为了充分利用现有的遗传信息和基因资源，揭示玉米磷营养高效的分子机制，本研究以磷高效玉米自交系082和磷低效玉米自交系掖107为亲本组配的F2世代为作图群体，采用SSR和AFLP分子标记构建了遗传连锁图，以两个时期，两个磷水平和两个地点共4种环境下的241个F2∶3家系各性状的平均值作为表型值，采用复合区间作图法定位了磷效率相关的3种根系分泌物的QTL。四种环境下检测表明，(1) 检测到4个影响酸性磷酸酶活性的QTL，其中有两个QTL AP1-KXNP和AP9-KXNP被重复检测到，分别分布在第1和9二条染色体上，所在标记区间分别为bnlg1268a-umc1290a和P1M3/d- P1M3/g，在染色体上的位点分别为bin1.09和bin9.04，单个QTL解释酸性磷酸酶变异的9%~16%，2个QTL共解释酸性磷酸酶变异的25%；(2) 检测到5个影响有机酸含量的QTL，其中只有1个在两种环境下被重复检测到，位于第9染色体上，标记区间为P1M3/f-P1M7/g，在染色体上的位点为bin9.03；(3) 检测到5个影响H+含量的QTL，但没有一个被重复检测到。结果表明，影响酸性磷酸酶活性的两个QTL AP1-KXNP和AP9-KXNP在染色体上较稳定，可作为磷高效分子标记辅助选择的标记。

大豆孢囊线虫(Heterodera glycines，Soybean cyst nematode，SCN)是严重危害世界大豆生产的害虫，大豆对孢囊线虫的抗性由多个基因控制，发掘和利用抗病基因对于SCN抗病品种的有效选育至关重要。本研究以大豆(Glycine max)感病品种中黄13和抗病品系中品03-5373为研究材料，对包含线虫抗病基因相关结构域Hs1pro-1_N和Hs1pro-1_C的候选基因GmHs1pro-1的表达特征进行实时荧光定量PCR分析，以期明确该基因与SCN抗性之间的关系。研究发现接种SCN 4号生理小种(SCN 4)后1 d该基因的相对表达量出现明显的上调，比对照样品高13.4倍，其后的各时间点其表达量仍然保持持续上调的趋势，在接种6 d后其上调趋势有所减弱。方差分析表明，接种与未接种相对表达量之间的差异均达到显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)水平，说明SCN 4侵染条件下，GmHs1pro1基因被诱导表达，该基因对SCN 4具有一定的抗性作用。

为研究外源豌豆铁蛋白基因(Pea-Fer)导入水稻后对受体重要生物学特性的影响，本实验以原始受体亲本粳稻(Oryza sativa ssp.japanica)品种秀水11为轮回亲本，外源豌豆(Pisum sativum)铁蛋白转基因纯系Fer34为非轮回亲本，采取连续回交，结合gus标记基因辅助选择技术，在BC6F3获得含Pea-Fer的Fer34-XS11，它与秀水11构成一对近等基因系。结果显示，(1)Pea-Fer导入显著提高了水稻籽粒中的铁元素含量，但对镁、钙、锰和锌等元素的积累作用影响不大；(2)Pea-Fer导入对种子发芽特性和苗期植株生长速率无显著影响；(3)Pea-Fer导入没有改变成株叶片光合色素的含量和组成，但一定程度上提高了植株的净光合速率；(4)Pea-Fer导入对水稻的成熟期农艺性状及经济性状均无不良影响。外源豌豆铁蛋白基因的导入除使水稻籽粒的铁含量有明显增加外，研究结果表明对水稻其它重要生物学性状并无明显负作用，这为开展富铁水稻新品种培育提供了依据。

为揭示中国野生华东葡萄抗病转录因子基因在与葡萄白粉病互作过程中的作用机制，本研究以中国野生华东葡萄(Vitis pseudoreticulata W.T. Wang)高抗葡萄白粉病株系白河35-1为材料，接种葡萄白粉病菌(Unicinula necator (Schw.) Burr.)病原菌诱导后7个不同时期的反转录产物为模板，用RT-PCR扩增得到V. pseudoreticulata RING-finger protein1基因(VpRFP1)的开放阅读框1 053 bp；将其克隆到pMD19-T载体经测序后，亚克隆到pGEX-4T-1原核表达载体并转化大肠杆菌(Escherichia.coli) BL21；经IPTG诱导表达出64 kD的融合蛋白GST-VpRFP1，主要以包涵体表达形式存在；采用电透析法纯化融合蛋白，并以纯化产物免疫新西兰大白兔获得抗血清，Western blot检测免疫-抗原反应良好。本研究结果表明，在27℃、0.1 mmol/L的IPTG诱导4 h融合蛋白GST-VpRFP1的表达量最大，免疫大白兔获得的抗血清能够用于VpRFP1基因的功能分析。

