随着转基因技术发展的日趋成熟和社会对转基因作物需求量的增加，转基因作物商业种植14年间有了迅猛的发展。本文从全球转基因作物大规模研究现状出发，分析了解转基因作物发展现状及趋势，对于指导当前的转基因作物研究和市场化具有重要意义。

牛体外胚胎生产是解决胚胎移植产业化胚胎来源的有效技术方法，其包括卵母细胞体成熟、体外受精和受精卵体外胚胎。而体外受精胚胎的质量是影响胚胎移植妊娠率与犊牛成活率的重要因素。体外受精过程中卵丘细胞分泌的一些重要物质(类固醇激素、细胞生长因子等)，对牛卵母细胞体外成熟、体外受精以及受精卵体外发育都具有重要的促进作用。本文综合了近年来该领域的研究进展，着重分析了卵丘细胞对卵母细胞体外成熟，以及体外受精过程中卵丘细胞的分泌功能、质量和共培养体系对卵母细胞体外受精效率的影响。

研究建立检测新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus,NDRV)的RT-PCR 方法，并运用建立的检测方法对分离毒与人工感染样品进行应用检测。根据NDRV-NP03株S3基因全序列(NDRV-NP03，GenBank登录号：GQ888710)，设计合成了一对引物, 以NDRV分离株为模板, 建立了检测NDRV的RT-PCR方法。结果显示：该方法仅能从NDRV分离毒中扩增到与预期大小相符长度为586 bp的特异性目的片段，检测灵敏度达到2 pg病毒RNA，而其它病毒，番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus, MDRV)、禽呼肠孤病毒(Avian reovirus, ARV)、鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)、番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus, MDPV)、鹅细小病毒(Goose parvovirus, GPV)、鸭副粘病毒(Duck paramyxovirus, DPMV)、鸭病毒性肝炎病毒(Duck hepatitis virus, DHV)等样品的扩增结果均为阴性。应用该方法对8株NDRV分离毒和3份人工感染鸭肝脾组织进行检测均为阳性。表明建立的RT-PCR方法特异性强、敏感度高，可用于NDRV的临床诊断和流行病学调查。

本研究旨在分离克隆水稻根特异表达的启动子，为育种提供资源。本实验结合本室芯片数据库和RT-PCR验证得到一个水稻根特异表达的基因(TIGR Locus：Loc_Os05g19570)，采用PCR技术从MH63的基因组DNA中扩增其上游启动子P12，长度为1 950 bp，将该启动子片段与报告基因gus相连，构建植物表达载体，农杆菌(Agrobaterium tumefaciens)介导转化水稻(Oryzative ssp. japonica)中花11。组织化学分析及荧光定量测定显示该启动子具有根特异性及时间差异性。根据P12启动子序列特征，利用PCR对其进行有目的的缺失，将5个长度不同的缺失片段分别与gus相连，构建植物表达载体，转化水稻中花11。荧光定量测定结果表明：－1 059~－819 bp区域缺失后，报告基因在根里的表达量显著降低，说明这个区域可能存在顺式元件。本研究成功的分离克隆到一个水稻根特异的启动子P12，进一步分析发现其还具有时间差异性。

转基因植物中外源基因拷贝数是影响其自身表达水平与遗传稳定性的重要因素。本研究旨在比较农杆菌介导法、基因枪轰击法和花粉管通道法等3种常用方法转化同一植物表达载体的转基因棉花(Gossypium hirsutum)中外源基因拷贝数的差异。本文主要采用实时定量PCR技术及相应的PfaffI分析法检测转基因棉花单株拷贝数，并与Southern 杂交做了相互验证。实时定量PCR研究结果显示，农杆菌介导法、基因枪轰击和花粉管通道注射法获得的T0代转化体中，外源基因拷贝数为1~2的单株占群体总数的百分比分别为26.2%、60%和42.8%。 外源基因拷贝数为3~5的单株比例分别为47.5%、40%和57.1%。另外，农杆菌介导获得的转基因群体中有高达27.3%的单株整合有5拷贝以上的外源基因，而基因枪轰击和花粉管通道注射法获得的转基因群体中没有发现5拷贝以上的转基因单株。研究结果表明，基因枪轰击和花粉管通道注射法均能获得较高比例低拷贝（1~3拷贝)的转化体。本研究结果对棉花转基因育种中转化方法的选择有一定的理论指导意义。

