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农业生物技术学报  2017年 25卷 3期  刊出日期:2017-01-19
 
研究评述与展望
基于非酶杂交链式反应的生物传感器研究进展
Research Progress in the Hybridization Chain Reaction Based Biosensor
邵向丽 朱龙佼 周忻 许文涛
2017, 25(3): 502-510  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (907 KB)  ( 541 )
摘要
杂交链式反应(hybridization chain reaction, HCR)是一种新型的信号放大手段,是一种无需酶参与的、在常温下就可以进行的自组装反应。HCR不仅在比色分析法、荧光分析法和电化学分析法等常见的领域中有较广泛的应用,而且在化学发光分析法、电致化学发光分析法、光致化学发光分析法以及拉曼光谱分析法等新领域中也有应用,可以高灵敏甚至超灵敏的检测分析核酸、蛋白、细胞和小分子等生物分子。本文对近4年来基于HCR的、比较有代表性的简单、快速、高灵敏的生物传感器在多种生物分子检测领域中的应用进行了综述,并对今后的发展趋势进行展望。
环状RNA的分子特征、作用机制及生物学功能
Molecular Feature, Action Mechanism and Biology Function of Circular RNA
周凤燕 杨青 朱熙春 蓝贤勇 陈宏
2017, 25(3): 485-501  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (8490 KB)  ( 337 )
摘要
环状RNA(circular RNA, circRNA)是一类经反向剪接后、由3'末端和5'末端共价结合形成的环状非编码RNA(non-coding RNA, ncRNA)分子,广泛存在于多种生物细胞中,具有结构稳定、序列保守及细胞或组织特异性表达等特征。目前研究表明,circRNA 可通过多种途径发挥作用。其可作为天然微小RNA(microRNA, miRNA)海绵参与其表达调控;也可通过与蛋白互作调节基因的转录、细胞周期或衰老等生理过程。此外,circRNA还与人类健康杀手如癌症和心脏病等多种疾病的调控过程密切相关,其在神经发育、免疫等过程中也扮演一定角色,具有重要的研究价值。本文主要对circRNA的形成机制与分子特征、作用机制、相关研究方法及其在疾病等生理病理过程中的研究现状进行了综述,同时讨论了circRNA研究中尚未解决的问题及其未来的应用前景。总而言之,circRNA的存在及功能拓展了真核生物转录组的复杂性和多样性,本文认为,对circRNA 的深入探究会丰富后基因组时代的研究内容,同时为更好的了解与治疗人类疾病提供理论依据与技术指导。
研究论文与报告
THRSPα多态性与京海黄鸡屠体和腹脂性状的相关性及其表达规律的研究
Expression Profile of THRSPα Gene and Its Association Analysis with Carcass and Abdominal Fat Traits in Jinghai Yellow Chicken (Gallus gallus)
薛倩 张跟喜 李婷婷 张向前 凌姣姣 王金玉 王永娟
2017, 25(3): 442-450  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (1949 KB)  ( 322 )
摘要
甲状腺激素应答蛋白Spot 14(thyriod hormone responsive spot 14, THRSP)是一个参与调控脂肪生成酶活性进而影响动物组织中脂类代谢的转录调控因子,THRSP基因包括α和β两种亚型。为了探究THRSPα基因与京海黄鸡(Gallus gallus)屠体和腹脂性状相关性,并分析其组织表达特性和表达规律,本研究运用聚合酶链式反应-单链构象多态性(polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism, PCR-SSCP)结合测序技术研究该基因的多态性,并通过qRT-PCR技术研究该基因在10种组织中的表达情况以及0~16周龄的表达规律。结果表明,THRSPα基因外显子2序列中存在C129T和T160G两处突变,且在京海黄鸡群体中形成3种单倍型和5种单倍型组合。不同单倍型组合间屠体重和腹脂重差异显著和极显著(P<0.05和P<0.01),其中单倍型组合为H1H3的个体,其屠体重和腹脂重均显著和极显著高于单倍型组合为H1H1和H2H2的个体(P<0.05和P<0.01),单倍型组合H2H2腹脂重极显著低于其他各单倍型组合(P<0.01)。THRSPα基因的组织表达谱分析显示,THRSPα基因在肝脏和腹脂中的表达量显著和极显著高于其他组织(P<0.05和P<0.01);THRSPα基因的表达规律研究结果发现,THRSPα基因在肝脏中的表达规律呈先升高后下降趋势,8周龄时表达水平最高,THRSPα基因在腹脂中表达水平相对稳定。本研究进一步证明了THRSPα基因为鸡屠体和腹脂性状的候选基因,为进一步研究THRSPα基因对鸡肝脏脂肪合成和腹脂沉积的调控机理提供了参考。