为了研究牛天然免疫力相关巨噬细胞蛋白1(Nramp1)的功能，探求转基因抗胞内感染菌牛新材料创制的功能基因，本实验应用RT-PCR方法从秦川牛(Bos taurus)外周血中扩增出Nramp1编码基因N端序列，并将其克隆到pMD18-T simple载体，酶切后连接于pGEX-4T-1表达载体，命名为pGEX-N2。将重组质粒pGEX-N2转化大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)，经IPTG诱导，SDS-PAGE电泳检测GST-Nramp 1-N融合蛋白表达，并筛选最佳诱导条件，用谷胱甘肽Sepharose 4B介质分离纯化该融合蛋白。结果表明，牛Nramp1 N端编码序列长186 bp, 与GenBank中的相应的牛基因序列(U12862.1)对比存在一个碱基差异，致使其编码的第49位氨基酸为丙氨酸。构建的牛Nramp1 N端表达重组质粒pGEX-N2，于35℃、0.1 mmol/L IPTG、诱导10 h，在大肠杆菌中高效表达，表达产物的分子量为33 kD。结果为进一步研究牛Nramp1在机体抵抗胞内菌感染中的作用并为利用该基因进行转基因抗病牛的培育提供了实验依据和实验材料。

为了研究解耦联蛋白基因(uncoupling protein，UCP)对鸡(Gallus gallus)初生重及活性氧含量的影响，本实验通过对3个品种鸡初生重、UCP C353T多态位点基因型以及肌肉组织活性氧(ROS)含量的测定，发现丝羽乌鸡ROS值显著低于白莱航、寿光鸡，UCP TT基因型ROS值显著高于CT和CC基因型， 而ROS含量与雏鸡初生重之间存在着正向的相关性(r=0.5011)，UCP TT基因型的初生重显著高于CT和CC基因型。实验结果揭示了鸡UCP基因型对初生重性状具有选择效应。

为了分析辣椒NADPH基因与辣椒疫病抗性之间的关系，明确其在辣椒抗疫病方面的作用，以辣椒NADPH基因为目的基因，利用载体pBI121构建了植物表达载体pBI121-NADPH，采用农杆菌介导法转化辣椒(Capsicum annuum L.)感病品种B12，获得了5个卡那霉素抗性转化株系。对卡那霉素抗性转化植株进行PCR和RT-PCR分子检测发现，这5个转化株系含有目的基因CanNADPH。应用辣椒疫病抗性离体叶片鉴定技术，鉴定转基因植株对疫霉菌(Phytophthora capsici)的抗病性，结果表明，转基因辣椒的发病率较非转基因植株降低了22.2%，其病情指数降低了46.5%，表明辣椒NADPH基因在辣椒抗疫病方面有重要作用。

抗凝血酶(antithrombin, AT)主要抑制凝血酶(thrombin)及其它凝血因子的活性，并具有重要的抗炎活性。本实验从香鱼(Plecoglossus altivelis)肝组织cDNA文库中成功获得了香鱼AT基因的cDNA全序列(EMBL登录号：FN429980)。测序结果表明，香鱼AT基因cDNA全长1 487个核苷酸，包含1个大的开放阅读框(ORF)，推测编码1个由453个氨基酸组成的蛋白，N端23个氨基酸为信号肽序列。成熟AT具有与哺乳动物AT相似的特征结构，包括：羧基末端附近的丝氨酸蛋白酶活性中心、6个保守的Cys残基形成的3个二硫键结构和4个N-糖基化位点。氨基酸序列分析表明，香鱼AT与大西洋鲑(Salmo salar)AT氨基酸序列同源性最高，为81%。系统进化树分析表明，物种AT的进化关系与目前接受的物种分类关系基本一致，香鱼AT位于鱼类AT簇中，与大西洋鲑、红鳍东方豚(Takifugu rubripes)和斑马鱼(Danio rerio)AT进化相关性最高。AT mRNA在健康香鱼的肝组织中表达量最大，在脾、肾和脑中表达量较低。实时荧光定量PCR结果表明，在鳗利斯顿氏菌(Listonella anguillarum)侵染4 和8 h的香鱼肝组织中AT mRNA表达量显著下调(P<0.05)，但随着病程发展，12~36 h，AT mRNA表达水平显著上调(P<0.05)，揭示AT是一个病程相关蛋白，并参与香鱼细菌感染导致的急性期反应。

