5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)催化莽草酸-3-磷酸(S3P)与磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)合成5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸(EPSP)，具有与草甘膦结合的活性位点，且结合后会抑制EPSPS的活性，在植物抗除草剂基因工程中具有重要的应用价值。为了培育抗草甘膦玉米(Zea mays)，本研究通过对高粱(Sorghum bicolor)EPSPS基因的结构分析，克隆了该基因5'端的叶绿体转运肽(chloroplast transit peptide, CTP)。将该转运肽与来源于农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株CP4 EPSPS基因整合，以Ubiquitin为启动子，35S polyA为终止子，构建表达载体，同时以不含有转运肽的CP4 EPSPS基因为对照，遗传转化玉米得到稳定转基因株系；用PCR、Southern blot、ELISA等方法检测转基因玉米CP4 EPSPS基因的表达量并对其进行草甘膦抗性检测，研究发现，不含转运肽的转化事件虽然CP4 EPSPS基因表达量与含有转运肽的基本一致但却不具有草甘膦抗性，而含有转运肽的转化事件则抗性明显。说明转运肽并不影响CP4 EPSPS基因的表达，但对转基因植株草甘膦抗性起着重要作用，说明本研究克隆的叶绿体转运肽能够正常行使其生物学功能。研究结果为利用EPSPS基因培育抗草甘膦作物提供了重要参考资料。

WRKY是植物中特有的锌指型转录因子，其广泛参与植物对生物及非生物胁迫的响应过程。本研究从小麦(Triticum aestivum L.)中分离出一个新的WRKY转录因子基因TaWRKY51，其全长cDNA序列长度为1 295 bp，其中开放阅读框(ORF)为942 bp，编码一个由313个氨基酸组成的多肽。用半定量RT-PCR进行表达谱分析，结果显示，TaWRKY51基因在分蘖节、叶和根系中的表达水平较高，并且受干旱胁迫诱导上调表达。在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中过量表达TaWRKY51基因导致转基因株系侧根数目明显增多，并且对ABA、干旱和盐等胁迫处理的敏感性增加，表明该基因可能在植物响应非生物逆境胁迫信号传导过程中起负调控作用。本研究有助于揭示TaWRKY51基因调控植物侧根发育及响应非生物逆境胁迫的分子机制。

RNA干涉技术是研究昆虫基因功能的一种有效的方法。通过人工饲料喂养dsRNA(double-stranded RNA)介导RNAi(RNA interference)在包括半翅目在内的许多目昆虫中取得了成功。而通过转基因植株产生dsRNA沉默昆虫基因仅在鳞翅目和鞘翅目中有报道。本研究通过体外合成褐飞虱(Nilaparvata lugens)两个基因(α-1链微管蛋白-ds1和微管蛋白特异的伴侣分子c-ds10)部分区段的同源dsRNA，体外喂食褐飞虱若虫后导致褐飞虱体内目标基因的下降表达和死亡率的增加。本研究同时构建这两个基因的干涉载体转化水稻(Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Zhonghua 11)，转基因苗喂食褐飞虱若虫后只有食用了个别转基因家系植株的褐飞虱体内目标基因的表达量有所下降，但是均没有导致虫体死亡。本研究中虽然转基因水稻未能导致褐飞虱的死亡，但是利用体外dsRNA喂食能够降低目标基因的表达量甚至导致褐飞虱的死亡，这预示着可以通过技术改进而达到培育抗褐飞虱转基因水稻的可行性，为后续转基因抗褐飞虱水稻的培育提供了依据。

目前对于植物体中丙酮酸脱氢酶激酶(pyruvate dehydrogenase kinase, PDK)的研究，除了解其参与调节线粒体丙酮酸脱氢酶复合体的活性外，对其他调控机制尚不清楚。本实验室的前期研究结果表明，小麦丙酮酸脱氢酶激酶(TaPDK)在小麦(Triticum aestivum)遗传型不育系和相应的生理型不育系中的表达是不一致的。为进一步研究SQ-1诱导的小麦花药败育过程中调控TaPDK的作用因子，本研究采用酵母双杂交方法筛选小麦TaPDK的互作蛋白。将含有pGBKT7-PDK质粒的酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株Y2HGold与文库酵母菌株Y187共同融合培养，在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板上划线培养，挑选直径大于2 mm的克隆，在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp /AbA/X-α-Gal平板上划线，筛选蓝色克隆。其中，筛选得到一个新的结合蛋白，该蛋白被命名为增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, TaPCNA)。将花粉细胞的核复制分裂与TaPCNA的定量表达结合分析发现，TaPCNA在不育系与可育系的叶片中几乎不表达，但在花粉发育的各个时期中呈现高表达，尤其在生理型不育系花药中的表达量显著高于遗传型不育系和可育系，这表明在生理型不育系中，TaPCNA与小孢子的细胞周期发育更加密切相关。这为进一步研究生理型不育小孢子异常发育的细胞周期提供了基础资料。

