病程相关蛋白1 (pathogenesis-related protein 1, PR1)是植物重要的抗逆防御蛋白,小麦(Triticum aestivum) TaPR1基因受小麦叶锈菌(Puccinia triticina, Pt)诱导表达,参与小麦对叶锈病的防御反应。本课题组前期利用基因克隆方法成功获得TaPR1启动子序列,命名为pTaPR1,其中900 bp序列(pTaPR1₉₀₀)具有较强的活性。本研究进一步对pTaPR1的序列组成和可能的调控因子进行分析。根据PLACE和PlantCARE数据库初步分析,pTaPR1序列中包含核心元件TATA-box、CAAT-box及大量光反应元件,还包含脱落酸应答元件和响应低温诱导的MYB结合位点。利用酵母单杂交技术(yeast one-hybrid, Y1H)筛选,共获得12个可能与pTaPR1₉₀₀结合的转录因子;利用Y1H回复验证,初步证实U-box E3泛素连接酶、花粉蛋白、甘氨酸A3蛋白和重金属伴生异戊二烯基植物蛋白与pTaPR1₉₀₀互作。本研究为深入探讨TaPR1转录调控机制提供理论参考。

培育耐盐碱和抗晚疫病的马铃薯(Solanum tuberosum)是马铃薯产业发展的重要需求之一。为初步解析马铃薯响应盐胁迫和晚疫病的病原—致病疫霉(Phytophthora infestans)侵染的机制,本研究通过转录组测序筛选响应盐胁迫和致病疫霉侵染的关键基因。结果显示,对于育苗块培养4周后的马铃薯组培苗,用100 mmol/L NaCl处理1周后,致病疫霉在叶片上的侵染面积显著增大,即盐胁迫使马铃薯对致病疫霉的抵抗能力显著减弱;转录组测序发现,盐胁迫条件下3 780个马铃薯基因表达发生显著变化,其中半胱氨酸蛋白酶抑制子6 (cystatin 6, CYS6)基因显著下调表达。qRT-PCR结果进一步证明,StCYS6基因在盐胁迫处理的马铃薯叶片中下调表达,而在致病疫霉侵染后上调表达;StCYS6基因在本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶片中瞬时表达可显著提升植株对致病疫霉的抗性。失活突变体的瞬时表达结果显示,StCYS6蛋白促进烟草对致病疫霉的抗性并不依赖于其半胱氨酸蛋白酶抑制子活性。对StCYS6转基因马铃薯植株进行耐盐性和致病疫霉抗性分析,结果显示,马铃薯叶片的萎蔫程度显著降低,即StCYS6能够显著提升马铃薯耐盐能力;但是,StCYS6转基因马铃薯植株对致病疫霉的抗性没有明显改善。本研究获得可增强马铃薯耐盐能力的候选基因StCYS6,为培育抗逆马铃薯新品种提供基础资料。

果实着色主要由花青素等黄酮类化合物决定,MYB类转录因子在花青素调控中起着重要的作用。为探究草莓(Fragaria vesca) MYB基因家族对草莓果实着色的作用,本研究通过对拟南芥(Arabidopsis thaliana)和草莓基因数据库的MYB基因家族序列进行同源比对,鉴定出草莓MYB基因家族成员114个。通过生物信息学分析软件对草莓MYB基因家族进行染色体定位、理化性质、亚细胞定位和二级结构分析,确定基因的命名和主要表达的位置;通过共线性、基因结构、启动子顺式作用元件预测等对基因家族进行划分并预测其功能。结果表明,MYB家族成员主要在细胞核中表达;除了FvMYB7外其余都为亲水蛋白;114个成员中有107个蛋白之间存在相互作用;有1个高频密码子的相对同义密码子使用度大于2.0,表明草莓MYB基因中存在极强偏好性的密码子;根据系统进化树可将114个成员分为3个亚族;除FvMYB72不含有任何作用元件,其他成员均含有光、非生物胁迫、激素、分生组织响应元件。qRT-PCR分析表明,大多数成员均在S3时期(50%着色期)相对表达量高,但FvMYB33、FvMYB57、FvMYB75在S4时期(完全着色期)表达量较高;组织特异性表达谱结果表明,只有FvMYB33在果皮中特异性表达,且其花青素含量在S4时期最高;推测FvMYB33为调控草莓果实着色的主要基因。本研究为MYB基因家族在草莓果实着色中的作用机制提供了参考。