尼罗罗非鱼补体C9基因单核苷酸多态性及其与抗无乳链球菌感染的关联分析
SNPs of C9 Gene and Their Association with Resistance to the Infection of Streptococcus agalactiae in Oreochromis niloticus
曹建萌 胡欣欣 卢迈新 陈琼 刘志刚 陈昆平
2017, 25(3): 354-265  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (6793 KB)  ( 375 )
摘要
为获得与尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus) 链球菌病抗性相关的单核苷酸多态性(single nucleotide polymophisms, SNPs)标记,本研究克隆了尼罗罗非鱼补体C9基因(OnC9)的基因组DNA序列,通过直接测序法从20个家系的39条尼罗罗非鱼OnC9的测序序列中分析得到22个SNPs位点,其中S1(C483T)、S3(G954A)、S4(T1180C)、S5(G1539A)、S6(G1627T)、S7(A2590T)、S10(T2876G)、S11(C2915G)、S12(T2939G)、S13(A2942C)、S14(A3544C)、S15(T3604C)、S16(T3670C)、S17(T3841C)、S18(T4339C)、S19(G4494C)、S20(A4678G)、S21(T5790A)、S22(T5816G)等19个SNPs位点在内含子中,S2(C644T)、S8(C2660T)和S9(A2751T)等 3个SNPs位点位于外显子中,其中S2、S9属于非同义突变,S8为同义突变。此外,本研究获得的OnC9 SNPs位点中有一半为碱基转换产生,另一半为碱基颠换产生。通过snapshot分型法对易感群体(susceptible group, SG)(84尾)和抗病群体(resistance group, RG)(81尾)进行了分型,并利用Popgen32软件统计分析了尼罗罗非鱼OnC9各个SNPs位点在两个群体的多态性和遗传参数,结果显示多态信息含量(polymorphism information content, PIC)值为0.09~0.37,表明所有SNPs位点均为中度或低度多态。采用SPSS 20软件分析了22个SNPs位点在两个群体中的基因型频率、等位基因频率,并采用卡方检验其显著性,分析其与抗病性状之间的相关性,发现S8和S21两个位点与抗病性状显著相关。通过Haploview 4.2软件分析了OnC9中的22个SNPs位点所形成的单倍块和连锁不平衡状态。结果表明, 22个位点可构成4个单倍块和11个单倍型。其中GTTAG和ATGA两个单倍型与尼罗罗非鱼链球菌病易感性显著相关(P<0.05)。本研究显示,筛选到的尼罗罗非鱼OnC9的两个SNPs位点和两个单倍型具有用于尼罗罗非鱼抗链球菌(Streptococcus agalactiae)病性状的分子辅助育种的潜力。
薏苡幼苗叶片转录组分析
Analysis Transcriptome of Coix (Coix lachryma-jobi) Leaf at Seedling Stage
黄玉兰 殷奎德 向君亮
2017, 25(3): 386-396  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (1567 KB)  ( 428 )
摘要
薏苡(Coix lachryma-jobi)是一种药食兼用的作物,其营养和药用价值都很高,而关于薏苡方面研究多集中在生理生化方面,转录组方面研究较少。为了获得和挖掘薏苡的基因数据和功能,本研究利用Illumina公司Paired-End转录组测序技术进行从头组装和注释分析。总计获得了92 865条unigenes,通过BLAST与NR等蛋白质数据库进行比对,其中35 813条unigenes在数据库中有注释,占薏苡总unigenes数目的39.87%。基因本体(Gene Ontology, GO)数据库注释显示,其中1 053条unigenes可能由参与干旱胁迫的基因转录,其中编码植物激素和渗透因子合成酶的unigenes分别为409和125条。同时,在数据库中还注释了许多与薏苡活性成分相关的基因(脂类化合物,类固醇和儿茶酚胺)。京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)代谢通路分析表明分析表明,6 560条unigenes涉及170条代谢或信息通路,其中,264条unigenes涉及植物信号转导途径。在这些转导途径中,AMPK(AMP-activated protein kinase)、MAPK(mitogen-activated protein kinase)、Ca2+信号转导途径都与干旱相关。此外,检测到了7 534个简单重复序列,其中最丰富的是单碱基重复3 068,其次是三碱基3 017和双碱基1 288。该转录组测序分析为薏苡抗旱基因挖掘和转录组方面研究提供了一定的理论参考。