α-甘露糖苷酶(α-man)是植物体内N聚糖加工的关键酶，在控制果实软化和延长货架期方面起重要作用。明确α-man在桃果实软化中的生理功能及其调控机制对进一步阐明桃果实的成熟软化机理具有重要意义。以商业成熟期桃(Prunus persica)沙红果实为材料，采用RT-PCR和RACE相结合的方法，克隆桃果实中α-man基因全长cDNA，并利用实时荧光PCR定量技术，检测了采后乙烯利和1-methylcyclopropene(1-MCP)处理沙红果实软化过程中α-man基因的表达差异。结果表明：桃果实α-man基因的cDNA全长长3 491 bp，包含一个3 075 bp完整的开放阅读框，编码1 024个氨基酸(Genbank登录号: JX310861)，N端含有NXT/S的糖基化位点，属糖基水解酶38家族。实时荧光PCR定量技术检测发现对照果实在贮藏第2天出现α-man的表达高峰；外源乙烯处理α-man基因表达高峰提前1 d出现，且峰值显著高于对照果实；而1-MCP处理可使α-man基因的表达高峰延迟1 d，且后期α-man基因的表达受到极显著抑制。据此推断桃果实α-man基因可能受乙烯生成和乙烯信号转导途径的调控，参与桃果实的软化过程。

乙烯是启动和促进果蔬成熟和衰老的内源激素，ACC氧化酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase, ACO)是乙烯生物合成中的一个关键限速酶。葡萄ACO基因拥有一个基因家族，其中VvACO1和VvACO2基因在果实转色时期出现转录高峰，是葡萄果实发育过程中造成乙烯含量发生变化的关键基因。为验证葡萄(Vitis vinifera)ACO家族基因过量表达对番茄(Solanum locopersicum)乙烯释放速率的影响，本研究通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将葡萄ACO基因导入番茄基因组中，进行了PCR和RT-PCR分子检测，并对分子检测阳性的转基因番茄植株叶片的ACO酶活性和乙烯释放速率进行了分析。RT-PCR检测表明，在3个VvACO1、4个VvACO2和6个VvACO3转基因番茄植株中目的基因均有一定的表达。所有转基因番茄植株的ACO酶活性和乙烯释放速率均比对照有所提高，其中以VvACO1基因的过量表达对叶片ACO酶活和乙烯释放速率增加的幅度最大，VvACO3基因的过量表达对果实的ACO酶活和乙烯释放速率增加的幅度最大，而转化VvACO2基因的番茄植株ACO酶活性和乙烯释放速率最低，比对照略有升高，且植株呈现矮化现象。本研究通过观察转基因番茄的生长状况以及测定转基因番茄的生理指标，探讨葡萄ACO家族基因的过量表达对番茄的影响，来预测葡萄ACO基因的初步功能。

目前已经找到一种由雷公藤 (Tripterygium wilfordii Hook.f.)细胞培养法生产雷公藤甲素和生物碱的方法，但是这种方法生产的次生代谢物产量较低，因此本研究利用紫外光(UV-B)辐照和超声波处理对雷公藤悬浮培养体系中萜类次生代谢物的含量进行了检测分析。在雷公藤悬浮细胞的不同培养时期，利用不同时长的UV-B辐照和超声波分别处理的雷公藤悬浮细胞和培养体系，采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)对悬浮细胞和培养液中雷公藤内酯醇、吉碱和次碱的含量进行测定。结果表明，利用UV-B辐照和超声波处理均可以显著提高雷公藤悬浮培养体系中悬浮细胞生长量及其次生代谢物的含量。紫外辐照及超声波处理均可使雷公藤悬浮细胞的生长量比对照提高1~2倍。在雷公藤悬浮细胞生长周期的第13天用UV-B辐照90 min，雷公藤悬浮细胞中内酯醇、吉碱和次碱产物含量达到最大，分别为5.185、39.747和42.189 μg/L；超声波处理40 s时，次生代谢物含量达到最大，分别为5.185、40.080和45.472 μg/L，与对照相比提高1~3倍。另外超声波处理对雷公藤悬浮细胞中次生代谢物释放分泌入细胞培养液中有一定程度的促进作用，通过对雷公藤悬浮细胞培养液中次生代谢物含量的检测发现，在处理时长分别为40 s时，内酯醇、吉碱和次碱的转化率分别达到93.7%、86.6%和88.1%，与对照相比含量提高1~3倍。本研究为解决雷公藤野生资源短缺，利用雷公藤悬浮细胞培养生产雷公藤内酯醇、吉碱和次碱提供基础资料。