为了获得具有生物活性的拟南芥(Arabidopsis thaliana) alpha-dioxygenase 2( AtDOX2)，将其对应基因AtDOX2编码区克隆到酵母表达载体pPIC9k中，获得重组表达载体pPIC9k-AtDOX2，将线性化的重组载体电击转化入毕赤酵母(Pichia pastoris)表达菌株GS115，经G418筛选、PCR鉴定和甲醇诱导时间优化，获得重组AtDOX2的高效表达菌株GS115/pPIC9k-AtDOX2。SDS-PAGE分析结果显示，0.5%甲醇诱导96 h重组蛋白表达量最高，其表达量占胞外总蛋白的15%。重组AtDOX2的表观分子量约为70 kD，经Ni-NTA柱亲和层析可获得纯度大于80%的重组蛋白。2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS)法测定结果表明重组蛋白具有过氧化物酶活性，且其活性受Ca2+和Mg2+激活，受EDTA、咪唑和Mn2+抑制；2,4-二硝基苯肼(2,4-DNP)法测定结果显示，重组AtDOX2具有双加氧酶活性，Ca2+对其双加氧酶活性也有激活作用。结果说明利用酵母表达系统获得了具有活性的重组AtDOX2，AtDOX2同时具有过氧化物酶活性和双加氧酶活性。

研究亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)对Cry1Ab产生抗性的分子机理，对今后制定和实施合理的抗性治理策略具有重要的意义。本研究通过PCR方法克隆和测序，鉴定了Cry1Ab敏感-抗性亚洲玉米螟幼虫中肠氨肽酶N(APN)基因家族的一个成员Ofapn3，其cDNA全序列长3 591 bp，开放阅读框包括3 045 bp，编码1 014个氨基酸。预测蛋白质分子量为115.1 kD，等电点(pI)为4.44。其推导的氨基酸序列中具有鳞翅目昆虫氨肽酶典型结构特征，即N-末端具有18个氨基酸的剪切信号肽，谷氨酸锌化氨肽酶保守结构GAMEN，锌结合位点HEXXHX18E，C-末端具有22个氨基酸的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚信号肽。系统分类归为第3支系。与欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)的Onapn3(GenBank登录号：ABL01483)同源性为96.6%。与Cry1Ab敏感亚洲玉米螟cDNA相比，抗性品系的开放阅读框中有40个碱基发生了点突变，导致氨基酸序列中有10个氨基酸改变。其中Ser735在抗性品系中突变为Pro的现象在抗性棉铃虫APN3的氨基酸突变中也被检测到。鉴定的Cry1Ab敏感和抗性亚洲玉米螟品系的Ofapn3 cDNA序列，已提交GenBank，登录号分别是EF538427和EU137839。

植物Na+/H+逆向转运蛋白具有稳定细胞质内Na+浓度和调节pH值的功能，对植物的耐盐性具有重要的作用。利用RT-PCR和RACE技术分离出毛竹(Phyllostachys pubescens) Na+/H+逆向转运蛋白编码基因PpNHX1的cDNA序列，全长2 290 bp(GenBank登录号为GU295174)。该基因的编码蛋白PpNHX1包含545个氨基酸残基，进行BLASTp比对，发现其与芦苇(Phragmites communis) PcNHX1、水稻(Oryza sativa) OsNHX1的序列同源性分别为89%和88%。系统发育分析表明，PpNHX1蛋白与禾本科植物液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白的亲缘关系较近，与质膜型Na+/H+逆向转运蛋白亲缘关系较远。以半定量RT-PCR检测PpNHX1基因的表达情况，发现PpNHX1受到200 mmol/L NaCl胁迫的诱导，在4 h 内的表达量随NaCl处理时间延长持续增强，其中根部的表达增强幅度明显高于茎和叶；但4 h后，PpNHX1在根与叶中的表达量均有所下降。推断PpNHX1基因在盐胁迫下的表达调控与毛竹耐盐能力密切相关。

