荫蔽胁迫是作物常面临的非生物胁迫。水稻(Oryza sativa)是喜光作物,为明确耐阴性不同的品种应答荫蔽胁迫的特征与生理机制,本研究以耐阴的恢复系'明恢63'和不耐阴的优质常规稻'福香占'为材料,在苗期和抽穗至成熟期分别进行荫蔽胁迫处理,比较荫蔽胁迫处理和正常光照植株在光合作用性状、生物量、产量性状及光合作用和光反应途径相关基因表达的差异。苗期荫蔽胁迫后,2个品种的光合速率、叶绿素相对含量(soil and plant analyzer development, SPAD)值、可溶性糖含量、根冠比和生物量均下降,'福香占'光合速率、SPAD值、可溶性糖含量降幅高于'明恢63',但生物量降幅低于'明恢63'。抽穗至成熟期荫蔽胁迫后,'明恢63'和'福香占'生育期分别延长3 d和4 d。2个品种叶绿素A和类胡萝卜素含量均增加,光合速率均下降,不育花粉粒均增多。15个光合作用和光反应相关基因至少在1个品种中发生差异表达,但2个品种间变化趋势不同。'明恢63'生物量下降22.37%,千粒重下降5.94%,结实率降低10.69%,产量降低15.45%;'福香占'生物量增加19.75%,穗粒数下降18.04%,结实率下降14.80%,产量降低26.68%。'明恢63'荫蔽胁迫后产量降幅低于'福香占'。本研究明确了'明恢63'和'福香占'对荫蔽胁迫的响应,有助于水稻耐阴机制的研究和耐阴水稻种质创新及品种选育。

小麦(Triticum aestivum)加工品质的遗传改良是育种工作的重要目标,而高分子量谷蛋白亚基(high molecular weight glutenin subunits, HMW-GS)组成和1BL/1RS易位系是影响小麦加工品质的2个重要遗传因素。本研究采用SDS-PAGE和酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳(A-PAGE)技术,对2023年参加河南省小麦品种区域试验的151个新品种(系)的HMW-GS组成及1BL/1RS易位系遗传背景进行了系统鉴定。结果表明,供试品种(系)共检测出12种HMW-GS亚基类型, Glu-A1位点有3种变异,Glu-B1位点有5种变异,Glu-D1位点有4种变异,优质亚基5+10的频率较低,仅占19.21%。检测出22种HMW-GS亚基组合形式,品质平均得分6.83分,分布频率最高的亚基组合是1/7+9/2+12 (27.81%),而优质亚基组合1/7+8/5+10仅占8.61%;62个小麦品种(系)被鉴定为1BL/1RS易位系,占供试材料的41.06%;鉴定出14个HMW-GS评分为10且非1BL/1RS易位系的小麦品种(系),具有潜在的强筋小麦育种价值。因此,含有优质HMW-GS组合的新品种(系)占比不高,平均亚基评分较低,但1BL/1RS易位系分布频率已经降低。本研究为河南省小麦育种工作者提供重要的遗传背景信息,筛选出的携带优质亚基组合的非1BL/1RS易位系品系可作为高产优质小麦品种的重要资源,对提升小麦加工品质具有重要指导价值。

COBL (COBRA-like)基因家族是参与细胞壁扩增调控的重要基因家族,为探究花生(Arachis) COBL基因功能,本研究对栽培花生(Arachis hypogaea)和二倍体花生Arachis duranensis和Arachis ipaensis COBL基因家族进行挖掘和鉴定,分析其理化性质、保守结构、系统进化树及组织表达模式。结果发现,栽培花生及Arachis duranensis和Arachis ipaensis共有51个COBL基因家族成员,花生COBL基因家族成员与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、大豆(Glycine max)同样分为2个亚族,每个亚族均包含与拟南芥、大豆同源的基因,且同源基因具有非常高的序列一致性,说明COBL家族基因在功能上高度保守。COBL家族参与花生不同生长阶段的生长发育,表明COBL基因普遍参与组织发育,在盐及干旱胁迫条件下,部分基因在根中高度表达,说明其在遭受逆境胁迫时,相关基因在根中的表达使植物感知压力信号而做出应答反应。本研究为花生COBL基因的功能研究提供了参考。