过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator activated receptor γ, PPARγ)在脂肪和糖代谢平衡中起重要作用。为研究奶山羊(Capra hircus)PPARγ基因在泌乳过程中的生理功能，本研究以西农萨能奶山羊乳腺组织为材料，利用RT-PCR和RACE技术，克隆奶山羊PPARγ基因cDNA全长；利用荧光定量PCR检测该基因在奶山羊10个组织以及不同泌乳时期乳腺组织中的表达量；利用PPARγ特异性激动剂罗格列酮(rosiglitazone, ROSI)处理乳腺上皮细胞后，荧光定量PCR检测细胞内脂肪酸代谢相关基因的表达量。结果表明，奶山羊PPARγ基因cDNA序列全长为1 751 bp(GenBank登录号为: HQ589347)；同源性分析发现，PPARγ基因在哺乳动物间有较强的保守性；结构预测表明，奶山羊PPARγ蛋白具有2个锌指结构以及配体结合域；组织表达谱分析显示，PPARγ基因在奶山羊的脂肪组织中表达量最高，其次是瘤胃，而肌肉组织表达量最少；奶山羊两个泌乳时期乳腺组织中PPARγ表达量分析表明，泌乳盛期的表达量约是干乳期的2倍。罗格列酮处理乳腺上皮后检测发现，细胞内脂肪酸代谢相关基因：脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase, LPL)、脂肪酸结合蛋白(fatty acid binding protein, FABP3)、脂肪分化相关蛋白(adipose differentiation related protein, ADRP)和47 kD尾部相互作用蛋白(47-kD tail interacting protein, TIP47)等表达量显著性上调。研究结果提示，PPARγ基因在奶山羊泌乳过程的脂肪酸代谢中可能其重要作用，为进一步研究奶山羊个体水平调控乳脂生成、改善乳脂品质和发挥乳腺生物反应器功能提供基础资料。

血清白蛋白(albumin, alb)是血清中重要的运输蛋白，主要由肝脏合成。本研究旨在确定猪血清alb启动子活性区域及其主要调控元件，探索alb基因的表达调控机制。首先通过qRT-PCR方法检测猪(Sus scorfa)不同组织及肝脏细胞系(hepa1-6)、和胎儿成纤维细胞系(PEF)中内源性alb基因表达情况；采用基因克隆，DNA测序等技术手段，构建含有5个不同长度猪alb基因启动子区域的双荧光素酶报告基因载体，分别转染hepa1-6以及PEF，检测不同长度启动子活性。结果表明，猪alb基因为肝脏特异性表达基因；其启动子能启动体外荧光素酶报告基因表达；其核心启动子区域位于-184~-31 bp，该段序列的缺失造成启动子启动活性丧失；-184~-2 034 bp间存在参与猪alb基因表达调控的潜在正负调控元件。本研究构建了含有5个五指山猪alb基因启动子片段的双荧光素酶报告载体，确定了该基因的启动子核心区域，预测了alb基因起始密码子上游约2 kb内主要调控元件，有助于进一步研究该基因表达调控分子机制以及构建外源基因组织特异性表达载体。