花青苷是影响植物花瓣着色的主要色素。根据课题组前期矮牵牛(Petunia hybrida)转录组数据筛选出在花蕾着色期高表达的4香豆酰辅酶A连接酶13 (4-coumarate CoA ligase 13, Ph4CL13)基因,推测其与花青苷合成有关。为研究Ph4CL13在花青苷合成中的功能,本研究以矮牵牛'紫罗兰'作为材料,通过矮牵牛基因组筛选并克隆得到长度为1 653 bp的Ph4CL13 (Peaxi162Scf00089g00045.1) cDNA片段。系统发育树分析显示,Ph4CL13与草莓(Fragaria×ananassa) Fa4CL-1和Fa4CL-2亲缘关系较近。qPCR分析Ph4CL13在矮牵牛花开放不同阶段的表达模式发现,Ph4CL13在矮牵牛花蕾着色期高表达,推测Ph4CL13可能参与花青苷合成从而影响矮牵牛花色。通过病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing, VIGS)技术沉默Ph4CL13,结果显示,Ph4CL13沉默后矮牵牛花色变白,花青苷水平较对照显著降低;qPCR分析结果显示,沉默Ph4CL13后使其下游多个花青苷合成相关基因查尔酮合成酶(chalconesynthase, CHS)、查尔酮异构酶(chalcone isomerase, CHI)、黄烷酮-3-羟化酶(flavanone-3-hydroxylase, F3H)、二氢黄酮醇还原酶(dihydroflavonol 4-reductase, DFR)、黄酮醇合成酶(flavonoid synthase, FLS)的转录被抑制,表明Ph4CL13在矮牵牛花蕾着色期的花青苷合成阶段发挥重要作用,且编码花青苷合成酶的基因间可能存在复杂的反馈机制。本研究初步揭示了Ph4CL13在花青苷合成中的作用,为后续深入解析其在花色形成中的分子机制提供参考。

杜鹃花(Rhododendron)具有极高的观赏价值、经济价值和药用价值,而目前栽培的大多数杜鹃优良品种的耐热性较差,温度的升高会严重影响其正常生长发育。热激转录因子(heat stress transcription factors, HSFs)在植物热激应答或耐热性调控中起核心作用。本研究克隆了锦绣杜鹃(Rhododendron×pulchrum) RpHSFC1a (GenBank No. OQ628046)和八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase)基因RpPDS (GenBank No. OQ628048),以RpPDS为报告基因,烟草脆裂叶病毒(Tobacco rattle virus, TRV)为载体,构建锦绣杜鹃病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)体系,并对RpHSFC1a基因的生物信息学及其在响应高温胁迫中的功能进行了分析。通过表型观测、PCR和qPCR方法检测发现,TRV病毒可以侵染并在锦绣杜鹃叶片中复制和转移,当RpPDS基因被抑制表达后,锦绣杜鹃叶片会出现黄化现象,表明TRV病毒介导的基因沉默体系可以在锦绣杜鹃中应用。RpHSFC1a基因的CDS共891 bp,编码296个氨基酸,编码蛋白具有HSF_DNA-bind superfamily保守结构域。RpHSFC1a蛋白预测为亲水蛋白和跨膜蛋白。系统发育分析表明,RpHSFC1a蛋白与君迁子(Diospyros lotus) HSFC1同源性最高,为75.8%。热胁迫下,RpHSFC1a基因显著高表达,RpHSFC1a基因沉默株系叶片的叶绿素参数F_v/F_m、PI_ABS和ET_o/RC显著小于对照组;而DI_o/RC显著高于对照组。表明RpHSFC1a基因的低表达可导致PSⅡ光能利用的能力降低,进而降低了锦绣杜鹃抵御高温胁迫的能力,推测RpHSFC1a基因参与锦绣杜鹃响应高温胁迫的调控。本研究可为杜鹃耐热性的研究提供理论参考,也为提高杜鹃高温胁迫耐受能力提供基因资源。