为发掘陆地棉纤维品质性状基因/数量性状基因座(quantitative trait loci, QTL)，本研究以陆地棉(Gossypium hirsutum L.)优质品种渝棉1号分别与贝尔斯诺和中棉所35杂交获得F1代，随后利用两个F1再次杂交得到复合杂交群体。利用6 565对SSR引物筛选渝棉1号、中棉所35和贝尔斯诺，获得155对多态性引物。对检测[(渝棉1号×中棉所35)×(渝棉1号×贝尔斯诺)] F1复合杂交群体标记基因型获得的158个位点进行遗传连锁分析，构建的遗传图谱包含102个位点，覆盖1 199.0 cM。利用多QTL(multiple-QTL model,MQM)作图法，检测到11个纤维品质性状QTL，包括4个纤维长度、2个长度整齐度和5个纤维比强度QTL。11个QTL分布于4条D基因组染色体。本研究表明，陆地棉不同品种同一纤维品质性状QTL等位基因存在差异；三亲本杂交群体不仅可以提高群体多态性分子标记比例，而且可以显示同一QTL在不同遗传背景的等位基因表现差异。

为研究40S核糖体蛋白S15a(ribosomal protein S15a, RPS15a)在小麦多子房性状形成过程中的功能作用，以小麦(Triticum aestivum)多子房近等基因系构建的多子房性状SSH-cDNA文库中与RPS15a基因同源的EST序列为信息探针，采用RT-PCR技术从小麦多子房株系幼穗中克隆获得了RPS15a基因的cDNA与DNA 序列，分析了该基因在近等基因系间的表达差异及其在多子房株系中不同时期幼穗和同一发育时期不同组织中的表达模式。结果表明，小麦RPS15a基因的cDNA 序列(GenBank 登录号：HM055513)长为413 bp，编码131个氨基酸；DNA 序列(GenBank 登录号：HM063421)长为642 bp，含有3个外显子和2个内含子。半定量RT-PCR分析显示，该基因在多子房株系2~4 mm幼穗中的表达量高于单子房株系幼穗；在多子房株系不同时期幼穗中的表达量随着幼穗的发育呈现上升趋势，8~9 mm时表达量达到最高；该基因广泛存在于幼根、茎顶端、幼叶和幼穗组织中，在茎顶端表达量高于其他组织。研究推测RPS15a基因的表达上调，可能与小麦多子房性状的发生有关。

植物基因组DNA 甲基化的变化是调节基因功能的重要手段，是生物体应对各种胁迫的表观遗传反应。本研究对玉米(Zea mays)高耐纹枯病材料R15和高感纹枯病材料478进行人工接种纹枯病病菌（Rhizoctonia solani Kühn），利用扫描电镜及数码拍照技术观察病菌侵染自交系R15的病理学变化，结果显示，菌丝主要通过叶鞘部位气孔进行侵染，病斑大小的变化表明病菌对寄主的侵染具有一定的梯度性；利用基因组甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术，采用24对选择性扩增引物对两个抗性不同玉米材料接菌0、6、12和24 h的DNA甲基化模式进行分析，结果显示，两个材料中半甲基化水平均呈上升趋势，且R15变化幅度较大，全甲基化水平呈现先上升后下降的趋势。本研究表明，DNA甲基化与玉米纹枯病抗性反应密切相关，在抗性反应调节系统中可能起重要的作用。

由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)引起的纹枯病是玉米产业一个突出的世界性难题,为探讨玉米纹枯病发病后的蛋白表达机制，本研究以高耐纹枯病玉米(Zea mays)自交系R15和高感自交系掖478为材料，分时段(0、12、24、36和48 h)提取接菌后叶片总蛋白，利用IEF/SDS-PAGE凝胶电泳技术，对抗、感材料的总蛋白表达差异结果进行了比较分析。结果表明：在蛋白表达谱600~800个清晰蛋白点中，部分蛋白质(多肽)的表达量在两自交系中存在着一定的差异；对其中15个差异表达蛋白进行了基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/MS)分析鉴定，并且结合数据库和生物信息学软件分析，确定了莽草酸激酶Ⅰ、铁氧-硫氧蛋白还原酶催化亚基(FTR-C)等蛋白增量表达，而磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亚基、光合系统I反应中心N亚基等蛋白减量表达，其中增量表达的蛋白能诱导抗病系统的启动，而减量表达的蛋白会抑制物质和能量代谢途径，最终导致植株感病死亡。