为了阐明支持细胞增殖和分化能力对精子生成的影响，本实验以7、21和35 d仔猪为材料，利用细胞直接计数、免疫组织化学、流式细胞术和免疫印迹分析了仔猪睾丸支持细胞、生精细胞数量和增殖能力变化以及支持细胞的成熟分化状况。结果：(1)从7~21 d，曲细精管中支持细胞与其它细胞之间的界线更加明显；从7~35 d，每克睾丸中间质细胞和支持细胞的数量在21 d时达到高峰(P<0.05)，而生精细胞的数量则一直增加(P<0.05)，但并没有在曲细精管中发现圆形精子；(2) 从7~35 d，支持细胞和间质细胞都能表达GATA-4, 支持细胞中GATA-4的累积光密度(IOD)在 21 d时最高(P<0.05), 而间质细胞中的IOD 在21 d 和 35 d 之间没有明显差异(P>0.05)； (3) 从7~35 d，整个睾丸细胞都有增殖能力, 睾丸细胞的细胞增殖指数(PI)和S期细胞指数(SPF)在 21 d时最高(P<0.05)；三种细胞在这一时期都能表达PCNA, 三种细胞PCNA的IOD值和睾丸中PCNA的表达水平在21 d 时最高(P<0.05)； (4) 从7~35 d，Connexin 43(Cx43) 主要表达于支持细胞的细胞质,支持细胞和间质细胞中的 IODs 在21 d时最高(P<0.05)。结果表明，尽管在出生后1个月左右仔猪睾丸支持细胞有较强的增殖能力，但由于这一时期的支持细胞没有分化成熟，因此，不能支持生精细胞的进一步发育。

为研究miR-196a-1在脂肪形成中的作用，从3T3-L1细胞基因组中扩增miR-196a-1前体序列，构建miR-196a-1的表达载体，获得稳定表达miR-196a-1的3T3-L1细胞株，成脂诱导后检测脂肪细胞分化关键转录因子的mRNA表达和脂滴累积情况。结果表明，miR-196a-1在3T3-L1细胞分化过程中表达上调，在诱导分化的第2天达到高峰，并在之后的分化过程中恢复到正常水平；稳定表达miR-196a-1的3T3-L1细胞株中miR-196a-1的持续高水平表达导致脂肪形成关键基因过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARγ)、CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)和脂蛋白脂酶(LPL)的mRNA水平及脂滴累积明显增加。这些结果指明，miR-196a-1促进3T3-L1脂肪细胞分化，利用所构建的稳定表达miR-196a-1的细胞株可进一步研究miR-196a-1调节脂肪形成的分子机制。

为探明家蚕肠道中产蛋白酶细菌的种类分布及其作用效果，本研究以家蚕(Bombyx mori) 4龄幼虫肠道内容物为材料，采用牛肉膏蛋白胨培养基和酪蛋白培养基分离筛选产蛋白酶细菌菌株，利用16SrDNA序列分析鉴定其种属，并研究其产酶能力和产酶活力较高菌株的最适发酵条件。结果获得3株产蛋白酶菌株皓月NA1、951 NA3和951 NA6，均归属于不动杆菌属(Acinetobacter)，其中皓月NA1号细菌产酶能力最强，最佳产酶量为29.5 U/mL。以玉米粉10 000 mg/L、黄豆粉10 000 mg/L、MgSO4 400 mg/L、NaC1 15 000 mg/L和K2HPO4 1 000 mg/L作为发酵培养基成分，在35℃、起始pH 9.0、装液量为80 mL/ 150 mL、180 r/ min振荡培养48 h的优化发酵条件下，皓月NA1号细菌最大产酶量可达50 U/m L。研究结果对家蚕肠道微生物的分布及肠道益生菌的作用效果调控有着十分重要的意义。