磷酸苯酯羧化酶同源基因在部分Thauera aromatica及Azoarcus evansii菌株中的多样性
Diversity of Phenylphosphate Carboxylase Genes in Some Thauera aromatica and Azoarcus evansii Strains
丁秦超 蒋福升 钱朝东 蒋莉娜 丁滨
2017, 25(3): 470-476  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (1289 KB)  ( 273 )
摘要
苯酚是重要的化工原料,也是危害环境的重要酚类污染物之一。在反硝化细菌Thauera aromatica K172中,苯酚经过磷酸化和羧化可转化成毒性较低的4-羟基苯甲酸。磷酸苯酯羧化酶是这一过程的关键酶,由4个亚基α、δ、β和γ构成。本研究以编码δ和γ亚基的开放阅读框架(open reading frame, ORF)orf 5和orf 12为模板构建了DNA探针,通过Southern blot 的方法,对部分T. aromatica及Azoarcus evansii菌株中相关基因的多样性进行了分析,发现这些菌株普遍含有多个orf 5同源序列,而杂交图谱显示该基因不具备属的特异性。相比之下,orf 12仅分布在T. aromatica K172和S100以及A. evansii T中,相关的基因簇为单一拷贝,且均位于一个Pst I消化的大小一致的片段中;在培养实验中也只有这3个菌株能够稳定地在反硝化条件下以苯酚为唯一碳源生长。因此推测,T. aromatica K172,S100和A. evansii T中降解代谢苯酚的途径是相同的,可能是在进化过程中获得了相同的苯酚代谢的基因或基因簇。本研究进一步证明了orf 12编码的γ蛋白是磷酸苯酯羧化酶的亚基之一,为深入探讨苯酚的无氧代谢提供了实验基础。
基于QTL的猪支原体肺炎候选基因的筛选与生物学注释
Selection and Biology Annotations for Mycoplasmal Pneumonia of Swine Candidate Genes Based on QTL
张程玥 张哲 张向喆 王起山 潘玉春
2017, 25(3): 434-441  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (858 KB)  ( 422 )
摘要
猪支原体肺炎(mycoplasmal pneumonia of swine, MPS)是养猪(Sus scrofa)生产实践中一种常见的慢性呼吸道传染病。该病由于易感染且难治愈,继发感染后容易致死,一直给国内外养猪业造成较大的经济损失。目前,病理诊断、疫苗与抗生素药物研发等方面的研究往往难以达到根除疾病的目的,亟待对猪支原体肺炎相关遗传基础进行鉴定,从分子水平上解释其遗传机制,进而利用遗传规律进行抗病育种。因此,本研究通过基因本体(Gene Ontology, GO)富集分析、KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析和文本挖掘等生物信息学的手段对猪QTL数据库进行检索,从中筛选并注释候选基因。结果表明,(1) 47个相关QTL中所含的3 379个基因与猪支原体肺炎存在相关性,显著性筛选后余36个基因;(2) GO富集分析中与MPS产生关联的基因53个;(3) KEGG通路分析Asthma通路含基因16个;(4)文本挖掘的候选基因TNFα (tumor necrosis factor)、NRAMP1 (natural resistance-associated macrophage protein 1)、TCRs (T-cell receptor genes)、CYP1A1 (cytochrome P450 family 1 subfamily A member 1)、CYP3A29 (cytochrome P450 3A29v4)、SERPING1 (serpin family G member 1)共6个。不计重复后最终得到104个优化的候选基因。其中,TNF、POU5F1 (POU domain, class 5, transcription factor 1)为重要的候选基因,在猪支原体肺炎感染过程中可能起关键作用。本研究从分子水平对猪支原体肺炎的遗传机制进行了初探,MPS候选基因集的建立将为后续研究及疾病相关基因的鉴定工作提供参考。
转CP4-EPSPS基因耐草甘膦除草剂大豆中作J9331喂养鹌鹑90 d亚慢性毒理学研究
A 90 d Subchronic Feeding Study of CP4-EPSPS Transgenic Glyphosate Herbicide-resistant Soybean (Glycine max) ZZ-J9331 in Quails (Coturnix japonica)
刘燕 章嫡妮 于赐刚 王长永 卞慧敏