为获得可溶性的番茄Metacaspase蛋白，后续研究Metacaspase蛋白的酶学特性以及功能，利用RT-PCR方法克隆了番茄(Lycopersicon esculentum)中Metacaspase(LeM)全长cDNA，并成功地构建了LeM 基因的原核表达载体重组质粒pET28a-LeM，转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)PlysS和Rosetta中进行诱导表达，并对诱导表达条件进行了优化。SDS-PAGE结果显示，在37℃条件下, 1 mmol/L IPTG诱导表达量最高，在BL21(DE3)PlysS菌株中重组蛋白主要以包涵体形式存在，而相同条件下在Rosetta菌株中多为可溶性表达。同时酶活测定显示，Rosetta上清中LeM的活性为33 RFU/min,显著高于BL21(DE3)PlysS 7 RFU/min。本实验表明，不同菌株对Metacaspase的可溶性表达有很大影响。

以烟草(Nicotiana tabacum)栽培品种K326为材料，采用RT-PCR技术，克隆了萜类代谢关键酶烟草5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶(dxr)的cDNA片段。该基因编码区长1 422 bp，编码473个氨基酸残基。利用Clustal W(1.82)和Bioedit软件，对烟草与番茄(Lycopersicon esculentum)、长春花(Catharanthus roseus)、金鱼草(Antirrhinum majus)、薄荷(Mentha piperita)、玉米(Zea mays)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、念珠藻(Nostoc sp.)等物种dxr基因的同源性进行分析，其氨基酸同源性分别达到93.6%、87.9%、86.3%、84.6%、84.2%、82.9%和53.5%。原核表达结果证明，该基因编码蛋白的分子量约为50 kD，与氨基酸序列估算相符合。组织表达特异性分析表明，dxr基因在烟草组织中的表达强弱为花>叶>茎>腺毛>种子>根, 在花和叶片中的表达量占优势。该结果对烟草萜类代谢的分子调控和品质改良具有重要的参考价值。

前人研究表明，我国一些小麦地方品种籽粒休眠性强，穗发芽抗性好，可能受1~2对主效基因控制。本文利用小麦(Triticum aestivum)2个重组自交系群体(RILs，万县白麦子/京411，万县白麦子/中优9507)进行2点4年的田间试验，以期发掘控制我国小麦地方品种(万县白麦子)籽粒休眠的主效QTL位点。通过复合区间作图进行分析，分别在3AS和3BL染色体上鉴定出2个主效QTL，前者分布在Xbarc57和Xbarc294标记区间(在2个RILs群体中遗传距离分别为5.8和8.5 cM)，在多年多点的实验中可解释25.6%~48.3%的表型变异；后者分布在Vp1和Xwmc446标记区间，在万县白麦子/中优9507群体中的遗传距离为8.1 cM，可解释23.5%~37.8%的表型变异。上述研究表明，我国小麦地方品种万县白麦子籽粒强休眠特性主要受Qsd.ahau-3A、Qsd.ahau-3B这两个主效基因控制，在不同环境中表现出较好的遗传稳定性。可通过聚合育种的方法获得籽粒休眠性强、穗发芽抗性好的小麦新品种。