国产百合(Lilium spp.)种球培育周期长、品质差,是导致我国百合种球长期依赖进口的重要因素。植物特异性转录因子NAC在调节植物生长发育、抗性建立等方面发挥着重要作用,在百合中挖掘、鉴定并研究NAC转录因子基因用于转基因技术改良植物性状,是解决上述问题的一种策略。本研究在百合转录组数据库中筛选到1个携带NAC结构域的基因转录本,基于PCR技术克隆并鉴定其为LoNAC48基因(GenBank No. PP078617)。生物信息学分析表明,LoNAC48基因包含1个长度为777 bp完整的开放阅读框,编码258个氨基酸,属于不稳定的疏水性蛋白;进化树分析显示,其与岷江百合(Lilium regale) LrNAC48高度同源;亚细胞定位结果表明,LoNAC48属于核转录因子。组织表达分析表明,LoNAC48基因在鳞茎、根、花等组织器官中均有表达,其中叶片中表达量最高;不同逆境响应结果表明,LoNAC48基因的表达易受低温、高温、干旱、盐、过氧化氢胁迫的影响,在低温、盐与过氧化氢胁迫下,与对照相比,12 h时表达量均显著上调,干旱胁迫24 h时表达量显著降低,且在盐胁迫与过氧化氢胁迫条件下,LoNAC48的表达模式几乎是一致的。通过转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)株系表型分析显示,过表达LoNAC48基因可显著促进拟南芥生长并增加叶片面积。以上结果表明,LoNAC48基因具备抗逆和调控植物生长发育双重功能。本研究为百合分子辅助育种,改良百合性状提供了基因资源。

薰衣草(Lavandula)是重要的芳香作物,其精油品质的差异主要由芳樟醇和乙酸芳樟酯等萜烯类化合物的含量不同而引起。对薰衣草中可能参与调控精油主要成分生物合成的相关基因进行研究,可为培育薰衣草优异种质提供基因资源。碱性螺旋-环-螺旋(basic Helix-Loop-Helix, bHLH)转录因子家族在植物的生长发育和次生代谢等方面发挥着重要的作用,本研究以'杂花'薰衣草(Lavandula×intermedia）为材料,克隆了薰衣草LibHLH75基因(GenBank No. OR019688),其开放阅读框为831 bp,编码276个氨基酸,其蛋白与一串红(Salvia splendens) bHLH75-like蛋白和芡欧鼠尾草(S. hispanica) bHLH75蛋白的亲缘关系最近。qRT-PCR分析表明,LibHLH75基因在薰衣草不同组织及花冠的不同开花期均有表达,其在花萼和花蕾期的表达量最高。亚细胞定位和转录激活活性鉴定结果表明,LibHLH75基因编码的蛋白定位在细胞核内,且具有转录激活活性。本研究初步分析了LibHLH75基因的功能,为进一步揭示bHLH转录因子在薰衣草萜类化合物生物合成过程中的分子调控机制提供了理论依据。