本研究建立了猪肌内前体脂肪细胞的体外培养模型，以期为更深入研究猪肌内脂肪代谢提供新的实验方法。实验采集出生5 d仔猪的背最长肌组织，Ⅱ型胶原酶消化2 h后400目筛网过滤，然后1 500 r/min离心，沉淀用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基(完全培养基)重悬后差速贴壁2 h，弃去原有培养基，加入新的含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基(完全培养基)进行培养。细胞经传代且完全融合48 h后，在完全培养基中添加0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)，1 μmol/L 地塞米松(DEX)，10 mg/L 胰岛素(INS)进行诱导培养48 h，再换以含10 mg/L 胰岛素的完全培养基培养48 h，最后换完全培养基继续培养，直至90%的细胞出现脂滴。培养结果：细胞贴壁生长，呈短梭状或棱形，经诱导培养后细胞充脂率高。经形态学观察、生长曲线及油红O脂肪染色法鉴定，证明是肌内前体脂肪细胞。普通PCR及实时荧光定量PCR均检测到了脂联素基因的表达。本研究通过差速贴壁法成功培养了猪肌内前体脂肪细胞，并通过诱导培养重现了其分化、成熟的全过程。

N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)是动物机体内存在的一种天然氨基酸衍生物，参与下丘脑-垂体生长轴的调控分泌作用。本实验选用SD大鼠(Rattus norvegicus)下丘脑，采用神经细胞体外培养模型来研究NMDA对下丘脑合成和分泌生长抑素(SS)的影响。结果表明，适量浓度的NMDA可显著促进下丘脑神经细胞SS的分泌及其 mRNA 的表达，明显提高细胞内的Ca2+ 水平，并使cAMP浓度降低，表明SS基因表达和分泌的增加可能主要是通过Ca2+ 和环腺苷酸(cAMP)共同介导实现的。

以间接免疫组化法(IHA)检测口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)整联蛋白αvβ6在健康绵羊(Ovis aries)不同组织器官中的表达分布。研究结果表明，在舌、鼻、唇、软腭、咽、喉头、气管、肺脏和蹄冠状带组织上皮细胞的细胞膜及细胞质内均出现了棕黄色的特异阳性反应物。结果表明，整联蛋白受体αvβ6受体广泛存在于健康绵羊体内的组织器官中，在呼吸系统以及蹄冠状带等多种FMDV易感组织器官的上皮细胞中表达量较高，且主要在细胞膜和细胞质中表达。

本研究利用毛竹已有的EST序列，开发竹类植物EST-SSR标记，旨在对竹子的分子分类进行研究。通过对3 087条毛竹(Phyllostachys pubescens)EST序列进行筛选，获得了408条含有SSR的毛竹EST，在所有的EST-SSR中，三核苷酸重复类型(49.75%)最多，其次是二核苷酸重复类型(43.14%)、五核苷酸重复类型(4.41%)、四核苷酸重复类型(1.72%)和六核苷酸重复类型(0.98%)。不同基序类型中，GAG/CTC基序和AG基序分别是三核苷酸重复类型和二核苷酸重复类型中含量最高的重复基序，分别占18.72%和71.02%。当SSR长度等于18 bp时，所检测到的SSR数量最多，达140条。随着SSR长度的增加，所检测到的SSR数量呈下降的趋势。根据搜索出的EST序列，共设计出25对引物，对12个竹类植物进行了扩增效率、多态性及通用性检测。其中18对引物能够扩增出稳定且清晰的条带，16对引物扩增具有多态性，扩增片段长度主要集中在100~500 bp，引物有效率达64%。依据扩增结果进行遗传相似性分析，12种竹类植物可分为两大类群：丛生竹类群(clump bamboos)和散生竹类群(monpodial bamboos)，且该分类结果与竹子形态学分类结果基本一致，说明从毛竹中开发EST-SSR标记是一条简便、可行的途径，可用于竹子种内或种间的SSR标记分析，从而研究竹类种质资源遗传多样性。