为了构建我国荷斯坦种公牛个体及亲子鉴定DNA数据库，本研究从联合国粮农组织(FAO)和国际动物遗传学会(ISAG)推荐的具有高度多态性的微卫星标记中选取11个常染色体微卫星标记(BM1824、BM2113、ETH3、ETH10、ETH225、INRA023、SPS115、TGLA53、TGLA122、TGLA126和TGLA227)以及4个自选的Y染色体微卫星标记(MAF45、MCM158、UNM0108和UMN0929)，采用荧光引物PCR和ABI3130遗传分析仪，对2 150头荷斯坦种公牛(Bos taurus)个体基因型进行了检测，并探讨其用于牛个体识别和亲子鉴定的可行性。研究结果表明：15个微卫星标记平均杂合度为0.766，平均多态信息含量为0.738，其中MCM158标记平均多态信息含量最高为0.866，SPS115标记最低为0.588，均属于高多态性标记。15个标记累积个体识别能力为99.99%，累积非父排除率达到99.99%，随机个体一致性概率为1.62×10-17。研究结果表明上述15个微卫星标记进行个体识别和亲子鉴定的效力与可靠性均很高，同时初步建立了荷斯坦种公牛DNA数据库。从而使个体识别和亲子鉴定程序标准化、统一化和简便化。

瓜类细菌性果斑病(bacterial fruit blotch, BFB) 是由西瓜噬酸菌 (Acidovorax citrulli, Ac)引起的一种病害，严重为害西瓜、甜瓜的叶片和果实，造成大量减产。迄今，对该病害的研究主要集中在病原菌鉴定、病原菌检测技术、病害防治方法、品种抗病性鉴定等方面，而对病原菌的致病机理仍然知之甚少。本实验以西瓜噬酸菌 xjl12 菌株为背景构建转座子(mini-Tn5) 插入的突变体文库，以哈密瓜(Cucumis melo var. saccharinus)为实验材料，通过对哈密瓜种子浸种处理和子叶注射接种的方法筛选突变体，而后利用同源重组的方法获得插入突变体，并对所得的突变株及野生型、互补等各个菌株进行致病性、游动性等相关表型进行测定。研究结果表明，通过文库筛选得到的 1 株致病力明显下降的突变体，亚克隆鉴定可知该突变体 Δxj-25 的 Mini-Tn5 插入位点为吡哆醛磷酸生物合成蛋白基因(pdxJ 基因)，其功能主要与吡哆醛磷酸(俗称 VB6) 生物合成蛋白相关。突变菌株 ΔPdxJ 致病性显著下降，生长能力、游动性明显降低，无法正常形成鞭毛和产生生物膜。通过外源添加 VB6 可恢复其致病性和生长能力等主要表型。本研究证明VB6 生物合成在致病性、生长能力以及鞭毛的合成等方面发挥着重要作用，为降低病原菌侵害提供了一个新的思路。

阿苯达唑(albendazole)类药物是一种广谱抗蠕虫药物，在水产养殖上有重要作用， 但大量使用直接进入水体，并通过食物链富集影响人体健康。为了获得一株阿苯达唑高效降解菌，本研究从长期施用阿苯达唑药物的水体中分离到一株能以阿苯达唑为唯一碳源生长的菌株ZS-1，通过菌落表型、生理生化特征和菌株16S rRNA基因序列的相似性分析(测序后GenBank登录号：No.KC763472)，将其鉴定为红球菌属(Rhodococcus sp.)。ZS-1对阿苯达唑的降解特性表明，在以阿苯达唑为唯一碳源的无机盐培养基中，该菌株能有效地降解100 mg/L的阿苯达唑，3 d内对50 mg/L阿苯达唑的降解率高达90.6%。菌株ZS-1降解阿苯达唑的最适 pH值和温度分别为7.0和30℃，Cu2+对ZS-1降解阿苯达唑有一定的抑制作用。该研究为阿苯达唑污染水体的生物修复提供了理论依据。

致病疫霉(Phytophthora infestans)引起的马铃薯晚疫病是影响马铃薯生产的第一大真菌病害。通过致病疫霉基因组开发微卫星标记，旨为致病疫霉群体遗传结构研究提供更系统、有效的标记。利用软件SciRoKo和Clustal X对致病疫霉基因组中微卫星序列长度≥25 bp的适合标记开发的位点及两端序列进行筛选。然后在这些位点的两端序列上设计专一性PCR扩增引物，选择9株致病疫霉菌对引物的专一性和微卫星的多态性进行检测。最后利用40株不同年份和地理来源的致病疫霉菌株对可行性微卫星标记进行等位基因数的确定及其多态性评估，然后选取部分标记对40株致病疫霉群体进行遗传多样性分析。共获得了33个具多态性的微卫星标记，占开发总数的28.7%，其多态信息含量(PIC)值都在0.164~0.614之间，其中PIC≥0.5的标记有7个，0.25＜PIC＜0.5的标记有25个，PIC≤0.25的有1个。发现致病疫霉微卫星基因型与其交配型及地理来源有一定相关性，与甲霜灵敏感性不相关。本研究开发出一批具有多态性微卫星标记，为致病疫霉群体遗传学研究机理提供更多多态性高，稳定性强的分子标记。

腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase, AMPK),在真核细胞生物中广泛存在，是调控机体能量代谢的关键酶。本研究旨在构建并筛选猪(Sus scrofa)AMPKα基因的有效siRNA干扰载体，并探讨AMPKα基因对脂肪分解关键酶基因表达的影响。根据猪AMPKα基因(GenBank登录号：NM-001167633)全长cDNA序列，设计合成其特异性发夹siRNA干扰片段，将其克隆插入pSilencer 4.1-CMV neo Vector干扰载体中，构建猪AMPKα基因的siRNA真核表达载体RA1和RA2，并通过PCR、双酶切和测序对其进行鉴定。构建成功后转染猪肌内脂肪前体细胞并检测其干扰效果及对脂肪分解关键酶——激素敏感脂肪酶(hormone sensitive lipase, HSL)、脂肪甘油三酯脂肪酶(adipose triglyceride lipase, ATGL)和肉毒碱棕榈酰转移酶(carnitine palmitoyl transferase, CPT1)基因表达的影响。结果表明，所构建的猪AMPKα基因的特异性siRNA表达载体RA1和RA2均可降低猪AMPKα mRNA表达(P＜0.05)，而且RA2干扰效果优于RA1。用RA2干扰AMPKα 后，猪肌内脂肪前体细胞中AMPKα及脂肪分解关键酶HSL、ATGL和CPT1基因表达量显著下降(P＜0.05)。提示，抑制AMPKα基因表达后，猪肌内脂肪前体细胞中脂肪分解和脂肪酸氧化速率降低。本研究结果为深入探讨AMPKα对猪脂肪代谢的影响机制及通过营养调控基因表达进而调控猪体脂沉积提供基础资料。

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、哈维氏弧菌(V. harveyi)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)和副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)是我国海水养殖动物5种重要的病原菌。本研究在分析了其致病因子基因的基础上，依据扩增子拯救多重PCR(Arm-PCR)的原理，设计了5套特异性的套式PCR引物，并在各内引物的5'端分别加上能被一对通用引物识别的标签序列；通过对套式PCR中影响扩增结果的引物混合物浓度、退火温度、Mg2+浓度、dNTPs浓度以及Taq DNA聚合酶浓度等5个反应参数的调整和优化，最终建立了一种能同步检测海水养殖动物5种常见病原菌的Arm-PCR方法。优化后的Arm-PCR方法第一步PCR反应体系为：10×PCR Buffer 5 μL(含20 mmol/L的Mg2+)，dNTP(各2.5 mmol/L)5 μL，Taq酶(2.5 U/μL)0.6 μL，10×Primer Mix(2 μmol/L)5 μL，DNA模板各1 μL，灭菌双蒸馏水补足至50 μL，反应的退火温度为55℃。实验结果表明：对鳗弧菌、哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌和副溶血弧菌这5种病原菌，使用该方法可以在1支反应管内快速、同步进行检测，得到大小分别为144、190、266、315和371 bp的特异性产物，其检出灵敏度分别为1.745、1.847、16.000、28.126和369.900 pg细菌基因组DNA；该方法特异性强，与大肠杆菌(Escherichia coli)、溶藻弧菌(V. alginolyticus)、河豚毒素假交替单胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等其他细菌以及半滑舌鳎基因组DNA不产生交叉反应。2012年，应用该Arm-PCR方法对分离自病鱼的24个优势菌株进行了检测，确定出5株迟缓爱德华氏菌、3株嗜水气单胞菌、2株哈维氏弧菌及2株副溶血弧菌，证实该方法具有良好的可靠性和实用性。该方法不仅适用于海水养殖动物中致病性鳗弧菌、哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、副溶血弧菌的快速、同步检测和病原流行情况调查，也为进一步开发相应的基因芯片检测方法打下了基础。