对鸡脂肪性状候选基因进行连锁不平衡(linkage disequilibrium, LD)分析可以为理解鸡体脂沉积的遗传学机制提供重要信息，并且可以提高脂肪性状相关分子遗传标记的检出效率。本研究以东北农业大学肉鸡高、低脂双向选择品系第8世代肉仔鸡为实验材料，通过直接测序、高效液相色谱(DHPLC)、单链构象多态性(PCR-SSCP)、限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、长度多态性(PCR-LP)等方法对过氧化物酶增殖体激活受体(PPAR-γ)、载脂蛋白B(ApoB)、解耦联蛋白(UCP)以及其他10个鸡脂肪性状重要候选基因进行多态性检测，计算候选基因标记间LD参数|D'|与r2，分析这些候选基因标记间的LD模式并探讨其规律。初步发现了以下特征：1、在各候选基因内，标记间的|D'|与r2值并不匹配，取值区间差异很大，|D'|值普遍大于r2；另外，在有些基因内的相同标记间，|D'|、r2值相差很大，甚至在|D'|=1时，r2接近于0。2、在不同基因甚至在同一基因内不同区域LD水平差异很大且物理距离与LD关系并不成线性关系。3、在有些基因内，如ApoB基因，相间位点间的|D'|和r2值大于相邻位点间的值。4、有些基因，如PPAR-γ，相同标记间LD水平在高、低脂系间存在很大差异。本研究结果提示，在群体遗传学研究中进行候选基因LD分析时，LD参数r2的应用价值比|D'|更大。

实验以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞为模型，研究不同时间高温(42 ℃)热处理对细胞热休克蛋白HSP、细胞凋亡、乳脂肪和乳蛋白合成相关基因mRNA表达丰度的影响。结果发现，热休克转录子hsf-1和热休克蛋白基因hsp27、hsp70和hsp90在高温处理0.5 h后mRNA表达上调，其中hsp70转录水平有急剧上调过程，且随热处理时间延长均表现出先上升后下降的趋势；标志细胞凋亡的Bax基因从处理的0.5 h开始mRNA表达下调，随后升高；但细胞凋亡Bcl-2 mRNA表达上调；在检测的热处理过程中，αS1-酪蛋白(CSN1S1)基因转录先上调后下降，而β-酪蛋白(CSN2)和嗜乳脂蛋白(BTN)基因转录均下调；与脂肪酸合成和调控相关的基因乙酰辅酶A羧化酶(ACACA)、过氧化物酶激活受体-γ(PPARG)和固醇调节元件转录因子-1(SREBF-1)基因表达显著上调，而过氧化物酶激活受体-α(PPARA)基因mRNA转录没有明显变化。本实验结果证明热应激诱导了奶牛乳腺上皮细胞的应激反应，对细胞的乳蛋白和乳脂肪合成功能产生了显著影响，细胞产生热耐受。

本研究主要探讨经基因修饰和筛选后转基因供体细胞的挑选及处理对牛转人溶菌酶基因克隆胚胎早期发育的影响。用含人溶菌酶基因(human lysozyme，hLYZ)乳腺特异表达载体pEBH重组质粒转染高产荷斯坦牛成纤维细胞，经G418筛选后的转基因阳性细胞作为核供体细胞成功构建了转hLYZ基因克隆胚胎。结果发现，基因转染及筛选过程对转基因重构胚的发育有不利的影响，囊胚发育率显著降低；以注核针内径为参照，挑选直径为15~20 μm的转基因阳性细胞作为供体细胞，重构胚的融合率和囊胚率较其它组差异显著(分别为80.4%和33.8%，P<0.05)；生长旺盛期的细胞构建的转基因克隆胚的卵裂率及囊胚发育率显著高于经血清饥饿和生长接触抑制处理组(P<0.05)；所有的转基因克隆胚在体外发育的各个发育时期都能观察到绿色荧光蛋白的表达，但表达的强弱在不同个体及相同个体不同发育时期之间存在差异。随机挑选10枚囊胚以PCR 法进行鉴定，结果全部为阳性转基因胚胎。研究结果表明，利用体细胞核移植方法可以获得转hLYZ基因的克隆胚胎，重构胚可成功的发育到囊胚阶段；挑选生长旺盛期的直径为15~20 μm的转基因阳性细胞作为供体细胞可显著提高转基因克隆胚的融合率和囊胚率。

