(AccQ·Tag法)测定以上两种蛋白饵剂中氨基酸的种类和含量，结果表明，这两种蛋白饵剂中均含有游离氨基酸17种，总氨基酸18种。其中Prima蛋白饵剂总氨基酸含量为52.847 6 mg/mL，游离氨基酸含量为5.736 4 mg/mL，多肽含量为4.711 12 mg/mL；自行研制的橘小实蝇蛋白饵剂总氨基酸含量为65.624 3 mg/mL，游离氨基酸含量为6.301 0 mg/mL，多肽含量为59.323 3 mg/mL。通过比较两者氨基酸的差别，为蛋白饵剂的工业化生产质量监控提供方法依据。

营养期杀虫蛋白(vegetative insecticidal protein, Vip)是在苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)营养生长至对数中期到稳定期期间产生的一类蛋白。为获得苏云金芽胞杆菌Vip3Aa蛋白的高效表达条件，本研究利用正交试验综合考察了大肠杆菌(Escherichia coli)重组基因工程菌BL21-pCzn1-Vip诱导过程中诱导剂浓度、诱导时间和诱导温度对Vip3Aa蛋白表达量的影响。结果表明，该工程菌目的蛋白的最优诱导表达条件：诱导温度21 ℃、诱导时间8 h、诱导剂(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside, IPTG))浓度为200 μg/mL；直观分析表明，影响目的蛋白表达量的最主要因素为诱导温度，其次为诱导时间，诱导剂浓度影响最小；方差分析结果表明，诱导温度的P值＜0.01、诱导时间的P值＜0.05、诱导剂浓度的P值＞0.05，与直观分析结果相一致；利用优化后诱导表达条件进行培养，测得目的蛋白最高表达量可占总蛋白的27.6%，相当于常规诱导方法的2.3倍。本研究为大量制备高纯度Vip3Aa蛋白及其深入的理论研究和实践应用提供了基础资料。

水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus, RGDV)属呼肠孤病毒科(Reoviridae)植物呼肠孤病毒属(Phytoreovirus)，由介体电光叶蝉(Recilia dorsalis)以持久增殖型方式传播，其基因组第12条片段编码的非结构蛋白(nonstructural protein, Pns12)是提供病毒复制和子代病毒粒体装配场所——病毒原质(viroplasm)的组分之一。为了明确Pns12在RGDV侵染介体电光叶蝉培养细胞中的功能，本研究通过原核表达的Pns12蛋白免疫注射兔(Oryctolagus cuniculus)，制备Pns12抗体，并应用免疫荧光标记和RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术研究Pns12在介体培养细胞内的定位和参与病毒原质形成的过程。共聚焦显微镜观察到，病毒侵染的细胞中，与荧光素交联的Pns12抗体特异地标记在病毒原质上。干扰Pns12蛋白表达后，可有效地阻碍病毒原质的形成、子代病毒粒体的组装和病毒非结构蛋白Pns12和外壳蛋白P8蛋白的表达，表明Pns12作为病毒原质的组分参与了RGDV在介体培养细胞内的复制。也表明，Pns12可作为理想的靶标用于阻断电光叶蝉携带和传播RGDV。

营养期杀虫蛋白(vegetative insectcidal protein, Vip)是由苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)在营养生长指数中期至稳定期期间分泌产生的一类新型杀虫因子，分为Vip1、Vip2和Vip3三种，以Vip3的研究最为深入。Vip3A对鳞翅目(Lepidoptera)害虫具有广谱杀虫活性，具有重要研究意义。本研究以BtWB5菌株总DNA为模板，采用PCR方法扩增vip3Aa(GenBank登录号: AAM22456)全长，将该片段纯化回收后与pMD18-T连接并转入大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α，进行酶切验证和序列测定。将vip3Aa基因片段与经同样酶切的表达载体pCzn1连接，构建重组表达载体pCzn1-vip3Aa，转入大肠杆菌ArcticExpressTM (DE3)，异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)进行诱导表达。SDS-PAGE结果表明，在沉淀和上清中均有约88 kD VIP3Aa蛋白质表达产物；采用 Ni 亲和树脂对上清中的VIP3Aa融合表达蛋白进行了纯化，获得了纯化蛋白。本研究成功亚克隆了vip3Aa基因，并表达纯化了VIP3Aa蛋白，为后续研究VIP3Aa蛋白在昆虫中肠的作用受体提供了基础资料。

杀虫抗生素作为生物源杀虫剂，具有高效、低毒、选择性强、环保等优点，在农业害虫综合治理中占有重要地位，是无公害作物首选农药之一。本文主要从生理生化、作用机制、分子遗传研究等方面，介绍几种应用前景广阔的杀虫抗生素近年来国内外的研究进展。