植物谷氨酸半胱氨酸连接酶(glutamate cysteine ligase, GCS)是谷胱甘肽(glutathione, GSH)生物合成途径中的关键酶,在植物响应镉等非生物胁迫中发挥重要作用。为探究甘蓝型油菜(Brassica napus) GCS基因在镉胁迫应答中的功能,本研究以镉高积累油菜品种'南油868'为材料,通过RT-PCR克隆获得GCS基因的完整编码区序列,命名为BnaGCS (GenBank No. PV694275)。序列分析表明,BnaGCS的ORF长1 536 bp,编码511个氨基酸。成功构建pBWA(V) HS-BnaGCS-1209-osgfp过表达载体,并通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法转化本氏烟草(Nicotiana benthamiana)。对经分子鉴定的转基因烟草植株进行镉胁迫处理,分析其基因表达,并测定镉含量与谷胱甘肽含量。qRT-PCR结果显示,镉胁迫下,转基因烟草根和地上部的BnaGCS转录水平显著上调(P<0.05),且根中的上调幅度高于地上部。镉和谷胱甘肽含量测定结果显示,镉胁迫显著提高了野生型(WT)和转基因烟草根和地上部的镉含量(P<0.05),转基因烟草根中的镉含量显著低于WT,而地上部镉含量显高于WT (P<0.05);镉胁迫下,WT与转基因烟草的谷胱甘肽含量均显著增加,转基因烟草中的谷胱甘肽含量显著低于WT (P<0.05)。结果表明,BnaGCS可能参与了烟草对镉胁迫的响应过程。本研究为解析BnaGCS基因功能及GSH生物合成机制提供了理论依据。

啶磺草胺(pyroxsulam)作为乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase, ALS)抑制剂,可用于防治青稞(Hordeum vulgare var. nudum)田间杂草。为探索HvnALS基因在青稞抗啶磺草胺中的作用,本研究以抗啶磺草胺的青稞品种'青0306' (R)和敏感品种'青0160' (S)为材料,参照转录组序列设计引物,克隆HvnALS基因,并进行相应的生物信息学分析,通过qPCR技术,系统分析不同抗性青稞品种在啶磺草胺处理下HvnALS基因表达量。结果显示,HvnALS基因(Genbank No. KAE8811959.1)全长1 941 bp,编码646个氨基酸,对比已发现的ALS氨基酸序列,HvnALS未发生氨基酸突变。蛋白质多序列比对及进化树分析表明,HvnALS蛋白具有PLN02470结构域,与大麦(Hordeum vulgare) HvALS亲缘关系最近。ALS活性测定结果显示,抗性品种'青0306' (R) ALS相对活性在啶磺草胺处理后1~4 d较对照极显著上升。qPCR分析表明,HvnALS在啶磺草胺胁迫后迅速表达,施药后1 d在抗病材料'青0306' (R)中的表达极显著高于敏感品种(P<0.01),推测'青0306' (R)对啶磺草胺产生高水平抗性可能与靶标酶过量表达有关,与靶标酶基因位点突变无关,这可能是导致青稞对啶磺草胺产生抗性的主要原因。本研究为青稞耐啶磺草胺品种的遗传改良提供了理论参考。

呼吸爆发氧化酶(respiratory burst oxidase homolog, RBOH)基因家族在植物生长发育及逆境响应中具有重要作用,但其在蓝莓(Vaccinium spp.)中的成员特征及功能尚不明确。本研究旨在对蓝莓基因组中RBOH基因家族成员进行鉴定和表达模式分析,为揭示蓝莓抗逆机制及分子育种提供参考。基于蓝莓全基因组数据,通过生物信息学方法,鉴定RBOH家族成员,对各成员编码蛋白理化性质、基因结构、进化关系、启动子顺式作用元件以及表达模式等进行分析。结果表明,在蓝莓中共鉴定到16个VcRBOH基因,均含有保守的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH)氧化酶结构域,分布在13条不同的染色体上,进化树分析可将16个VcRBOH基因分为3个亚族;基因家族成员共线性分析结果表明,VcRBOH基因与拟南芥(Arabidopsis thaliana)存在密切亲缘关系,且有18对共线性关系;启动子作用元件分析发现,VcRBOH家族基因启动子上含有丰富的激素响应、胁迫响应和生长发育相关响应等元件;转录组数据和荧光定量PCR分析结果表明,VcRBOHs在不同蓝莓品种中的组织表达模式有一定差异,其中VcRBOHA、VcRBOHB、VcRBOHC、VcRBOHD、VcRBOHJ、VcRBOHK和VcRBOHL基因在蓝莓各个器官中都有表达,并且受炭疽病菌(Colletotrichum spp.)和灰霉病菌(Botrytis cinerea)等胁迫的诱导。本研究为后续基因抗病功能解析及蓝莓抗性品种选育提供理论依据。