2017, 25(3): 451-460  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (4124 KB)  ( 274 )
摘要
随着转基因耐草甘膦除草剂大豆(Glycine max)的迅速推广及扩大种植,其环境安全性也越来越成为人们关注的焦点。本研究选取与环境密切相关的鸟类-朝鲜鹌鹑(Coturnix japonica)作为实验动物,随机分成5个处理组,用含有28%和70%的耐草甘膦转基因大豆(中作J9331)和非转基因对照大豆(中黄30)以及常规基础日粮饲喂鹌鹑90 d,观察其对鹌鹑健康状况和生理指标的影响,实验期间,记录各组动物体重和摄食量,实验末期,收集血液解剖动物进行病理观察,计算脏器系数。结果显示,转基因大豆喂养动物90 d后,各组动物生长发育良好,转基因大豆与非转基因大豆对照组相比,鹌鹑的血常规、血生化和脏器系数等个别指标有统计学差异(P<0.05),但并无生物学意义。病理检查中,各实验组与基础日粮对照组相比,其他脏器未观察到有明显的病理改变,但在肝脏切片中观察到肝细胞脂肪变性及弥漫性纤维结缔组织增生,经评分证实该现象同时出现在实验组和基础日粮对照组,因此认为是肝脏自发性病变,与鹌鹑是否摄取转基因大豆无关。研究表明,转基因耐草甘膦除草剂大豆中作J9331与非转基因大豆对鹌鹑具有同等的食用安全性,为转基因大豆的商业化应用和安全管理提供了科学数据资料。
田菁茎瘤固氮根瘤菌ORS571类T3SS效应蛋白的预测、原核表达及相关功能分析
Prediction, Prokaryotic Expression and Related Functions Analysis of Azorhizobium caulinodans ORS571 T3SS Effector Proteins in Sesbania cannabina
张俊彪 谢秒秒 张磊 刘华伟
2017, 25(3): 461-469  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (1615 KB)  ( 290 )
摘要
根瘤菌Ⅲ型分泌系统(typeⅢsecretion system, T3SS)效应蛋白在固氮结瘤及决定根瘤菌的宿主范围等方面具有重要作用。为了对田菁(Sesbania cannabina)茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans) ORS571的类T3SS效应蛋白进行预测、表达和相关功能分析,本研究利用生物信息学软件BPBAac和Effective T3对ORS571的全蛋白组进行分析,并结合相关文献报道获得了7个效应蛋白,分别是AZC_0308、AZC_0649、AZC_0667、AZC_2699、AZC_2928、AZC_3165和AZC_4087;设计并合成具有相应酶切位点的特异性扩增引物,利用PCR获得了以上7个效应蛋白的全基因序列;以pMAL-c4x作为原核表达载体,成功构建了7种重组表达载体,通过优化诱导表达条件获得了可溶性高的融合蛋白;随后利用Amylose Resin亲和层析对表达的融合蛋白进行纯化,获得了较高纯度的融合蛋白;以辣根过氧化物酶标记抗麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein, MBP)单克隆抗体作为一抗进行Western blot检测,结果表明,7种效应蛋白高效正确表达。构建AZC_2928基因缺失的ORS571突变体并侵染小麦(Triticum aestivum)小偃22,结果表明,AZC_2928基因对小麦的生长具有抑制作用。研究结果为今后从茎瘤固氮根瘤菌ORS571类T3SS效应蛋白方面研究根瘤菌与非豆科植物的共生固氮提供实验基础。
版纳微型猪近交系PRPS2基因克隆、表达及生物信息学分析
Cloning, Expression and Bioinformatics Analysis of PRPS2 Gene of Banna Mini-pig (Sus scrofa) Inbred Line
曾日彬 张霞 霍金龙 王配 王淑燕 王雪飞 陈园园 曾养志
2017, 25(3): 425-433  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (12547 KB)  ( 113 )
摘要
酸核糖焦磷酸合成酶Ⅱ(phosphoribosylpyrophosphate synthetases 2, PRPS2),是生物体合成的关键酶,在控制肿瘤发生、促进细胞凋亡、抑制细胞增殖以及促进精子生成方面具有重要作用。为研究磷酸核糖焦磷酸合成酶Ⅱ基因(PRPS2)在猪(Sus scrofa)雄性不育方面的作用及基因编码的蛋白质功能,从GenBank下载猪及近缘物种的PRPS2 mRNA序列作为参考序列,设计特异引物扩增版纳微型猪近交系(Banna mini-pig inbred line, BMI)PRPS2基因,应用qRT-PCR分析15个重要组织的mRNA表达谱,并对蛋白质序列进行功能生物信息学分析。研究获得了BMI PRPS2 1 282 bp的cDNA序列(GenBank登录号: KU705637, 对应的氨基酸登录号: AOC89055),编码318个氨基酸。组织表达谱显示,PRPS2基因在精囊腺中呈现高表达水平,在其他14个组织中呈现中低表达水平。生物信息学分析表明,PRPS2蛋白分子量(Mw)为34.83 kD,等电点(pI)为6.15,存在2个保守结构域,无跨膜结构,无信号肽序列,N末端和C末端疏水,有4类功能活性位点,位于细胞质的概率是89%; PRPS2基因在进化中高度保守。该研究结果将为进一步研究PRPS2基因在猪雄性不育方面的作用及功能提供参考。