肌肉卫星细胞是组织特异性干细胞，负责着骨骼肌的生长和再生。尽管发现卫星细胞的存在已经有50多年的历史了，但分离鉴定肌肉卫星细胞的方法仍然不稳定。本研究使用两步酶消化和差速贴壁相结合的方法分离大鼠（Rattus norvegicus）肌肉卫星细胞。免疫细胞化学染色显示，分离的大鼠肌肉卫星细胞高表达Desmin；通过RT-PCR鉴定所分离的细胞表达肌源性干细胞因子Myf5及Myod1；成肌诱导48 h后，卫星细胞开始形成多核的肌管；成脂诱导1周后，细胞内开始出现脂滴，2周后充脂细胞明显增多。研究结果提示，分离的卫星细胞具有肌源性，有发育形成肌管和向成脂细胞分化的能力。

为了研究生长激素基因(GH)对清远麻鸡部分生长及繁殖性状的遗传效应，基于聚合酶链反应-连接酶检测反应(PCR-LDR)基因多态性并行检测系统，对清远麻鸡(Gallus gallus)生长激素 (GH)基因内含子1的G662A位点和内含子4的T3094C，C3199T位点进行检测，并分析其对部分生长及繁殖性状的遗传效应。检测结果显示，清远麻鸡在3个位点上均产生了3种基因型，LDR分型结果同直接测序结果一致。G662A位点对生长及繁殖性状均不存在显着的效应；T3094C位点上，TT型个体的开产日龄显着晚于CC和CT型个体，其18周龄体重又显著高于CC和CT型个体；C3199T位点上，不同基因型个体仅在50周平均蛋重上存在显着差异，TT型个体的50周平均蛋重显着高于CC和CT型个体。3个位点的合并基因型对开产蛋重、50周平均蛋重以及生长性状均有显着的影响，且对生长性能的遗传效应更加明显，合并基因型AACTCC可以作为筛选清远麻鸡高的体重的分子标记。

本研究通过RT-PCR的方法检测了妊娠第8天小鼠(Mus musculus)外胎盘锥(ectoplacental cone，EPC)中Wnts及其相关分子mRNA的表达，并用免疫荧光化学的方法检测了经典Wnt通路关键分子β-catenin及此通路抑制因子Dkk1在体外培养的EPC中的蛋白表达，通过EPC体外扩展实验初步研究了经典Wnt信号通路在滋养层侵入中的作用。结果显示, Wnt家族中的11个成员、Frizzled受体家族的10个成员、Wnt家族的抑制剂sFRP家族的5个成员、Dkk基因家族和受体kremen的mRNA在小鼠EPC中都有不同程度的表达。β-catenin在从体外培养的EPC迁移出的滋养层细胞核中有强烈表达，而Dkk1不表达，用经典Wnt信号通路抑制因子Dkk1处理EPC后，滋养层细胞扩展直径增加，这表明经典的Wnt信号通路可能抑制滋养层侵入。本研究为揭示Wnt信号通路在胎盘建成的滋养层侵入过程的作用和机制提供理论基础。

瘦素受体(LEPR)是瘦素(leptin)发挥作用的重要中介物。LEPR基因突变与人的肥胖，以及普通牛、猪等动物的脂肪沉积相关。本研究根据GenBank中普通牛(Bos tauras)LEPR基因序列设计3对引物，采用PCR-SSCP方法检测天祝白牦牛、甘南牦牛和青海牦牛(Bos grunniens)LEPR基因第4、5及8外显子及其相邻区域多态性。结果表明，牦牛LEPR基因第4外显子和第8外显子及其相邻区域分别存在多态性。对应普通牛LEPR基因序列，3类群牦牛该基因第4外显子及相邻区域检测到5处单碱基突变并形成2种等位基因A和B，第4外显子存在2处错义突变；该区域A为优势等位基因，PIC<0.25为低度多态。3类群牦牛LEPR基因第8外显子及其相邻区域发现5处SNPs，其中第8外显子存在3处错义突变；等位基因在牦牛群体间分布不均衡，除天祝白牦牛发现6种等位基因A-F外，其余两类群牦牛仅发现3种等位基因A-C；3类群牦牛中A均为优势等位基因，该位点PIC>0.25，为中、高度多态且显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态(P<0.05)。3类群牦牛LEPR基因第5外显子及相邻区域未发现多态性，但相对于普通牛该基因序列，在第4、5内含子区存在3处SNPs。LEPR基因第8外显子编码识别和结合相应配体的C2区，牦牛LEPR基因存在较丰富的多态性，可作为其调控性状的潜在分子标记位点。