高原低氧环境会对脑组织造成不可逆损伤。本研究通过比较和分析CD146 (cluster of differentiation 146)与低氧诱导因子1α (hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、自噬相关蛋白 (Beclin-1)及半胱天冬氨酸特异性蛋白酶3 (cysteine aspartate specific protease 3, Caspase-3)等多种低氧相关因子在牦牛(Bos grunniens)和黄牛(Bos taurus)脑组织不同部位的差异性表达,探索其与牦牛脑低氧适应性的相关性。采集成年牦牛与黄牛脑组织(大脑, 小脑, 四叠体和延髓),进行H&E、PAS、Nissl和Masson等特殊染色,并进行免疫组织化学分析。基于H&E以及特殊染色结果测量锥体细胞占比、浦肯野细胞面积、糖原积累分布、神经元活性强弱和神经纤维含量等各项数据。结果显示,牦牛和黄牛的脑组织差异主要集中于小脑和延髓部位,且小脑各项数据均显著高于延髓(P<0.05);对比物种间差异,PAS染色的平均光密度值 (average optical density, AOD)和Nissl染色的阳性率在牦牛脑组织均显著高于黄牛(P<0.05),Masson染色在牦牛大脑和小脑的神经纤维含量占比显著高于黄牛(P<0.05),而延髓和四叠体的神经纤维含量占比显著低于黄牛(P<0.05)。免疫组织化学结果显示,各低氧相关因子在脑的差异表达主要在小脑和延髓,从不同器官表达差异比较,CD146与低氧相关因子在牦牛小脑表达显著高于延髓(P<0.05),而在黄牛小脑表达低于延髓。对比物种差异分析,CD146、HIF-1α和VEGF在牦牛小脑表达高于黄牛,Beclin-1趋势相反;CD146与各低氧相关因子在牦牛延髓表达均显著低于黄牛(P<0.05)。结合CD146及低氧相关因子的生物功能,推测其可能在牦牛脑适应低氧环境中发挥作用。本研究为后续探究牦牛脑组织的低氧适应特异性,以及CD146与低氧相关因子的低氧调控机制提供基础资料。