猪PACAP基因真核表达载体的构建及其在3T3-L1前体脂肪细胞上的表达
Construction of Eukaryotic Expression Vector for Pig (Sus scrofa) PACAP Gene and Its Expression in 3T3-L1 Cell Line
高甜甜 毛海光 沈一飞 徐宁迎
2017, 25(3): 415-424  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (5567 KB)  ( 191 )
摘要
垂体腺苷酸环化酶激活肽(pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide, PACAP)是由下丘脑合成并分泌,存在于人(Homo sapiens)和动物体内的生物活性物质,能够刺激垂体生长激素(growth hormone, GH)的合成与分泌,从而促进动物体的生长发育。本研究首先克隆了猪(Sus scrofa) PACAP基因(pPACAP)的全长cDNA,利用油红O染色技术和qRT-PCR技术研究PACAP基因在3T3-L1前体脂肪细胞成脂分化过程中的表达规律;继而构建了真核表达载体pEGFP-pPACAP,将其转染至小鼠(Mus musculus)3T3-L1前体脂肪细胞,48 h内采用CCK-8法检测细胞生长情况并于48 h后检测3T3-L1前体脂肪细胞中的pPACAP、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FAS)和乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase, ACC) mRNA 的表达及pacap-EGFP融合蛋白的表达。成脂分化结果表明,PACAP mRNA随着脂肪细胞的成熟,其表达量逐渐上升,在第4天时,表达量最高;双酶切及测序结果表明,成功构建了pPACAP基因的真核表达载体pEGFP-pPACAP;真核表达载体转入培养的3T3-L1前体脂肪细胞中后,在荧光显微镜下,重组质粒组和空载体组均发出绿色荧光,48 h时转染效率最高,且PACAP、FAS和ACC mRNA相对表达量均有极显著的提高(P<0.01), 成功检测到pacap融合蛋白。本研究结果表明,PACAP参与到脂肪形成的机制中。该结果为体外研究猪PACAP基因对脂肪合成代谢及其机体代谢的调节机制提供了理论依据。
中国荷斯坦牛TLR1基因启动子区SNP多态与乳房炎抗性和泌乳性状的关联分析
Correlation Between the Mutation of SNPs in the Promoter Region of TLR1 and Mastitis Resistance and Milking Traits in Chinese Holstein (Bos taurus)
王梦琦 倪伟 张慧敏 杨章平 王西朴 蒋彦森 毛永江
2017, 25(3): 397-404  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (1133 KB)  ( 316 )
摘要
Toll样受体1 (Toll like receptor 1, TLR1) 基因是牛(Bos taurus)重要的免疫基因之一,在免疫识别、炎症反应等方面有重要作用。为探讨TLR1启动子区SNP突变与中国荷斯坦牛乳中体细胞评分(somatic cell score, SCS)、临床乳房炎(clinical mastitis, CM)和泌乳性状的相关性,本研究根据TLR1基因启动子区序列,利用PCR-直接测序法对低SCS和高SCS各20个样本进行SNP筛查,将筛选到的TLR1-245 G>T利用飞行质谱法对866头中国荷斯坦牛进行检测,同时收集所检测牛只临床乳房炎发生情况、SCS和泌乳性状等信息,利用多因素方差分析SNP位点突变对相应指标的影响。结果表明,TLR1基因启动子区700 bp范围内只发现TLR1-245 G>T 1个SNP突变;TLR1-245 G>T 与中国荷斯坦牛日产奶量及SCS极显著相关(P<0.01),与乳脂率、乳蛋白率、乳糖、总固体以及尿素氮含量无显著相关(P>0.05),GG型个体日产量及SCS均显著低于GT 和TT型个体(P<0.05)。TLR1-245 G>T 与奶牛患临床乳房炎次数显著相关(P<0.05),TT型个体患临床乳房炎次数显著低于GG和GT型个体(P<0.05)。研究结果为提高中国荷斯坦牛产奶量和控制乳中体细胞数的分子标记选择提供了参考资料。
