瓜类细菌性果斑病是发生在葫芦科植物上的一种病害，其病原为噬酸菌属西瓜种(Acidovorax citrulli)，自报道以来已给美国、澳大利亚、巴西、中国等众多国家的瓜类作物种植业造成了严重的损失。要从根本上防治瓜类细菌性果斑病，我们应弄清其致病机制。本实验对西瓜噬酸菌(A.citrulli)中部分Ⅳ型菌毛(pili)相关基因构建插入突变体，用浸种测定法筛选出两株致病力和发病率明显减弱的突变体，鉴定为pilO及pilQ基因突变体，并对这两株突变体的相关表型进行测定。在透射电子显微镜下观测发现，野生型及pilO基因突变体仍然能够形成Ⅳ型菌毛，而pilQ基因突变体丧失形成Ⅳ型菌毛的能力；光学显微镜下观测野生型、突变体及互补菌株的颤动能力发现，pilO及pilQ基因突变体与野生型相比，完全丧失颤动能力；同时pilO及pilQ基因突变体游动能力、生物膜形成能力也明显减弱。互补菌株中，颤动能力得到恢复，致病力、游动能力以及生物膜形成能力部分恢复。在MMX基本培养基中测定野生型与突变体的生长曲线发现，突变体菌株生长能力无明显改变；同时突变体也能激发非寄主植物烟草(Nicotiana tabacum)的过敏性反应。pilO基因突变体仍然能够形成Ⅳ型菌毛但丧失部分Ⅳ型菌毛介导的功能，由此表明，pilO基因并不直接参与西瓜噬酸菌Ⅳ型菌毛的合成，而是Ⅳ型菌毛的功能基因；pilQ基因突变体不能形成Ⅳ型菌毛且丧失其介导的部分功能表明，pilQ基因在西瓜噬酸菌中直接参与Ⅳ型菌毛的合成，是Ⅳ型菌毛的合成及功能基因。同时也进一步证明西瓜噬酸菌Ⅳ型菌毛与其颤动性、致病性、游动性及生物膜形成能力相关。

梨火疫病菌(Erwinia amylovora)是一种具有毁灭性的植物病原细菌，能够侵染梨、苹果和其他蔷薇科植物引起火疫病，造成严重的经济损失。luxR家族调控因子具有重要的生理生化作用，是细菌群体感应机制中研究较多的一类重要的转录调节基因。本研究采用PCR技术从梨火疫病菌中扩增出一个luxR同源基因，命名为EaluxR，应用同源重组的方法构建了突变株(EaΔluxR)，并对其功能进行初步研究。实验结果表明，EaΔluxR与野生型菌株相比产生的多烯大环内酯类代谢产物在抗氧化压力和生长情况方面有明显差异，对梨幼苗及幼果的致病能力下降；但是EaΔluxR仍能引起烟草过敏性反应，并且在抗生素耐受水平和生物膜的生成方面与野生型菌株相比没有明显差异。研究表明，梨火疫病菌对病菌的生长、次级代谢产物、抗氧化压力以及致病性方面具有关键作用，为深入认识梨火疫的群体感应系统提供了科学依据。

菊科(Asteraceae)植物在进化中产生了丰富的分枝类型，而分枝类型的多样性源于分枝相关基因的多样性。BRC1(BRANCHED1)基因作为TCP家族的成员，已被验证具有抑制侧枝伸长的功能，且该家族的基因具有较快的进化速度。本文研究了BRC1-like基因的进化模式，该基因在进化中多次复制，且不同成员受到不同的选择压，这些可能是该家族成员众多及功能多样性的基础。本研究以菊科16个种为材料，克隆得到21个BRC1-like基因的片段，均包含保守的TCP结构域，R结构域，以及ECE模体，属于TCP家族中的CYCLOIDEA1 (CYC1)亚簇。结合NCBI中得到的非洲菊(Gerbera hybrid)和向日葵(Helianthus annuus)的BRC1-like基因序列，构建系统发育树，结果表明，CYC1亚簇在菊科中又分为两组，分别命名为BRC1a和BRC1b，表明此亚簇在形成后又进行了复制。利用最大似然分枝检验的方法，对其进化选择压进行检验，结果表明，BRC1b受到了强烈的纯化选择，而BRC1a受到的选择压减小。进一步运用最大似然分枝-位点检验的方法，证明BRC1a受到中性选择，而未受正选择。利用最大似然位点检验的方法，检测了BRC1-like基因片段受到纯化选择和中性选择的位点，结果表明纯化选择的位点主要集中在TCP和R结构域，以及ECE模体，证明两组基因的主要结构域在进化中被固定。菊科植物中BRC1-like基因片段的进化表明，该基因首先通过复制成为两组，而这两组受到了不同的选择压，可能会导致产生不同的功能。