前列腺素F2α (prostaglandin F2α, PGF2α)在黄体溶解过程中具有关键作用,能够通过其受体介导黄体细胞的凋亡。然而,PGF2α对早期的黄体细胞并没有促凋亡的作用。铁死亡是近年来发现的由脂质过氧化驱动且依赖铁离子的程序性细胞死亡方式,但其在PGF2α介导的不同阶段黄体细胞凋亡中的作用仍不清楚。为了探究PGF2α对绵羊(Ovis aries)不同时期黄体组织铁含量、铁死亡及相关自噬基因表达的影响,探讨PGF2α引起早期黄体反应钝化、溶解中期和后期黄体的机制,本研究选取48只健康、体况良好且体重相近经同期发情处理的母羊,随机平均分为6组,分别为黄体早期实验组与对照组、黄体中期实验组与对照组、黄体后期实验组与对照组,实验组分别于发情周期第5天(黄体早期)、第9天(黄体中期)和第13天(黄体后期)注射1.5 mL PGF2α (0.15 mg),对照组则在同一时间点注射等量的生理盐水,每次注射后3 h采集黄体组织,用于铁含量、铁死亡及自噬相关基因表达检测。结果表明,PGF2α可显著提高整个黄体期的铁含量(P<0.05)。在黄体早期,PGF2α显著上调抗铁死亡相关基因SLC7A11、NRF2、FTH1和促铁死亡基因ACSL4以及铁死亡相关蛋白Ferritin、GPX4、SLC7A11、LC3B、NCOA4的表达;显著下调抗铁死亡相关基因GPX4和伴侣蛋白介导自噬相关基因HSPA8的表达(P<0.05)。在黄体中期,PGF2α显著上调抗铁死亡相关基因SLC7A11和促铁死亡基因ACSL4的表达,显著上调铁蛋白自噬相关基因ATG5、脂噬相关基因TPD52,分子伴侣介导自噬相关基因HSPA5、HSPA8以及SLC7A11、LC3B蛋白的表达水平,显著下调促铁死亡相关基因NRF2的表达(P<0.05),对GPX4、Ferritin、NCOA4蛋白表达水平无显著影响。在黄体后期,PGF2α显著上调了P53、ACSL4、GPX4、ATG5、HSPA5、HSPA8基因和GPX4、SLC7A11、LC3B蛋白的表达水平,显著下调了NRF2和FTH1基因和Ferritin蛋白的表达水平(P<0.05),对NCOA4基因表达水平无显著影响。绵羊不同黄体期注射PGF2α后,其作用呈现显著的时序性差异,黄体早期：PGF2α上调SLC7A11、NRF2和FTH1,增强抗氧化防御,抑制ACSL4以隔离游离铁,抵抗铁死亡,维持黄体功能;黄体中期：PGF2α上调ACSL4形成促氧化环境,同时激活ATG5启动自噬,暂时延缓氧化损伤,但加剧脂质过氧化,为铁死亡奠定基础;黄体后期：PGF2α激活P53、抑制NRF2并进一步上调ACSL4,驱动脂质过氧化累积,铁蓄积加剧氧化应激,最终引发铁死亡,导致黄体退化。综上,PGF2α通过时序性调控铁死亡和自噬相关通路,驱动黄体从早期抗氧化防御到后期不可逆退化。本研究为黄体功能异常的干预提供了理论依据。

增强机体免疫和抗氧化能力是现代肉鸡生产亟待解决的重要问题,药用植物和益生菌具有抗炎、抗氧化及免疫调节等功能。为探讨甘草(Glycyrrhiza uralensis)提取物、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)及其联合添加对肉鸡(Gallus gallus)免疫及抗氧化功能的影响,本研究将420只1日龄雄性良凤花肉鸡随机分为4组,对照组饲喂基础饲粮,实验处理组分别饲喂基础饲粮添加0.1%甘草提取物(甘草组)、1.5%嗜酸乳杆菌(乳酸菌组)及0.1%甘草提取物和1.5%嗜酸乳杆菌(联合组)。每组7个重复,每个重复15只鸡。试验为期84 d。结果表明,与对照组相比,各处理组肉鸡血清、空肠和肝脏超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)活性显著提高(P<0.05),丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量显著降低(P<0.05)。各处理组肉鸡血清免疫球蛋白A (immunoglobulin, IgA)和IgG、空肠绒毛高度、绒毛高度/隐窝深度(villus height/crypt depth, VH/CD)值及分泌型免疫球蛋白A (secretory IgA, sIgA)含量显著提高(P<0.05)。各处理组空肠黏膜免疫相关基因黏蛋白2 (mucin 2, MUC2)、表面抗原分化簇(cluster of differentiation, CD) 4阳性T细胞CD⁴⁺和CD⁸⁺、56和84日龄时白细胞介素-4 (interleukin-4, IL-4)和IL-10及肝脏NF-E2相关因子2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)、血红素氧合酶1 (heme oxygenase-1, HO-1) mRNA表达水平显著提高(P<0.05),而诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)、IL-6、核因子κB (nuclear factor kappa-B, NF-κB)、Toll样受体4 (toll-like receptor 4, TLR4)及肝脏半胱氨酸蛋白酶-1 (cysteine protease-1, Caspase-1)、Caspase-3和NOD样蛋白受体3 (NOD-like receptor protein 3, NLRP3) mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。综上,饲粮添加甘草提取物和嗜酸乳杆菌可改善肉鸡肠道形态结构、免疫及抗氧化功能,抑制炎症反应和细胞凋亡,且二者联合添加具有协同作用。本研究为甘草提取物与嗜酸乳杆菌合生元的研发和利用提供依据。