骨形态发生蛋白受体IB基因(BMPR-IB) FecB突变是影响布鲁拉美利奴和小尾寒羊高繁殖力的主效基因。本研究采集产双羔及以上的多浪羊(Ovis aries)母羊135只及后代羔羊血样共353份，公羊血样211份，利用PCR-RFLP技术检测FecB突变，并分析不同基因型个体母羊的产羔数。结果表明：在多浪羊群体中检测到BB、B+和++基因型，基因型频率分别为0.005，0.146和0.849。B+型多浪羊产羔数均值比++型多0.51只(P<0.01)，BB型多浪羊产羔数分别与B+和++型差异不显著。多浪羊群体在FecB位点上处于Hard-Weinberg平衡状态，表明在该位点上没有受到选择的影响。本研究首次在新疆多浪羊群体中发现了FecB突变BB基因型公、母羊个体(1只公羊和2只母羊)，揭示多浪羊多羔产生的机理可能与布鲁拉美利奴和小尾寒羊相同，在生产过程中可以根据携带FecB突变的情况开展选种选配，组建多浪羊肉用高繁品系。

脂联素(Adp)是主要由脂肪组织分泌的细胞因子，其作用受到普遍关注。选择10 d皖南花猪半腱肌分离骨骼肌卫星细胞，用不同浓度(0、1、5和10 μg∕mL)的重组脂联素(rAdp)分别处理12和24 h，采用荧光定量PCR检测骨骼肌细胞中脂联素(Adp)、脂联素受体1(AdpR1)、脂联素受体2(AdpR2)和肌球蛋白重链(MyHC)，4种亚型MyHC1、MyHC2a、MyHC2b、MyHC2x，以及AMP激活蛋白激酶(AMPK)、过氧化物增殖剂活化受体α(PPARa)的基因表达。结果显示：(1) 1 μg/mL rAdp处理后，Adp和AdpR1基因表达量极显著增加，AdpR2的表达量在处理24 h极显著增加。而5和10 μg/ml组Adp、AdpR1和AdpR2的表达量低于对照组；(2) 1 μg/mL rAdp处理显著上调MyHC1和MyHC2x的基因表达量，而MyHC2b的表达量则在处理24 h极显著下降。5和10 μg/mL rAdp处理显著下调MyHC2b的基因表达量，而对MyHC1无显著影响。10 μg/mL 处理后MyHC2a的表达量极显著下降，5 μg/mL 处理后MyHC2x的表达量极显著增加；(3) 1、5和10 μg/mL rAdp处理12 h后，AMPK基因表达量极显著高于对照组，但是低剂量组具有较高的基因表达量。1 μg/mL rAdp处理12和24 h，PPARa基因表达量极显著高于对照组，然而高剂量组没有这种效应。结果提示，Adp作用于骨骼肌，可能是与受体结合后通过AMPK和PPARa两个信号途径，提高MyHC1、MyH2x和降低MyH2b基因表达量，改变肌纤维组成。

为了对新分离到的大口黑鲈溃疡综合征病毒(Largemouth bass ulcerative syndrome virus, LBUSV)的特征作进一步了解，促进LBUSV、DFV(Doctor fish virus)和LMBV(Largemouth bass virus)这类病毒的深入研究，本文克隆了LBUSV DNA 甲基转移酶(DNA MTase)基因约200 bp的保守核心片段，用基因组步移的方法扩增到了核心片段的侧翼序列，获得了DNA MTase基因的编码区全长序列。序列分析表明，DNA MTase基因开放阅读框共663 bp (GenBank登录号：GU256634)，编码220个氨基酸。结构域分析显示，LBUSV DNA MTase蛋白具有4个保守的DNA MTase结构域Ⅰ、Ⅳ、Ⅵ和Ⅷ，以及辅酶结合位点、底物结合位点和DNA结合位点等DNA MTase活性位点，其中的脯氨酸-脯氨酸-半胱氨酸三肽是潜在的催化位点。另外，本文还根据DNA MTase基因开放阅读框设计引物，PCR扩增和酶切后插入到pBV220载体中，经转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α，温度诱导和SDS-PAGE检测，重组菌在分子量25 kD处有一条特异蛋白带，重组蛋白约占菌体总蛋白的30%。研究结果推测，该基因编码的蛋白具有DNA甲基化的功能，该病毒的分类地位为虹彩病毒科蛙病毒属。