液泡加工酶(VPE)基因是植物内启动和执行细胞程序性死亡的关键基因，β型 VPE 是种子特异表达并且为种子蛋白成熟所必须的基因。本研究以黑比诺葡萄(Vitis vinifera cv. Pinot Noir)花后8个不同时期胚珠的cDNA混合样为模板，通过RT-PCR扩增得到葡萄β型液泡加工酶基因(暂命名VvβVPE , GenBank登录号: KC136352)，开放阅读框1 485 bp。进一步将VvβVPE克隆到pGEX-6P-1 原核表达载体并转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中，经 IPTG 诱导，获得约 81.3 kD的包涵体融合蛋白GST-VvβVPE。将诱导条件优化后，在 37℃、0.05 mmol/L IPTG诱导 5 h 后融合蛋白 GST-VvβVPE的表达量最大，采用电透析与盐酸胍处理后透析复性两种方法获得纯化包涵体蛋白，电透析纯化法获得纯化包涵体蛋白的浓度可达到免疫要求。使用纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗血清，经Western blot 检测， 该抗血清(稀释到1∶10 000)与GST-VvβVPE融合蛋白识别反应良好，获得的抗血清可用于以后的VvβVPE的酶活性分析、免疫亚细胞定位分析以及转基因植株蛋白水平的鉴定等，为进一步明确VvβVPE在葡萄胚珠发育中的作用提供基础数据。

为了获得与小麦(Triticum aestivum L.)抗叶锈基因Lr45更多的分子标记，建立更丰富的遗传连锁图谱，本研究利用表达序列标签-酶切扩增多态性(EST-CAPS)标记技术，选择小麦2A染色体短臂的26对 EST引物与4种限制性内切酶共104对组合，对小麦抗叶锈近等基因系(near-isogenic line, NILs)TcLr45和感病对照Thatcher进行了多态性分析。EST引物BE426158与BE442876的PCR产物在亲本间存在差异，多态性检出率为7.7%；104个引物/酶切组合中，CD454036/MspⅠ、CD454036/HaeⅢ、BE406923/MspⅠ和BE425962/RsaⅠ共4组在Thatcher和TcLr45之间呈现多态性，多态性检出率为3.8%。将BE426158标记成功转化为一个更稳定的序列标签位点 (sequence tagged site, STS)标记，命名为LR45-1，经在TcLr45×Thatcher F2群体、抗叶锈近等基因系及黑麦品种中验证，LR45-1与Lr45连锁，遗传距离为8.2 cM。研究结果提示，EST-CAPS技术可应用于小麦抗叶锈病基因的多态性分析及分子标记的开发。

本研究旨在分析microRNA(miR)-27b在安徽白山羊 (Capra hircus)和波尔山羊生长发育过程中的表达变化，以了解其在山羊肌肉发育中的重要作用。选用安徽白山羊和波尔山羊不同发育时期(初生，6月龄和12月龄3个时期)背最长肌为材料，利用Real-time quantitative PCR (qRT-PCR)方法检测miR-27b的表达变化。同时，分析了miR-27b在6月龄山羊各组织中(心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、腿肌和胸肌)的表达。并用MEGA3.1分析miR-27b在不同物种中的保守性。结果显示，miR-27b在安徽白山羊和波尔山羊骨骼肌发育过程中差异表达，呈现不同的表达模式。安徽白山羊12月龄背最长肌miR-27b表达最高，初生时最低。在山羊不同组织中，骨骼肌和心脏中miR-27b表达量较高，肝脏和肾脏中miR-27表达处于中度水平，而在另外4种组织中表达量较低。实验结果表明，miR-27b可能参与山羊肌细胞增殖和分化，从而影响山羊骨骼肌生长发育，与山羊肌肉的生长类型有关。同时序列分析显示，miR-27b在10个物种中具有较高的保守性。山羊miR-27b的表达具有的组织和时序差异性实验结果为进一步研究miR-27b的功能提供基础资料。