RING finger蛋白通常具有E3泛素连接酶活性,在调节植物生长发育和响应生物和非生物胁迫过程中具有重要作用。然而,目前对于二穗短柄草(Brachypodium distachyon) RING finger基因家族的研究非常有限。本研究利用生物信息学方法系统对二穗短柄草RING finger基因家族进行了系统分析,通过qPCR对其在干旱、盐和脱落酸(abscisic acid, ABA)胁迫处理下的表达进行了初步分析。结果表明,在二穗短柄草基因组中共鉴定到了666个RING finger基因,在5条染色体上不均匀分布,并发生了39次基因间的复制。系统进化分析将RING finger基因家族划分为9个亚族,每个亚族的成员同源性较高,并含有相似的保守结构域和基序。物种间的共线性分析显示,RING finger基因家族源自基因组复制,基因片段重复和串联重复在其扩张和进化中起关键作用。水稻(Oryza sativa)和二穗短柄草有303对RING finger共线性基因,而拟南芥(Arabidopsis thaliana)和二穗短柄草只有48对,在二穗短柄草基因组内则共有39对RING finger共线性基因。组织表达谱显示,共547个RING finger基因在二穗短柄草不同组织中表达,39.8%的基因在二穗短柄草雄花中高度表达。基因差异表达分析显示,29个RING finger基因可能参与到干旱、盐和ABA胁迫的应答反应。qPCR结果显示,共有26个RING finger基因在干旱胁迫中显著上调表达(P<0.05),3个RING finger基因下调表达;27个RING finger基因参与盐胁迫的上调表达,2个下调表达;在ABA胁迫下,15个RING finger基因上调表达,9个RING finger基因下调表达,5个RING finger基因表达水平和对照持平。本研究为揭示RING finger基因家族的功能、进化及其在调节干旱胁迫中的作用机制提供了理论依据。

生物钟作为一种内源性计时系统,在调控哺乳动物行为活动与生理功能等方面发挥重要作用。为探究核心生物钟基因脑肌类芳香烃受体核转位蛋白1 (brain and muscle arnt-like protein 1, BMAL1)在山羊子宫内膜上皮细胞(goat endometrial epithelial cells, GEECs)凋亡过程中的作用,本研究以24月龄山羊子宫组织为材料克隆BMAL1基因的CDS序列,通过生物信息学方法分析、预测该基因及其编码蛋白的理化性质,利用qPCR技术检测其在山羊不同组织以及同步化后的GEECs中的表达变化;应用流式细胞术、qPCR与Western blot技术检测BMAL1基因过表达对GEECs凋亡的影响。结果显示,BMAL1基因的表达在各种组织以及不同时间点呈现显著的昼夜差异。山羊BMAL1基因的CDS全长1 881 bp,在哺乳动物中保守性较高,其编码蛋白可以通过与昼夜运动输出周期蛋白(circadian locomotor output cycles kaput, CLOCK)、核受体亚家族1D成员1 (nuclear receptor subfamily 1, group D, member 1, NR1D1)和酪蛋白激酶1δ (casein kinase 1δ, CSNK1D)等蛋白互作参与调控多种生理功能。流式细胞术结果表明,BMAL1过表达显著抑制了GEECs的凋亡(P<0.05)。qPCR和Western blot结果表明,BMAL1过表达导致促凋亡基因B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白(BCL-2-associated X protein, BAX)和肿瘤抑制基因P53在mRNA和蛋白的表达水平显著下降,抑凋亡基因B细胞淋巴瘤-2 (B cell lymphoma-2, BCL-2)的表达显著升高(P<0.05)。本研究为解析反刍动物生物钟系统的分子调控机制和进一步探究山羊BMAL1基因的生物学功能提供了基础。