为了分析金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)自然感染引起的隐性乳房炎奶牛血浆蛋白的表达变化，经细菌培养分离鉴定了乳中金黄色葡萄球菌，选择其感染的奶牛。采用二维凝胶电泳技术分离了临床健康奶牛和乳房炎奶牛的血浆蛋白，考马斯亮蓝G-250染色后PDQuest 8.0软件检测差异表达蛋白点，高效液相色谱串联离子阱质谱鉴定。结果发现，金黄色葡萄球菌乳房炎奶牛血浆中有10个蛋白点的表达量发生改变，其中6个蛋白点经质谱鉴定为结合珠蛋白、转甲状腺素蛋白和α1酸性糖蛋白等4种蛋白。金黄色葡萄球菌感染可造成奶牛血浆结合珠蛋白、α1酸性糖蛋白和血清淀粉样蛋白A的表达量增加。ELISA法测定血浆结合珠蛋白的结果也发现，金黄色葡萄球菌感染奶牛血浆结合珠蛋白水平显著高于健康牛(P<0.01)。结果提示乳房炎奶牛血浆蛋白的变化可为揭示金黄色葡萄球菌感染乳腺炎症的应答提供依据。

为制备烟草丛顶病毒(TBTV)ORF3和ORF4多克隆抗体，采用RT-PCR方法克隆了TBTV保山龙陵分离物(TBTV-BSLLi)的ORF3和ORF4，亚克隆至pMD18-T载体中，经测序正确后，将该基因插入原核表达载体pET28a(+)中，通过热击转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(plysS)，以IPTG诱导6×His融合蛋白的表达，并经Ni2+亲和柱层析纯化，成功地克隆了TBTV的ORF3和ORF4，建立了其原核表达和表达产物的纯化体系,获得了高纯度的ORF3、ORF4蛋白。用纯化的蛋白免疫大白兔，获得高效价的特异性抗血清。DAS-ELISA检测结果表明，制备的抗血清可用于田间烟草(Nicotiana tabacum L.)样品及传播介体的检测。本研究为用血清学方法检测该病毒提供了基础条件。

为研究嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)降解羽毛的机理，本研究克隆了嗜麦芽窄食单胞菌角蛋白酶基因(KerF)，并获得其全长基因序列1 981 bp，含有1个1 743 bp的开放阅读框，编码580个氨基酸(GeneBank登陆号HM590650)，将角蛋白酶KerF基因连入表达载体pET28a(+)中，构建重组表达质粒pET28-KerF并转化大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)，获得重组工程菌。采用金属Ni+螯和层析柱对所表达的角蛋白酶进行纯化，获得分子量为50 kD的重组角蛋白酶KerF。该酶的最适温度为50℃，最适pH值为9.0。金属离子Mn2+、Co2+、 Mg2+、 Ni+、 Ba2+、Zn2+、 Ca2+ 、Fe3+及蛋白酶抑制剂二苯基甲基磺酰氟(PFSM)能强烈抑制该酶活性，乙二胺四乙酸(EDTA)对该酶活具有促进作用。本研究结果表明，嗜麦芽窄单胞菌角蛋白酶基因在大肠杆菌中获得成功表达，重组角蛋白酶KerF为碱性丝氨酸蛋白酶。