睡美人(sleeping beauty, SB)是Tc1/mariner 转座子超家族的一员，为探索睡美人转座子与不同的转座酶搭配使用及与同种转座酶不同比例搭配使用时的转座效率，本实验构建了SB真核表达重组载体PT2-SV40-EGFP，通过荧光显微镜和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测进行了猪胎儿成纤维细胞系(PEFs) 转染条件优化研究。研究结果表明，不同转座酶与转座子按10∶1混合后细胞转染效率相似，但报告基因表达水平有较大差异，其中SB100X转座酶与转座子混合后细胞的表达水平最高；转座子PT2-SV40-EGFP质粒和SB100X转座酶质粒按不同比例混合转染细胞研究表明，细胞转染效率相似，但表达水平存在显著差异，其中1∶1组最高，约是5∶1组和10∶1组的50倍。本实验优化了睡美人转座子的转座条件为制备转基因动物深入研究提供参考。

体外培养的奶牛，绵羊和小鼠的附植前胚胎在热应激条件下能够合成热休克蛋白70以增强胚胎的耐热性保护其不受热损伤。而钙调蛋白(CaM)是细胞内最重要的Ca2+受体蛋白并参与细胞活动中重要基因的转录活动。本实验旨在研究CaM参与小鼠(Mus musculus)胚胎热应激诱导型热休克蛋白70(HSP70)的表达，且明确CaM参与HSP70表达的具体途径。将发育至早期囊胚的胚胎分成空白对照(37℃)组、W7处理非热应激(37℃+W7)组、热应激(39℃)组和W7处理热应激(39℃+W7)组。提取总RNA并分别检测HSP70、CaM和热休克转录因子1(HSF1) mRNA表达；提取胞浆蛋白用Western blot技术检测HSP70、CaM和HSF1表达；用免疫共沉淀法检测 HSP70-CaM和 HSP70-HSF1 复合物。结果发现，W7能显著抑制39℃热应激1 h小鼠胚胎HSP70 mRNA和蛋白的表达(P<0.05)；W7对其他各组胚胎HSF1 mRNA表达的影响不显著(P>0.05)，但能显著降低39℃热应激1 h小鼠胚胎HSF1蛋白表达(P<0.05)；39℃热应激时，胚胎HSP70-CaM复合物增多，HSP70-HSF1复合物减少。本研究表明，小鼠胚胎受热应激时，CaM通过与HSP70竞争性结合，解离出HSF1，从而使HSP70大量表达。本研究揭示了CaM参与小鼠胚胎热激反应中HSP70表达的一种途径。可为研究胚胎耐热性以及热激信号转导提供基础资料。

过氧化物还原酶(Peroxiredoxins, Prx)属抗氧化蛋白超家族，其催化活性依赖于半胱氨酸的存在。在该家族成员中，2-cysteine型过氧化物还原酶(2-Cys Prx)在抵抗外源性ROS保护植物线虫表皮免受氧化性损害以及线虫生长发育方面具有重要作用。为了解低剂量杀线虫剂对2-Cys Prx基因表达的影响，本研究采用RT-PCR 和RACE 技术克隆了马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)2-Cys Prx基因，并利用Real-time PCR检测了马铃薯腐烂茎线虫经低剂量(10、1、0.1、0.01、0.001和0.0001 μg/mL)杀线虫剂甲氨基阿维菌素苯甲酸盐和涕灭威处理24 h后，2-Cys Prx基因表达量的变化。结果表明，该基因cDNA全长为784 bp，编码196个氨基酸，命名为Dd-Prx-1(GenBank 登录号:JQ609353)。同源性分析结果表明，Dd-Prx-1与其他线虫的2-Cys Prx 具有较高的同源性。Dd-Prx-1的基因组由6个外显子和5个内含子组成。蛋白质预测N端没有明显的信号肽，但有一个含有23个亲水氨基酸的跨膜结构域。qRT-PCR 分析结果表明，经低剂量甲氨基阿维菌素苯甲酸盐和涕灭威处理后，马铃薯腐烂茎线虫Dd-Prx-1基因的表达量与对照相比较无显著性差异(P<0.05)。结果为深入研究植物线虫应对低剂量杀线虫剂的机制提供了基础资料。