Yes相关蛋白(Yes-associated protein, YAP)和TEA转录因子1 (TEA domain transcription factor 1, TEAD-1)是Hippo信号通路的核心因子,在调控细胞增殖和器官生长方面发挥重要作用。为检测YAP和TEAD-1在牦牛(Bos grunniens)胎盘不同发育时期的表达,探究Hippo信号通路在调控胎盘生长发育方面的生理作用,本研究采集妊娠牦牛胎盘组织样品,以胎儿头臀距为依据,将其分为不同发育阶段(<2月龄, 3月龄, 4月龄, >5月龄),采用qRT-PCR、Western blot和免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)技术对YAP和TEAD-1的表达情况进行了检测分析。结果显示,在牦牛胎盘组织中,YAP和TEAD-1主要表达于胎儿绒毛膜滋养巨细胞、柱状滋养细胞和母体子宫肉阜隐窝上皮细胞。随着妊娠的进行,YAP和TEAD-1 mRNA及其蛋白在牦牛胎盘组织中的表达量有明显的变化,且YAP和TEAD-1的变化趋势基本一致。这种协同表达特性及其表达量与胎盘发育阶段的相关性,提示YAP和TEAD-1可能通过Hippo信号通路参与了牦牛胎盘发育的调控,并在胎盘组织生理功能的发挥和妊娠维持方面发挥重要作用。研究结果为阐明牦牛胎盘发育及妊娠调控机制提供理论依据。

Fel d1蛋白是家猫(Felis catus)过敏原中最主要的致敏原,可引起人不同程度的过敏反应。Fel d1蛋白由2个异源的二聚体组成,其编码基因分别为chain 1 (CH1)和chain 2 (CH2)。本研究对38只不同品种的家养宠物猫CH1和CH2基因组序列进行生物信息学分析,进一步在CH2外显子位点设计2个单链引导RNA (single-guide RNAs, sgRNAs),构建打靶载体分别转染猫胎儿成纤维细胞,PCR测序验证靶位点突变效率。结果表明,CH1和CH2序列上分别含有12和51个多态性位点,且这些位点大多在富含GC的内含子2上,其他个别位于外显子2,内含子3和外显子3上。在整体的进化演变中,CH1的保守性要远高于CH2。CRISPR/Cas9打靶载体转染猫胎儿成纤维细胞后突变检测表明,CH2基因编辑效率为40%,2种突变方式均能消除潜在的抗原位点,其中敲除45个碱基的1型突变占比35%,敲除44个碱基的2型突变占比5%。本研究为进一步利用该CRISPR/Cas9打靶载体获得Fel d1基因突变细胞株进行体细胞核移植或胚胎注射获得低过敏原猫提供参考。

血管内皮生长因子B (vascular endothelial growth factor B, VEGFB)是骨骼肌摄取葡萄糖的重要调控因子,VEGFB敲除可促进糖尿病小鼠(Mus musculus)骨骼肌组织对葡萄糖的摄取,改善糖尿病小鼠的葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗。但是,目前VEGFB对骨骼肌细胞葡萄糖摄取的具体调控作用尚未阐明。为探究VEGFB对骨骼肌细胞葡萄糖摄取的影响,本研究以小鼠成肌细胞C2C12为模型,利用qPCR技术检测C2C12分化过程中VEGF信号相关基因和葡萄糖转运载体4 (glucose transporter 4, GLUT4)的表达,采用葡萄糖氧化酶法和2-NBDG (2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-13-diazol-4-yl) amino)-2-deoxy-D-glucose)法检测VEGFB、VEGF受体(VEGF receptor, VEGFR)抑制剂Axitinib和磷酸肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase, PI3K)抑制剂Wortmanin对C2C12分化过程中葡萄糖消耗量和摄取量的影响,采用Western blot检测GLUT4在细胞膜上及胞浆内的表达以及PI3K和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine kinase proteins, AKT)的激活情况。结果显示,与分化前相比,C2C12分化后VEGFB (P<0.01)、VEGFR2 (P<0.01)和GLUT4 (P<0.05)的基因表达显著增加;外源添加VEGFB显著增加C2C12在分化过程中对葡萄糖的摄取(P<0.05),显著促进GLUT4在细胞膜上的表达(P<0.05),同时激活PI3K/AKT通路;而VEGF受体抑制剂Axitinib可逆转VEGFB对葡萄糖摄取、GLUT4膜转位及PI3K/AKT激活的促进作用;此外,PI3K抑制剂Wotmanin处理也可逆转VEGFB对葡萄糖摄取及GLUT4细胞膜表达的促进作用。上述研究结果表明,VEGFB可能通过VEGFR-PI3K/AKT信号通路促进GLUT4向C2C12细胞膜转位,进而促进C2C12在分化过程中对葡萄糖的摄取。本研究揭示了VEGFB对成肌细胞C2C12分化过程中葡萄糖摄取的调控作用,为骨骼肌葡萄糖代谢调控提供了新的科学认识,也为深入研究骨骼肌葡萄糖代谢的调控机制提供基础依据。