小反刍兽疫病毒甘肃株F基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备
Cloning and Prokaryotic Expression of F Gene of Peste des petits ruminants virus GS Strain and Preparation of Polyclonal Antibody
肖敏 包世俊 邢小勇 常惠芸 薛慧文
2017, 25(3): 477-484  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (1265 KB)  ( 251 )
摘要
小反刍兽疫(peste des petits ruminants, PPR)是由副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbillivirus)的小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus, PPRV)引起绵羊(Ovis aries)和山羊(Capra hircus)等小反刍兽的一种急性和高度传染性病毒性疾病,由于其高死亡率常造成绵羊和山羊养殖业的重大经济损失。为研究小反刍兽疫病毒甘肃(GS)株融合蛋白(fusion protein)基因序列特征及其免疫原性,参照GenBank中PPRV Nigeria 75/1株F基因序列(GenBank登录号: HQ197753)设计引物,应用RT-PCR扩增PPRV GS株F基因,在测序及序列分析的基础上,设计引物扩增去信号肽和跨膜区的F基因片段Fa并将其亚克隆至原核表达载体pET-32a(+)。重组质粒pET-PPRV-Fa转化大肠杆菌表达菌(Escherichia coli)Transetta(DE3)后经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)诱导表达,表达产物纯化后免疫新西兰兔(Oryctolagus cuniculus)制备多克隆抗体,进而应用间接酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)和Western blot对重组蛋白免疫原性进行分析。结果表明,PPRV GS株F基因(GenBank登录号: KX822738)完整CDS全长1 641 bp,编码546个氨基酸。去信号肽和跨膜区的F基因片段Fa在大肠杆菌中成功获得表达,重组蛋白大小约为59 kD,且主要以包涵体形式存在;间接ELISA和Western blot结果表明,纯化产物免疫原性良好。研究结果为F蛋白的相关功能研究及小反刍兽疫的快速诊断方法的建立提供了理论依据。
山葡萄COR413家族基因克隆及其参与低温胁迫的表达分析
Cloning and Expression Analysis of COR413 Family Genes from Vitis amurensis in Response to Cold Stress
丁小玲 张宁波 焦淑珍 申威 史文婷 徐伟荣
2017, 25(3): 366-377  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (3849 KB)  ( 456 )
摘要
冷适应蛋白(cold-regulated, COR413)基因作为植物特有的一类低温胁迫响应功能基因,在抗寒过程中发挥重要作用。为了鉴定葡萄属(Vitis)植物COR413基因参与低温胁迫响应的功能特点,本研究基于欧洲葡萄基因组数据库挖掘,采用同源克隆法获得了抗寒种质山葡萄(Vitis amurensis) COR413基因家族成员的4条序列,分别命名为VaCOR413-PM2A、-PM1X1、-IM1与-PM2B。经序列分析表明,所克隆的4条山葡萄COR413基因家族成员与欧洲葡萄相应基因的核苷酸与氨基酸序列高度同源,其核苷酸序列的差异仅为个别单核苷酸的替代。所克隆的4个山葡萄冷适应蛋白家族基因均含有WCOR413保守结构域、跨膜结构域与丝/苏/酪氨酸磷酸化位点,其中仅VaCOR413-PM1X1含有一个预测的N端信号肽序列,仅VaCOR413-PM2B包含1个糖基化磷脂酰肌醇锚点。源于2个葡萄种质中COR413基因家族成员可以聚类为2个明显的簇,COR413-PM2A,-PM1X1与-PM2B聚类在一簇,而COR413-IM1分布在另外一簇。半定量RT-PCR组织特异性检测结果表明,VaCOR413-PM2A、-PM1X1、-IM1与-PM2B在山葡萄不同组织和器官中表达存在差异,且不同于欧洲葡萄相应基因的表达模式;其中山葡萄VaCOR413-PM2A、-PM1X1、-IM1与-PM2B在所有检测的组织中均表达且强度不同,VaCOR413-PM2A与-PM1X1在嫩梢、卷须、花絮以及幼叶中表达量较高。在低温胁迫条件下,山葡萄COR413基因家族4个成员参与低温胁迫的表达模式分为2类,而欧洲葡萄中相应成员有3种模式;山葡萄VaCOR413-IM1受低温胁迫24 h表达量最高,为对照的9.57倍,而欧洲葡萄VvCOR413-IM1在低温胁迫3 h后的表达量较高,约为对照的3.65倍。低温胁迫下的表达数据表明,山葡萄COR413基因家族成员中聚类为一簇的VaCOR413-PM2A,-PM1X1与-PM2B响应低温总体呈下调表达,其表达幅度均低于欧洲葡萄相应基因的表达量,而聚类在另外一簇的VaCOR413-IM1对低温胁迫(24 h)响应诱导表达显著;研究结果为探明该基因家族成员在葡萄响应低温胁迫过程中的可能功能和作用机制提供了参考依据,同时为葡萄属植物抗寒(冻)性分子改良提供了理论依据。