OCA2 (oculocutaneous albinism Ⅱ)基因是黑色素合成过程中的重要基因,参与了动物眼睛、皮肤和毛发的色素沉着,其突变会造成Ⅱ型眼皮肤白化病。体表黑斑是瓯江彩鲤(Cyprinus carpio var. color)的重要表型特征,但其形成的遗传基础与机制尚不清楚。本研究以高代选育的瓯江彩鲤为材料,开展了OCA2基因的克隆和表达分析,以及启动子转录活性检测和CRISPER/Cas9基因敲除。结果发现,瓯江彩鲤的OCA2基因由23个外显子和22个内含子组成,编码834个氨基酸,与其他鲤科鱼类的同源性高达97%以上,表明该基因的结构和功能的保守性。qPCR结果显示,OCA2基因在粉花体色瓯江彩鲤眼睛和皮肤组织中的表达量显著高于粉玉体色。双荧光素酶报告结果发现,OCA2基因的启动子区域具有复杂的调控机制,其中起始密码子前600~1 200 bp片段是关键的启动子调控元件。通过CRISPR/Cas9技术对OCA2基因的外显子和启动子区域进行敲除,发现突变体的体表皮肤和眼组织的黑色素细胞数量减少达70%,同时其面积缩减达40%。本研究揭示OCA2基因在瓯江彩鲤的黑斑形成中具有重要作用。

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是一种以肝脏中产生大量脂质沉积为特征,严重危害人类健康的慢性肝脏疾病。近年来,宠物和农场动物脂肪肝病的发病率逐渐增加,这对养殖业造成了严重的经济损失。血管紧张素转化酶2 (angiotensin converting enzyme 2, ACE2)已被证明对脂肪肝等多种疾病具有抗炎、抗损伤和抗纤维化的正向调控作用。本课题组前期研究发现,ACE2可能对外源性刺激诱导的NAFLD发挥一定的抗损伤作用,但其确切的保护机制尚不明确。本研究首先通过0.025~0.200 mmol/L油酸(oleic acid, OA)诱导大鼠(Rattus norvegicus)正常肝脏间质(BRL-3A)细胞24 h,建立NAFLD细胞模型,并检测肝细胞损伤指标,明确合适的诱导条件。然后通过添加外源ACE2活性蛋白或小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)干扰处理,染色观察脂质沉积,检测总抗氧化能力(total anti-oxidative capacity, T-AOC)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase, AST)和炎性因子等变化。Western blot检测细胞ACE2、Mas受体(mas receptor, MasR)的蛋白表达;ELISA检测细胞上清液中血管紧张素Ⅱ (angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)和Ang 1-7的含量,明确ACE2对NAFLD细胞损伤的保护作用。结果显示：1)成功建立了NAFLD细胞模型,经油红染色分析,检测肝细胞甘油三酯(triglyceride, TG)含量以及活性氧(reactive oxygen species, ROS)等的变化,选定NAFLD细胞模型诱导条件为0.100 mmol/L油酸作用24 h,确定OA低、中、高(0.025, 0.100和0.200 mmol/L) 3种不同浓度进行后续实验;2)与对照组相比,高浓度OA处理组细胞ACE2蛋白表达显著下调(P<0.05),低、中浓度组ACE2表达无明显差异;添加ACE2活性蛋白处理组细胞ACE2与MasR表达水平显著升高(P<0.05),转染siRNA-ACE2后,ACE2表达水平则显著降低(P<0.05),MasR表达水平降低但差异不显著;3)中浓度OA处理,ACE2和MasR表达上调,Ang 1-7和Ang Ⅱ水平增高,脂质堆积增多,氧化应激加重,抗氧化能力减弱,炎性因子和NO含量极显著升高(P<0.01),iNOS活性极显著增强(P<0.01),抗炎因子含量极显著降低(P<0.01);4)与OA处理组相比,添加ACE2活性蛋白组细胞ACE2、MasR和Ang 1-7水平显著或极显著上调(P<0.05或P<0.01),Ang Ⅱ水平下调。细胞内相对脂滴面积和TG含量显著减少(P<0.05),同时,ALT、AST活力和T-AOC均有不同程度的增强,氧化应激与炎性反应减轻。转染siRNA-ACE2处理后逆转了以上变化。研究结果提示,在NAFLD细胞模型中,使用ACE2活性蛋白处理能缓解细胞脂质沉积,减轻细胞氧化应激和炎性反应,对OA诱导的大鼠肝细胞NAFLD有一定缓解作用,其机制主要是通过降解Ang Ⅱ激活Ang 1-7/Mas,并通过作用于NO/iNOS信号通路实现的。本研究从细胞水平揭示了ACE2缓解NAFLD的机制,为将ACE2发展为治疗NAFLD的潜在新靶点提供了重要的理论依据。