为研究猪促甲状腺激素β基因(TSH-β)的多态分布情况及与生长肉质性状的关联性，本研究对TSH-β基因全序列进行再测序，发现3个单核苷酸突变座位：位于5'非转录区多态座位A-175G、位于编码区非同义突变座位G+52A，以及位于内含子的突变座位G+570A。采用PCR-RFLP和四引物ARMS-PCR方法对皮特兰、长白、杜洛克、约克夏、金华猪、岔路黑猪和嘉兴黑猪七个纯种猪群以及金皮资源家系F2代群体共计548头个体进行多态分型，并在F2代群体中分析了TSH-β多态座位与生长和肉质性状的关联性。结果表明，猪TSH-β基因具有较高的遗传多样性(Shannon多样性指数总体均值为0.48)，且存在相当程度的品种间遗传分化(Fst=0.5389)。其中，座位A-175G在4个国外品种和岔路黑猪中的优势等位基因为A，而在金华猪和嘉兴黑猪中的优势等位基因为G，关联分析显示AA型个体在胴体长、日增重、后腿重和后腿肌肉重方面显著高于GG型个体(P<0.05)；座位G+52A的多态性主要存在于金华猪中，而在其他猪种中表现为低杂合度或完全纯合于等位基因G，且与肌内脂肪含量有显著关联；座位G+570A的多态性仅存在于我国的嘉兴黑猪和金华猪中，其他猪种表现为完全纯合于等位基因G，关联分析结果表明GG型个体在胴体长和后腿肌肉重方面显著高于AA型个体。研究结果提示，TSH-β基因可考虑为猪4号染色体相关QTL的功能候选基因。

本研究从自建的家蚕(Bombyx mori)蛹期cDNA文库中筛选到一条cDNA序列，发现其在序列和结构上与其他物种的真核细胞翻译起始因子4E基因(BmeIF4E)具有较高的相似性，推测可能是家蚕eIF4E基因，将该序列命名为BmeIF4E，GenBank登录号为DN443192。为研究BmeIF4E的生物学功能，将该基因插入原核表达载体pET-28a(+)中，构建重组质粒pET-28a(+)-BmeIF4E，转化感受态细胞BL21(DE3)，IPTG诱导表达并纯化该重组蛋白，制备多克隆抗体。利用家蚕Bm5细胞进行亚细胞定位研究结果表明，BmeIF4E既存在于细胞质中也存在于细胞核中。荧光定量PCR和Western blot分析结果表明，在不同组织及发育时期该基因的表达有差异，在各组织中BmeIF4E表达量从高到底依次是马氏管、表皮、脂肪体、气管、卵巢、中肠、头和丝腺；在卵、幼虫、蛹和蛾4个发育时期中，蛾中的表达量最高，其次是蛹，再次是五龄幼虫，而在卵中表达量较低。以该基因的ORF为模板体外转录dsRNA，脂质体法转染Bm5细胞，72 h后提取细胞总蛋白作Western blot检测RNA干扰情况，发现BmeIF4E基因被干扰后，总蛋白中目的蛋白含量明显低于阴性对照组。MTT法检测结果表明，干扰后细胞活力也明显下降。研究结果提示，BmeIF4E作为一种重要的管家基因，在家蚕的整个生命周期中均有表达，起着十分重要的作用。

ΔFosB作为FosB的一种截短型，具有广泛的生物学功能，在脂、钙沉积和药物成瘾等方面有重要作用。本研究采用RNA干扰技术，通过制备重组干扰腺病毒对山羊(Caprar hircus)ΔFosB基因进行沉默，进一步研究山羊ΔFosB基因在脂、钙沉积方面的相关功能及作用机制。实验采用BLOCK-iT shRNA腺病毒干扰系统，将预先设计好的寡聚shRNA-492/572经退火复性后克隆入穿梭质粒pENTR/CMV-GFP/U6中。经干扰效率检测后，选择pENTR/CMV-GFP/U6-572与病毒骨架质粒pAD/PL-DEST进行同源重组，获得重组干扰腺病毒载体pAD/PL-DEST/CMV-GFP/U6-572，并转染HEK-293细胞，经包装、扩增后即可产生干扰腺病毒AD-ΔFosB-572，TCID50法测定其滴度为1.58×109 PFU/mL。用AD-ΔFosB-572感染山羊的乳腺上皮细胞(MOI=200)，经Western blot及实时定量PCR检测证明在病毒感染24、48和72 h后，山羊乳腺上皮细胞中ΔFosBmRNA表达量分别下调了45%，73%和81%，其蛋白表达水平也明显下调，干扰效果明显，可用于后续的基因功能研究。