为了了解盐碱池塘养殖鲤肠道细菌群落组成及多样性，提取鲤(Cyprinus carpio L.)肠道细菌基因组DNA，选用细菌通用引物对16S rRNA基因进行了PCR扩增，构建了细菌16S rRNA基因克隆文库。通过对阳性克隆子进行限制性片段长度多态性分析(RFLP)，选出有代表性的克隆子进行测序、BLAST比对分析和构建系统发育树。本研究从16S rRNA基因文库中共筛选出176个阳性克隆，经RFLP分析得到28个不同分类操作单元(operational taxonomic unite, OTU)(GenBank登录号: JX262557~JX262584)，文库覆盖度为88.6%。16S rRNA序列系统发育分析发现，盐碱塘养殖鲤肠道细菌归属于变形细菌门(Proteobacteria)(包含Alpha和Gamma亚群)、厚壁细菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和梭杆菌门(Fusobacteria)4个门，分别占克隆总数的89.9%、7.9%、1.1%和1.1%。其中，变形细菌门的α-变形菌纲(占克隆总数的88.1%)为优势类群，气单胞菌属为优势菌属。本研究揭示了盐碱池塘养殖条件下健康鲤肠道细菌群落组成。

海洋微生物是几丁质酶的重要来源。本研究从青岛海域海蜇(Rhopilema esculenta)体中分离到一株产几丁质酶的细菌QDC01，通过形态、培养特征以及16S rDNA序列同源性分析，将该菌株鉴定为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)。根据已报道的嗜水气单胞菌几丁质酶基因相关序列设计引物，克隆了QDC01几丁质酶基因，命名为ahchi(GenBank: JX863407)。应用生物信息学软件对获得的基因序列及编码的蛋白序列进行分析，结果显示，ahchi开放阅读框(ORF)长2 100 bp，无内含子，其编码的蛋白由699个氨基酸组成，分子量为74.875 kD，等电点为5.81。序列比对和同源性分析结果表明，该基因与嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila subsp. hydrophila)ATCC 7966T几丁质酶基因(GenBank登录号: CP000462)的相似性最高，为98%；相应的氨基酸序列同源性为98%。系统进化分析以及Ahchi的保守结构域分析表明，Ahchi属于Ⅰ型几丁质酶，糖苷水解酶19家族。采用限制性内切酶(BamHⅠ和HindⅢ)双酶切法构建了原核表达载体pET-30a(+)-ahchi，并经IPTG诱导在大肠杆菌(Escherichia coli)中成功表达。在基础产酶发酵条件下，菌株QDC01所产粗酶液酶活力达0.21 U/mL，采用文献报道的优化产酶发酵条件，菌株QDC01所产粗酶液酶活力可达0.58 U/mL， 是前人报道的产几丁质酶嗜水气单胞菌SWCH-6所产酶活力的1.49倍，同时也高于已报道的气单胞菌(Aeromonas sp.)CJ-5的酶活力(0.41 U/mL)，为微生物源几丁质酶开发应用提供了又一优良种质资源。

雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook. f.)是一种多年生的木质藤本植物，生长周期长，次生代谢产物含量低，野生自然资源已经无法满足对其药用与农用的需求。为解决自然资源的短缺并保护雷公藤植物野生资源的生态环境，通过细胞工程技术生产雷公藤药用与农用活性物质是解决自然资源短缺，保护生态环境的途径之一。本研究中的雷公藤愈伤组织诱导自扦插一年生雷公藤叶片，将获得的愈伤组织建立细胞悬浮体系，诱导悬浮细胞得到生长稳定的胚状体培养体系。研究结果显示，添加60 mL/L椰汁的1/2 MS液体培养基可诱导愈伤组织形成浅绿色的胚状体，分离后的胚状体在1/2 MS添加0.5 mg/L a-萘乙酸(NAA)的液体培养基中可继续增殖分化。通过对接种量、培养基、装液量和pH值等培养条件的筛选和优化，在1/2MS培养基添加1.0 mg/L NAA和30 g/L蔗糖，胚状体接种量为1.5 g/100 mL，pH值调至5.8，250 mL三角瓶中装液量为120 mL时最适合胚状体的培养生长；添加内生真菌诱导子，以生物量为指标，在1/2MS+0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+Y1(叶的内生菌)，pH 5.8时雷公藤甲素在胚状体中的含量是叶中的1.07倍，是自然根皮粉中的1.44倍；在1/2MS+0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+G4(根的内生菌)，pH 5.8时胚状体中总生物碱量17.02倍于叶中总生物碱量，1.46倍于自然根皮粉中总生物碱量。对3龄小菜蛾(Plutella xylostella)的毒杀试验表明，胚状体提取物与根皮粉提取物相似，100 mg处理浓度下，72 h时死亡率均在90%以上。通过雷公藤叶愈伤组织诱导的雷公藤胚状体培养体系，其次生代谢物(雷公藤甲素与雷公藤总生物碱)含量与野生雷公藤叶和根皮中的相当，胚状体提取物的杀虫活性与雷公藤根皮粉的杀虫活性无明显差异，说明雷公藤胚状体可作为解决雷公藤植物资源短缺的一条途径，为进一步研究和利用雷公藤这一植物资源提供基础资料。