生长激素(growth hormone, GH)-胰岛素样生长因子(insulin-like growth, IGF)轴是调控鱼类生长的主要内分泌轴线。为探讨生长激素受体(growth hormone receptor, GHR)在斑鳢(Channa maculata)雌、雄生长差异中的调控机制,本研究克隆了斑鳢ghr基因序列,分析了基因结构,解析了ghr在成鱼不同组织和不同发育时期肝脏中的表达模式及其对外源性类固醇激素刺激的响应表达。结果表明,斑鳢ghr基因cDNA序列全长2 602 bp,包括100 bp 5'-UTR,1 872 bp开放阅读框,编码623个氨基酸,630 bp 3'-UTR。斑鳢ghr基因组序列长18 118 bp,包含9个外显子和8个内含子,在5'-端上游鉴定到899 bp的侧翼序列,经分析发现,ghr 5'-端侧翼序列含有雄激素受体(androgen receptor, AR)、含溴结构域蛋白4 (bromodomain-containing protein 4, BRD4)和抑制元素-1-沉默转录因子(repressor element-1-silencing transcription factor, REST)等多种转录因子结合位点。成鱼组织表达分析证实ghr在斑鳢肝脏中高表达,且在雄性中的表达极显著高于雌性(P<0.01);不同发育时期表达分析表明,ghr基因在365 d的雄性斑鳢肝脏中表达量最高,且极显著高于同时期雌性斑鳢(P<0.01)。激素诱导实验显示,长期注射17α-乙炔基雌二醇(17α-ethynylestradiol, EE2)会抑制雌、雄斑鳢ghr基因的表达;长期注射17α-甲基睾丸酮(17α-methyltestosterone, MT)会抑制雌性斑鳢ghr的表达,但在一定时间内会促进雄性斑鳢ghr的表达。以上结果表明,GHR可能在斑鳢雌雄生长二态性中发挥作用,其表达受性类固醇激素调控,本研究为进一步探究GHR调控斑鳢生长发育的分子机理研究提供参考。

Flo8 (flocculation 8)基因是cAMP途径下游的关键转录调控因子,在真菌生长发育调控中发挥重要作用。本课题组前期初步明确了玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica) StFlo8基因参与调控其附着胞发育及侵染丝形成。本研究利用大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统对该基因与谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase, GST)标签进行异源表达,进一步通过GST融合蛋白沉降技术(GST pull-down)从玉米大斑病菌菌丝蛋白中筛选可能与StFlo8有互作关系的蛋白,并通过酵母双杂交对其中部分蛋白进行互作关系的验证。结果表明,原核表达获得大小为116 kD的目标产物,与GST-StFlo8大小一致。将成功纯化的表达产物经GST pull-down,共获得41种和StFlo8可能有互作关系的蛋白。挑选其中部分蛋白进行酵母双杂交验证,发现Flo8与FAD依赖性氧化还原酶(FAD-dependent oxidoreductase)(GenBank No. 165285)有互作关系。本研究初步明确了StFlo8的互作蛋白,为进一步解析玉米大斑病菌StFlo8活性调控分子机制提供了有效参考。