根据GenBank发表的鸡MSTN基因序列针对外显子1设计2对引物，采用PCR-SSCP技术检测边鸡(Gallus gallus)及3个对照群体（京海黄鸡(Gallus gallus)、尤溪麻鸡(Gallus gallus)和AA鸡(Gallus gallus)）的单核苷酸多态性，并与边鸡的生长性状进行相关性分析。结果表明：MYOE1-1扩增片段不存在多态性。MYOE1-2扩增片段存在多态性，在边鸡、京海黄鸡和尤溪麻鸡中都检测到6种基因型（AA、AB、BB、BC、AC和CC），而在AA鸡中只检测到4种基因型（AB、BC、AC和CC）。克隆测序表明，总共检测到3个多态位点（G2100A、G2109A、C2244G），这3个突变均未导致氨基酸的改变。最小二乘分析表明，在6-8和12周龄时，BB基因型个体的体重显著高于AA基因型个体（P<0.05）。在14周龄时，BB基因型个体的体重显著高于AA和AC基因型个体（P<0.05）。在16-18周龄时，BB基因型个体的体重显著的高于其余5种基因型的个体（P<0.05）。研究结果初步表明：MSTN基因可能是影响边鸡生长性状的一个主效基因或是与之存在紧密遗传连锁的一个标记。

过多的脂肪沉积影响肉的品质。(110±10) g雌性(♀)SD大鼠(Rattus norvegicus) 150只，随机分成5组，分别在基础日粮中添加0、75、500、1 000和6 000 mg/kg含脂肪细胞膜卵黄抗体的阳性卵黄粉。75 d屠宰，采集血样、肠系膜脂、子宫周脂、肾脂肪囊和下丘脑。放射免疫法测定血清Insulin和Leptin浓度。用RT-PCR方法, 以18S rRNA作内标分析不同部位脂肪组织中Leptin、Bcl-2和Bax mRNA和下丘脑Ob基因b型受体(Ob-Rb) mRNA表达，并测定各部位脂肪组织DNA和RNA含量。结果显示，卵黄抗体处理可降低大鼠腹腔内总脂重和腹腔内总脂指数，其中75和6 000 mg/kg阳性卵黄粉组效果明显，但对体重、摄食量和腓肠肌重无显著影响。6 000 mg/kg阳性卵黄粉组可降低血清甘油三酯，升高血清游离脂肪酸；降低子宫周脂和肾脂肪囊DNA含量和总量。75 mg/kg阳性卵黄粉组可降低子宫周脂和肾脂肪囊DNA总量；两剂量组均可降低血清胰岛素、子宫周脂和肾脂肪囊Leptin mRNA表达，上调下丘脑Ob-Rb mRNA表达；降低子宫周脂Bcl-2 mRNA和Bax mRNA表达，但对Bcl-2/Bax无显著影响。不同部位比较发现，Leptin mRNA表达量为肾脂肪囊＞子宫周脂＞肠系膜脂(P<0.01)；Bcl-2和Bax mRNA表达量为子宫周脂和肾脂肪囊显著高于肠系膜脂(P<0.05)。结果提示：口服脂肪细胞膜卵黄抗体降低体脂沉积的作用途径可能是：1) 直接溶解脂肪细胞，抑制脂肪细胞增殖；2) 通过脂肪代谢的改变，间接减少脂肪沉积。

缺乏供体细胞制约着胰岛替代疗法在 Ⅰ型糖尿病治疗过程中的应用。本研究对实验室分离保存的胎猪胰腺干细胞(fetal porcine pancreatic stem cells, FPPSCs)，体外诱导分化为胰岛素分泌细胞以及移植治疗裸鼠糖尿病的能力进行了深入研究，以探讨该细胞株作为异种供体细胞的潜力。研究结果表明，该细胞体外增殖活力旺盛，其形态及表面抗原表达特征与间充质干细胞极其相似，除表达胰腺干细胞相关标志外，FPPSCs 还表达一些胚胎干细胞的相关标志。采用无血清诱导方案诱导 2 周后，FPPSCs 形成 DTZ 染色阳性的胰岛样细胞团(islet-like cell cluster, ICC)，该细胞团表达胰岛素、Glut-2 等胰岛素分泌细胞功能相关的蛋白。RT-PCR结果显示，诱导后，胰腺干细胞相关标志表达减弱，而成熟胰岛素分泌细胞相关标志表达增强。葡萄糖刺激实验结果显示，诱导后，FPPSCs 合成、分泌胰岛素和 C-肽的能力显著增强(P<0.05)。将诱导 2 周后的细胞移植到糖尿病裸鼠腹腔内，可缓解其高血糖状况。结果提示，FPPSCs 具有间充质干细胞的特性，体外能够诱导分化为胰岛素分泌细胞，并具有改善糖尿病裸鼠高血糖症状的能力，有望为进一步研究异种胰腺干细胞移植治疗糖尿病提供种子细胞。