蒙古马主要性格性状与其候选基因多态性相关性分析
Association Analysis Between Major Temperament Traits and Diversification of the Candidate Gene in Mongolian Horse (Equus caballus)
任秀娟 杨虹 赵一萍 萨如拉 苏少锋 王希生 鲍红梅 白东义 李蓓 乌尼尔夫 芒来
2017, 25(3): 405-414  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (2993 KB)  ( 210 )
摘要
马(Equus caballus)的性格行为直接决定其是否或如何被调教训练,蒙古马是受外血影响较小的自然品种,因此,蒙古马是研究马性格行为相关多态位点的最适合的品种。本研究旨在识别脑源性神经营养因子基因(brain derived neurotrophic factor, BDNF)、多巴胺-β-羟化酶基因(dopamine beta-hydroxylase, DBH)、5-羟色胺转运体基因(solute carrier family 6 member 4 gene, SLC6A4)和儿茶酚-O-甲基转移酶基因(catechol-O-methyltransferase, COMT)片段的多态性,并分析其与蒙古马性格行为的相关性。选用饲养环境和受调教均相同的60匹蒙古马,编号和颈静脉采血。以实地问卷调查的方法,对能反应马匹性格行为的28个表型性状,进行统计学描述。采用单链构象多态性检测(single strand conformational polymorphism, SSCP)和测序的方法,分析4个性格候选基因的多态性;并进行基因分型,分析其与蒙古马性格性状的相关性。结果表明,蒙古马BDNF基因的222 bp (C→T)和261 bp (G→C)位点均有一个突变,且与咬人行为显著相关;DBH基因的第758 bp处有一个(G→A)突变,与对其他马友好和忍耐力行为显著相关,且与理解力、过河、游泳和沙浴等行为相关极显著;SLC6A4基因的第1 362 bp处有一个(T→C)突变,与神经质、恐慌性、对马具的反应和胆怯性等行为相关,与独立性行为相关极显著;COMT基因的第217 bp处有一个(G→A)突变,显著影响蒙古马的竞争性行为。这些数据说明,BDNF、DBH、SLC6A4和COMT基因与蒙古马的性格行为性状相关,而且SLC6A4基因的多态位点在蒙古马以后的进化过程中会稳定遗传。本研究为建立蒙古马性格行为性状的分子标记辅助选择提供了理论依据。
甘蔗钾转运蛋白基因SsHAK2 的克隆及表达特性分析
Cloning and Expression Analysis of Potassium Transporter SsHAK2 in Sugarcane (Saccharum species hybrid)
凌秋平 曾巧英 胡斐 吴嘉云 樊丽娜 李奇伟 齐永文
2017, 25(3): 378-385  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (2469 KB)  ( 419 )
摘要
甘蔗(Saccharum species hybrid)是最重要的糖料作物,由于其生育周期长,生物量大,对钾的需求量也大。南方是我国甘蔗的主要种植区域,由于土壤本身特性,有效钾含量低,限制了甘蔗的生产。因此,培育耐低钾甘蔗品种是提高甘蔗钾吸收效率的有效途径之一。本研究以甘蔗品种新台糖22号为材料进行低钾胁迫处理,利用RT-PCR技术从其根系中克隆得到钾转运蛋白基因,命名为SsHAK2(GenBank登录号: KM98738)。该基因全长为2 798 bp,包含一个完整的2 352 bp的ORF,编码784个氨基酸,相对分子量为87.602 kD,等电点为8.85,预测其为碱性蛋白。SsHAK2苷酸序列包含了12个跨膜结构域(S1~S12),有80%的概率定位在细胞质膜上。同时,该基因还包含3个保守结构域,分别为钾转运蛋白结构域和氨基酸转运蛋白结构域。SsHAK2基因与玉米(Zea mays)、大麦(Hordeum vulgare)、水稻(Oryza sativa)等其他作物中HAK基因具有高度的同源性,一致的核苷酸比例在52%~95%。qPCR分析结果表明,在低钾、干旱和盐胁迫下,SsHAK2的表达都发生改变。在低钾胁迫条件下处理96 h,该基因相对表达量最大,约达到对照的1.70倍;在盐胁迫条件下处理48 h,该基因的相对表达量出现显著上调,96 h相对表达量最高,约为对照的4.37倍。在干旱胁迫12 h,该基因的相对表达量达到最高,约为对照的4.07倍。干旱胁迫处理24 h,该基因表达量约为对照的1.69倍。但是,在干旱胁迫24 到48 h过程中表达由下调转为上调。干旱胁迫48 h后,该基因的表达迅速下调,96 h时该基因表达量最低,约为对照表达量的1/4。qPCR分析结果表明该基因在低钾、干旱和盐胁迫下发挥重要的调控作用。本研究结果为进一步研究甘蔗钾吸收分子机制提供基础。