N⁶-甲基腺嘌呤(N⁶-methyladenosine, m⁶A)修饰是真核生物中最常见的RNA修饰。包含YT521-B同源(YT521-B homology, YTH)结构域的蛋白可识别m⁶A修饰,从而介导RNA代谢。该类蛋白在植物病原真菌中的研究还未见报道。本研究利用生物信息学方法,对127种植物病原真菌中的m⁶A识别蛋白进行了系统鉴定和分析,并对该类蛋白在玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)发育过程中的基因表达模式进行分析。结果发现,在供试的127个菌株中共鉴定了225个m⁶A识别蛋白,其中担子菌门中93%真菌含有2个m⁶A识别蛋白;理化性质分析发现,在鉴定的225个m⁶A识别蛋白中,有67.56%的蛋白呈碱性,且不同门及不同生活方式真菌的m⁶A识别蛋白酸碱性存在显著差异。系统发育分析发现,225个m⁶A识别蛋白可分为5组,其中2组与人类(Homo sapiens)具有较近的进化关系,相同门和相同生活方式真菌的m⁶A识别蛋白倾向于聚类在同一进化分支上;保守位点分析发现,YTH结构域序列在所有鉴定的m⁶A识别蛋白中存在多个保守型位点。在玉米大斑病菌中鉴定了1个编码该类蛋白的基因StYTH1,表达量分析发现,其在病菌附着胞发育时期的表达量最高,可能对病菌附着胞发育具有重要的调控作用。本研究为深入揭示m⁶A识别蛋白的功能提供了基础资料。

交配型是卵菌重要性状,致病疫霉(Phytophthora infestans)效应子PITG_02860和A1交配型性状分离连锁。为进一步探索PITG_02860基因功能,本研究首先改良了致病疫霉原生质体转化技术,以碗豆汁培养72 h的菌丝,采用复合酶(裂解酶, 10 mg/mL; 纤维素酶, 5 mg/mL)于26 ℃裂解45 min,原生质体制备率最高,为(31.5±2.36)个/μL;原生质体在黑麦培养基上再生率可达(3.34±0.20)%。依托该转化系统,以载体pTOR-mRFP为骨架,构建PITG_02860基因沉默载体并转化致病疫霉88069菌株,对2个阳性沉默子进行功能验证,发现与野生型相比,沉默子有性生殖产生的卵孢子数量显著下降且卵孢子畸形率显著增高(P<0.05),菌丝生长受阻,游动孢子数量显著下降(P<0.05),对马铃薯(Solanum tuberosum)叶片致病能力显著降低(P<0.05)。上述结果表明,PITG_02860不仅是致病疫霉有性生殖正常发生的关键基因,也是侵染马铃薯的重要毒性功能基因。本研究为明确致病疫霉有性生殖发生和解析致病疫霉对马铃薯的毒性机制提供了新思路。

CRISPR/Cas9技术作为第3代基因编辑技术,凭借设计简单、操作方便快捷、使用成本低廉等特性,在生命科学研究领域掀起了一场技术革命。目前CRISPR/Cas9技术已成功应用于动物、植物及微生物等真核及原核生物的基因编辑;近年来, 该技术也逐步被用于昆虫的研究中,并在害虫防治新技术探索方面显示了广阔的前景。本文主要就CRISPR/Cas9系统的工作原理进行了概述,并就该技术在害虫基因功能和防治方面的研究进展进行总结,旨在为利用该技术进行更为广阔的昆虫分子生物学及害虫防治策略研究提供参考。

米托蒽醌甲磺酸盐(mitoquinone mesylate, MitoQ)作为一种线粒体靶向抗氧化剂,已被证明能够减缓线粒体的氧化应激损伤、靶向线粒体以抵抗凋亡等,维持机体健康。现有研究已经证明MitoQ对于细胞损伤、器官损伤修复及各类疾病治疗具有重要的作用。本文综述了MitoQ的抗氧化、抵抗细胞炎症凋亡和其线粒体靶向性等生物学功能,并系统总结了MitoQ治疗神经退行性疾病、心血管损伤、代谢器官损伤和糖尿病的研究进展。本文为MitoQ在细胞生物学和临床疾病治疗中的应用提供参考。