半夏(Pinellia ternata)的连作障碍已成为制约半夏产量与品质的重要因素。为明确多年连作半夏土壤中的病原真菌种类,本研究从连作7年的半夏土壤中分离纯化真菌,采用离体接种法进行筛选鉴定,评估其致病力。为明确半夏根腐病的发生规律,对产生致病力的病原真菌开展生物学特性探究,比较其在不同温度、光照、pH、碳源和氮源条件下的生长状况和真菌的致死温度。结果表明,从连作7年的半夏土壤中分离获得22株真菌,其中4株具有致病能力,分别是镰状镰刀菌(Fusarium falciforme) E、腐皮镰刀菌(F. solani) N、角化镰刀菌(F. keratoplasticum) H、尖孢镰刀菌(F. oxysporum) O。以上病原菌均可利用多种碳源,在温度25~30 ℃、pH 9~10,有光照条件下生长较快,在56~61 ℃处理下可失去生长活性。本研究为半夏连作土壤中的病原真菌的鉴定及防治提供了实验基础。

基因组编辑技术是对基因组中的目标基因进行定点、可遗传修饰的生物技术。其中,CRISPR/Cas9技术发展迅猛,具有简单、高效、多基因编辑等优点,是目前应用最广的基因组编辑技术,已广泛应用于大豆(Glycine max)、油菜(Brassica napus)、亚麻荠(Camelina sativa)、花生(Arachis hypogaea)等油料作物的遗传改良中。本文详细介绍了CRISPR/Cas基因编辑工具的种类和原理,总结了植物中脂肪酸合成代谢通路,重点概述了利用基因组编辑技术提高植物油脂产量和品质的研究进展。本文为利用基因组编辑技术在油料作物优异种质创制、新品种培育等方面提供技术支撑和指导。

对于终末期器官衰竭的患者,器官移植通常是唯一可行的治疗手段。然而,全球范围内可用于移植的器官极度缺乏。利用再生医学的方式产生器官是获得可移植器官的替代途径,主要策略包括异种器官移植、组织工程、生物打印和类器官技术等。然而,这些方法都有各自的不足与弊端,使得其在临床上的应用受到了限制。近年来,异种器官移植进行了数例临床试验,基因编辑猪的器官移植到活体病人体内后,患者并不能长时间生存。囊胚补偿技术产生的人(Homo sapiens)-动物嵌合体是获得可用于人体移植的器官的另一种潜在途径,通过基因编辑技术产生细胞谱系或器官缺失的动物胚胎以产生的“空”的微环境,并使用人类多能性干细胞(human pluripotent stem cells, hPSC)填充。尽管该方式也存在许多障碍与挑战,但科学家们正在不断优化与尝试,以期在临床上进行应用。本综述对异种嵌合的相关研究进行回顾,并对该领域存在的问题和潜在的解决策略进行探讨,以期为后续研究提供理论参考。

稻瘟病是威胁水稻(Oryza sativa)产量稳定的重要病害之一。近年,稻瘟病在中国东北地区发病率及发病程度呈增加趋势。C2H2转录因子Bsr-d1 (broad spectrum resistance digu1)功能失活能够减弱过氧化氢降解而提高水稻对稻瘟病菌的抗性;Bsr-k1 (broad-spectrum resistance Kitaake-1)编码1个TPR蛋白,其功能失活突变体bsr-k1导致OsPAL (phenylalanine ammonia-lyase)家族基因mRNA富集,木质素合成增多,进而提高免疫反应,赋予水稻广谱抗性。本研究针对上述2个广谱抗病基因Bsr-d1的第1个外显子和Bsr-k1的第3个外显子设计靶点,通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的水稻转化技术,将基因编辑载体导入受体水稻品种'TH899'中,获得Bsr-d1和Bsr-k1基因的多种不同变异类型的T₀代植株。对不含转基因成分的T₂代基因编辑材料分析发现,Bsr-d1与Bsr-k1基因的单独突变及同时突变植株均表现出稻瘟病抗性增强的特征,而且,筛选出的双基因编辑水稻材料的抗病性显著优于单基因编辑材料。此外,部分基因编辑系的单株产量和种子长宽比也发生了变化。综上,本研究发现,对Bsr-d1和Bsr-k1基因同时编辑,能够比Bsr-d1或Bsr-k1单基因编辑更显著地增强'TH899'的稻瘟病抗性,表明组合式编辑不同途径的稻瘟病抗病基因能够有效提升水稻的抗病性。本研究证明了多基因编辑方式在改良水稻抗病性方面的巨大潜力,同时也为培育抗稻瘟病粳稻(O. sativa subsp. japonica)提供了新的的材料资源。