青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)是植物细菌性青枯病的病原菌，为研制植物疫苗菌剂提供遗传稳定且突变位点明确的青枯雷尔氏菌无致病力菌株，本研究利用EZ-Tn5转座子随机插入青枯雷尔氏菌(Rs91)构建青枯雷尔氏菌无致病力突变体库，通过电击转化，筛选获得13株具有无致病力菌株形态的突变株。研究了其中5株突变株的插入位点和生物学特性，结果表明，其插入位点分别位于phcA和pchS基因，其生长速率和相对胞外多糖含量显著低于Rs91，而最适pH值和温度未改变。其发酵液经分光光度计扫描，结果显示，突变株在同一波长下的光吸收值均大于Rs91，经聚类分析，显示它们与Rs91可聚为不同的3类，即Rs91为第Ⅰ类，phcA基因突变株为第Ⅱ类，phcS基因突变株为第Ⅲ类。经番茄(Lycopersicon esculentum)盆栽苗致病力检测，15 d后均未发病，确定为无致病力青枯雷尔氏菌。本研究为研制防治青枯病的植物疫苗菌剂提供了基础资料。

过敏性反应和致病性(hrp)基因存在于革兰氏阴性植物病原细菌中，决定病原细菌对寄主植物致病性和诱导非寄主及抗病植物过敏性反应(hypersensitive response, HR)。本研究从果斑菌(Acidovorax avenae subsp. citrulli)的hrp基因簇中克隆了hpaA、hrcT、hrcC和hrpG基因，通过同源重组的方法，分别构建了其突变体。电镜观察发现，hpaA和hrpG基因突变体的鞭毛缺失且细胞形态发生显著变化，而hrcT和hrcC基因突变体的鞭毛和细胞形态未发生明显变化。在烟草(Nicotiana tabacam)和哈密瓜(Hami cantaloupe)叶片上的测定结果显示，hpaA、hrcT和hrcC的突变体均失去在烟草上的HR激发能力和在哈密瓜叶片上的致病性；hrpG在烟草上的HR激发能力和在哈密瓜上的致病性则显著减弱；进一步的生长曲线测定结果表明，hpaA、hrcT、hrcC和hrpG的突变体的定殖能力均显著下降。相应地，功能互补后突变体基本恢复至野生表型。证明瓜类细菌性果斑病菌hrp基因作为Ⅲ型分泌系统关键组份影响病原细菌对寄主植物的致病性和对非寄主及抗病植物的过敏性反应。

DNA 环介导恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术是一种特异、灵敏、快速的新型基因检测技术，其检测结果可以通过琼脂糖凝胶电泳观察，也可以通过加入核酸染料SYBR GreenⅠ进行肉眼观察。本研究根据对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV)的结构蛋白VP26基因序列，设计一套引物，成功建立了针对WSSV的LAMP检测方法。应用该方法，在65℃温育1 h的条件下快速扩增病毒基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳得到特异性梯度条带；在反应体系中添加SYBR GreenⅠ染料后，可通过肉眼观察有无荧光直接判定结果。该研究建立的LAMP法能特异性检出WSSV，其检测下限比PCR法低一个数量级，相当于0.563 pg/μL的质粒(pMD19-T-VP26)浓度。表明所建立的WSSV LAMP检测法特异性好、灵敏度高、操作简单方便，有望作为WSSV快速诊断的常规方法。

利用反转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)，建立了一种特异、灵敏、便捷的H9亚型禽流感病毒(H9 subtype of avian influenza virus，H9-AIV)的检测方法。该方法使用了对应于H9亚型禽流感病毒血凝素(hemagglutinin HA)基因的8个不同区域的6条特异引物，在63℃的等温条件下反应，最低可检测到103拷贝的目的基因重组质粒片段，较RT-PCR方法敏感10倍。通过对15种H亚型禽流感病毒、新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)、传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)的检测表明，该方法具有良好的特异性。在反应体系中使用钙黄绿素与Mn2+的混合溶液作为荧光指示剂可以用于RT-LAMP结果判定，并且其判断结果与浊度判断结果一致。对109份禽咽喉拭子及泄殖腔拭子临床样品进行检测，RT-LAMP与RT-PCR检出阳性样本数分别为61份和46份，表明RT-LAMP方法阳性检出率高于RT-PCR。