氟喹诺酮类(fluoroquinolones, FQs)药物是人类医药与畜禽养殖中最常用的抗生素之一,因其用量大,在环境中广泛残留,对人类和动物健康构成潜在威胁。微生物降解是现阶段消除环境中FQs的理想方式,具有高效、绿色、成本低的特点。目前,关于微生物降解FQs的研究主要集中于降解微生物的筛选和降解产物的鉴定上。本文综述了降解FQs的细菌、真菌、微藻以及微生物降解聚生体的功能特征,并总结了常见降解途径与关键酶。本文为缓解FQs的环境残留问题提供理论基础。

视网膜色素上皮65 (retinal pigment epithelium 65, RPE65)基因在视循环中起重要作用,当RPE65基因发生突变时,视锥、视杆细胞功能丧失,严重的患者会视力丧失。为构建RPE65基因突变动物疾病模型,本研究利用转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALENs)基因编辑技术,以比格犬(Canis lupus familiaris)为实验动物,针对RPE65基因第3号和第7号外显子构建表达载体,结合显微操作创建RPE65基因编辑犬。通过临床观察、常规眼科检查、眼底照相(fundus photography, FP)、光学相干断层扫描(optical coherence tomography, OCT)和全视野视网膜电图(electroretinography, ERG)对幼犬视功能进行表型分析检测。T7E1酶切和基因测序结果显示,最终获得2只RPE65基因编辑雄性幼犬。眼科表型分析表明,RPE65基因编辑幼犬眼底血管稀疏纤细;ERG结果显示,光感受器细胞的电位活动a波、b波振幅降低,峰时延长,提示视网膜功能受损。本研究利用TALEN基因编辑技术构建的RPE65基因编辑幼犬存在视功能障碍,可为RPE65基因突变诱导的视网膜疾病及相关研究提供参考,还为治疗手段的开发、临床药物的筛选提供良好的动物疾病模型。

猪细小病毒6型(Porcine parvovirus type 6, PPV6)是一种新发现的猪细小病毒,可导致猪(Sus scrofa)出现繁殖障碍,严重威胁养猪业健康发展。为建立一种检测PPV6抗体的间接ELISA方法,本研究以PPV6流行毒株高度保守的病毒颗粒蛋白(virion protein, VP1)(348~675 aa)的编码基因为目标片段,构建原核表达载体pET30a-PPV6-VP1,转入大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,进行Ni-NTA树脂亲和层析纯化,获得具有良好的反应原性的重组VP1蛋白,大小约为40 kD。基于纯化的重组VP1蛋白建立间接ELISA抗体检测方法,优化出最佳抗原包被浓度为1 ng/μL,待检血清最佳稀释比例为1∶100,HRP-兔抗猪IgG稀释比例为1∶60 000,阳性临界值OD₄₅₀>0.62。该间接ELISA检测方法与猪蓝耳病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)、古典猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)、猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)、日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2, PCV2)、PPV1阳性猪血清均不发生交叉反应,敏感度达1∶3 200,批内变异系数和批间变异系数均<10%,与病毒中和试验(virus neutralization test, VNT)结果呈正相关,与Western blot结果的阳性符合率为96.6%,表明该间接ELISA检测方法拥有良好的特异性、敏感性、重复性和符合率。采用建立的间接ELISA方法对2018~2022年中国西部地区部分省份收集的452份猪血清进行检测,结果显示样品阳性率为5.31%,表明该病在我国西部地区存在不同程度的感染。本研究成功截短表达了PPV6 VP1 (348~675 aa)蛋白,建立了特异性强、灵敏度高、重复性好和符合率高的PPV6间接ELISA方法,为PPV6的血清学调查和检测试剂盒的开发提供了材料。