大白菜—不结球白菜BC2F1代导入外源片段的鉴定和表型分析
Identification of Introgressed Alien Segments and Phenotypic Analysis in BC2F1 Progenies from Chinese Cabbage (Brassica campestris ssp. pekinensis) and Non Heading Chinese Cabbage (B. campestris ssp. chinensis)
苏建辉 轩淑欣 罗双霞 王彦华 马聪 陈雪平 申书兴
2017, 25(3): 345-353  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (10622 KB)  ( 268 )
摘要
染色体片段导入系是进行QTL精细定位、研究QTL互作和杂种优势机理的重要材料,分子标记辅助选择是染色体片段导入系创建中外源片段鉴定的重要手段。为了明确大白菜(Brassica campestris ssp. chinensis)—不结球白菜(Brassica campestris ssp. pekinensis)染色体导入系创建过程回交后代中外源染色体片段导入和丢失情况,以及外源片段对于大白菜表型性状的影响,本实验在对大白菜85-1和不结球白菜JinglvNo.2多态性InDel标记筛选的基础上,进一步对大白菜—不结球白菜BC2F1代进行了导入外源片段的InDel标记鉴定和表型分析。结果表明,供试的264个大白菜InDel标记,有186个在85-1和JinglvNo.2间表现出多态性,其中JinglvNo.2相对85-1特异的InDel标记有160个,分布于白菜(B. rapa)的10条染色体,每条染色体特异标记数为6~26个不等。从10条染色体不同位置挑选52个InDel标记用以鉴定大白菜—不结球白菜BC2F1代群体,其中50个InDel标记在196个BC2F1植株中以不同频率鉴定出来,含有8个外源片段的植株数最多。通过GGT(Graphical Geno Typing)软件分析,筛选出导入外源片段较少且携带有50个InDel标记的外源片段的BC2F1植株40株,可进一步用于单片段导入系的建立。进一步表型观测表明,BC2F1代单株在叶片形状、大小、颜色及抽薹性、花色等性状上表现了分离。本研究结果为整套大白菜—不结球白菜染色体片段导入系的创建提供了技术支持,并为研究不同外源片段的导入对植株表型变异影响提供了材料。
研究资源与技术改进
GH蛋白诱导鸡原代成肌细胞表达IGF1条件优化
The Effect of GH Protein on the Expression of IGF1 in Chicken (Gallus gallus) Myoblast Cells
张丽 王章 李婷 徐海冬 效梅 刘满清 聂庆华 张细权 安立龙
2017, 25(3): 511-516  |  Full text (HTML) (1 KB)  |   PDF  (1006 KB)  ( 269 )
摘要
生长激素(growth hormone, GH)具有促进动物生长发育的作用,其通过内分泌系统与生长激素受体(growth hormone receptor, GHR)结合形成GH-GHR-IGF1信号通路,在组织和器官发育过程中发挥功能。胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1, IGF1)是一种生长调节多肽,对动物的生长发育和生理调节有重要作用。为了确定体外培养条件下GH诱导鸡成肌细胞表达IGF1的最佳添加方式和浓度,本实验通过分离培养鸡(Gallus gallus)原代成肌细胞,研究GH对下游IGF1 mRNA和蛋白质表达的影响。实验选用孵化至11胚龄的鸡胚,在无菌条件下分离其腿肌组织,通过机械法和差速贴壁法分离纯化获得鸡原代成肌细胞。在此基础上,分别在有血清和血清饥饿条件下,在培养液中添加不同浓度的GH (50, 100, 200和500 ng/mL)诱导培养3 h,收获细胞,定量分析IGF1的表达变化。结果表明,体外培养条件下GH可以诱导鸡成肌细胞表达IGF1 mRNA和蛋白质。在相同的GH添加浓度下,IGF1在血清饥饿条件下的表达量高于有血清培养条件。尤其是在200 ng/mL添加浓度下,IGF1表达量极显著高于有血清培养条件。研究结果表明,在血清饥饿培养条件下,200 ng/mL GH能够诱导鸡原代成肌细胞表达IGF1的量达到最高水平。本研究的开展为揭示GH-GHR-IGF1通路调控鸡成肌细胞增殖和分化的机制提供了理论依据,为研究肉鸡骨骼肌发育提供了基本数据和资料。
 
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