寻找控制草莓果实硬度、成熟软化和褐化等性状相关基因并进行有效的调控具有现实意义，本研究分别以丰香草莓(Fragaria×ananassa Duch. cv.Toyonoka)果实大绿果期和转色期两个发育阶段的cDNA为实验组(tester)和驱动组(driver)，利用抑制差减杂交(suppression subtraction hybridization, SSH)技术构建了正反两个cDNA文库，分别包含516和524个克隆。通过EST测序、序列拼接后，共获得707条uniESTs，其中正反向文库分别为369和338个非冗余序列(uniESTs)，包括123条拼接序列(contigs)和584条单一序列(singletons)。在Nt库比对中有537条uinESTs与已知基因匹配，占比75.95%；在Nr库比对中有509条序列有匹配蛋白，占比71.99%。有193个uniESTs能进行Geney ontology(GO)功能注释，其中细胞组分被注释了315次、分子功能被注释了332次、生物过程被注释了409次。uniESTs的功能分析显示，绿果期文库多数与细胞营养生长、分裂、早期胚胎发育和营养运输有关，转色期文库主要与刺激代谢物形成、色素合成、果实软化和种子成熟有关，与草莓果实发育和成熟生理过程基本一致。采用qRT-PCR对果实成熟相关蛋白(putative ripening-related protein)、多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase，PG)、MYB转录因子(MYB transcription factor，MYB)、类异黄酮还原酶(isoflavone reductase-like gene，IRL)、胚胎发育晚期丰富蛋白(later embryo abundant protein，LEA)、乙烯受体Etr1(ethylene receptor Etr1)等6个基因在草莓果实发育、成熟期在根、叶、花中的表达模式进行了分析，研究结果为进一步研究草莓果实发育和成熟机制提供基础资料。

现有的动物疫病诊断技术多是针对单一病原进行的，而动物疫病的流行却出现了多种病毒混合感染，现有诊断技术不能很好地满足国境口岸快速、高通量检疫的需求，动物疫病多重检测新技术的研究近来已经成为动物疫情监测、疫病控制领域关注的焦点。本研究利用多重连接探针扩增(MLPA)技术特异、敏感、高通量等技术优势，以猪流感病毒(SIV)、伪狂犬病病毒(PRV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪传染性胃肠炎(TGEV)和猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)为研究对象，分别设计了这5种病毒的MLPA探针，将这5种探针混合，建立了可以同时检测这5种病毒的MLPA扩增方法。方法特异性试验表明，针对每种病毒的探针都只能扩增出其对应的病毒模板，其余病毒模板的扩增都是阴性结果；而且，5种探针混合物都只能从单个目的病毒中扩增出单一的特异性条带，而猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的扩增均为阴性。敏感性试验结果表明，5重MLPA扩增的最低检测限可以达到单个病毒核酸3000~6000个拷贝。本研究建立的5种病毒MLPA检测方法在国内外首次实现一次采样，一次分析，检测5种猪病的目的，该技术特异性强，敏感性高，加之其多重性检测优势，有望成为未来疫病检测的新方向。

节粮蛋鸡农大3号是中国农业大学动物科技学院育成的小型蛋鸡配套系，1998年通过农业部组织的专家鉴定并获得农业进步二等奖，1999年获得国家科技进步二等奖，2004年通过国家品种审定。农大3号蛋鸡以其优秀的生产性能及经济效益得到社会的广泛好评。本文介绍了农大3号蛋鸡的选育过程、品种特点和推广应用，并借农大3号蛋鸡育成的经验讨论了中国目前畜禽育种的现状及存在问题。