柑橘溃疡病(citrus bacterial canker disease，CBCD)是危害柑橘(Citrus reticulata Blanco)的重要病害，为了给柑橘溃疡病的现场快速诊断提供一种稳定的重组抗体，构建一种快速检测技术，本研究以鼠源抗柑橘溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis pv. citri, Xac)表面脂多糖的二硫键稳定性抗体dsFv为模板进行基因改造，利用重叠延伸PCR在其重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)之间引入一条人类抗体重链恒定区1(CH1)5'端12个氨基酸的序列作为连接肽，构建重组单链二硫键稳定抗体基因sc-dsFv。将获得的基因连接pET24a(+)载体，转入大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)得到工程菌，IPTG诱导表达。表达产物经体外复性并以Ni-NTA亲和层析对目标蛋白sc-dsFv进行纯化，利用斑点免疫杂交、ELISA和BIAcore检测抗体的活性、稳定性、特异性及亲和力。构建的抗体基因经测序结果表明，抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因之间成功引入目标连接肽序列，重组sc-dsFv蛋白实现了原核高效表达；通过体外复性和Ni-NTA柱纯化获得纯度高于90%的sc-dsFv蛋白。特异性和亲和性测定结果表明，该重组抗体具有特异的抗原结合活性和良好的抗原亲和力，与本实验室保存的抗柑橘溃疡病菌表面脂多糖scFv及dsFv比较，产量有明显提高且稳定性也有所提高。这种具有特异抗原结合活性的稳定抗体sc-dsFv的获得为柑橘溃疡病的快速免疫诊断提供了高效优质重组抗体，并为病害治疗性抗体制备提供了有效的方法。

异源蛋白在大肠杆菌不能正确折叠表达成包涵体，分子伴侣能在细胞内帮助异源蛋白折叠，改善蛋白的聚集。本研究以大肠杆菌 (Escherichia coli) DH5α菌株DNA为模板，利用PCR技术扩增出6个分子伴侣编码基因groEL、groES、dnaK、dnaJ、grpE和clpB，分别将groEL、groES和grpE(Ⅰ组)插入pCDFDuet-1载体，将dnaK、dnaJ和clpB(Ⅱ组)基因插入pRSFDuet-1，构建辅助载体pR-GESP和pC-DJKL，每个重组载体中含有一个人工操纵子，每个基因上游含有T7启动子。SDS-PAGE结果显示，诱导后的重组大肠杆菌上清除了DnaJ外其它5个蛋白明显表达。SDS-PAGE分析了共表达分子伴侣对玉米(Zea mays)四吡咯分子合成的谷氨酸-1-半醛氨基转移酶、尿卟啉原Ⅲ脱羧酶和西罗叶绿三酸：铁螯合酶在大肠杆菌的折叠和聚集影响，结果显示，GroEL、GroES 和GrpE能防止玉米西罗叶绿三酸：铁螯合酶在大肠杆菌的聚集，但DnaK、DnaJ和ClpB分子伴侣对该酶则没有作用；GroEL、 GroES和GrpE能部分抑制玉米谷氨酸-1-半醛氨基转移酶在大肠杆菌的聚集，但是对改变玉米尿卟啉原Ⅲ脱羧酶的聚集没有明显作用，这些结果表明，不同分子伴侣组对改善本研究选择的3个玉米蛋白在大肠杆菌可溶性表达的效果有差异。

土壤生态系统是农业生态系统安全和农业可持续发展的重要载体，也是人类赖以生存的基础。随着基因工程技术的应用和转基因作物大量种植，在带来重大经济效益的同时，也可能会引发一定的生态风险，包括会对农田土壤生态系统尤其是微生物群落结构和功能产生难以预测的复杂影响。目前这些研究方向已成为土壤生物安全的研究热点。本文简要分析了近年来转基因作物对土壤微生物群落的影响，着重介绍了转基因作物种植影响根际土壤微生物群落多样性的研究进展、土壤微生物群落多样性的研究方法及其评估研究的主要策略等。