在转基因产品的检测方法研究与标准化、定性与定量检测、标识制度执行、安全监管过程中,转基因检测标准物质是不可或缺的重要基础。转基因大豆(Glycine max) 'DBN9004'是我国自主研发的耐除草剂大豆新品系,于2020年获得转基因生物生产应用安全证书,其安全监管和检测急需研制有证标准物质。本研究以纯合转基因大豆'DBN9004'和非转基因受体大豆'Jack'的植株叶片为原材料,冷冻研磨、提取基因组DNA后,按DBN9004/Lectin拷贝数比值分别为100%和3%的比例,称量配制得到不同梯度含量的转基因大豆'DBN9004'基因组DNA标准物质DBN9004a和DBN9004c,每个浓度的标准物质各分装500管。运用微滴数字PCR方法,根据《标准物质定值的通用原则及统计学原理》(JJF 1343)对2种浓度标准物质进行标准物质均匀性评估、稳定性评估、联合定值数据的处理及不确定度评定。结果表明,2种标准物质均匀性检验的F值均小于临界值F_0.05(14,30(2.04),在单元内和单元间具有良好的均匀性;在37 ℃以下可以稳定储存和运输10 d,在-20 ℃条件下长期稳定性达到9个月、反复冻融10次;9家实验室联合测定的标准物质拷贝数浓度和比值无异常值、呈正态分布、且等精度。标准物质DBN9004a和DBN9004c 的转化体特异性序列拷贝数浓度的量值及扩展不确定度分别为(4.43±0.38)×10⁴和(6.32±0.65)×10² copies/μL,DBN9004转化体/Lectin拷贝数比值的量值及扩展不确定度分别为(98.1±9.8)%和(3.08±0.32)%。研制的转基因大豆'DBN9004'梯度含量基因组DNA标准物质均匀性良好,可稳定运输和储存,满足转基因大豆'DBN9004'定性、定量检测需求,为转基因大豆'DBN9004'的安全监管、定量标识制度的实施提供了可靠的有证标准物质。

CRISPR/Cas9基因编辑技术已成功应用于多种农作物,并可实现目的基因的定向突变以及目标性状的定向改良,然而在花生(Arachis hypogaea)中尚无成熟高效的基因编辑系统。本研究从花生品种'花育23号'中克隆出两个U6启动子AhA3U6和AhB9U6,以替换原载体pBGK041-GmU6中的GmU6启动子。选择花生AhPEPC1 (PEPC: phosphoenolpyruvate carboxylase)基因的同源基因Aradu.A52DW和Araip.RUX3H为本研究的靶向基因,分别构建了pBGK041-AhA3U6-AhPEPC1和pBGK041-AhB9U6-AhPEPC1的CRISPR-Cas9重组载体。将这3个载体分别导入发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)并诱导花生发状根,其转化效率分别为78.4%、83.5%和83.0%;测序结果显示,pBGK041-GmU6-AhPEPC1载体转基因发根的编辑效率为1.7%,pBGK041-AhA3U6-AhPEPC1和pBGK041-AhB9U6-AhPEPC1载体转基因发根编辑效率分别为4.2%和2.6%。通过花粉管通道法,将这3个载体分别导入花生,转化效率分别为30.0%、33.7%和29.2%。转基因花生籽仁的测序结果显示,pBGK041-GmU6-AhPEPC1载体转基因籽仁中未检测到基因编辑,pBGK041-AhA3U6-AhPEPC1和pBGK041-AhB9U6-AhPEPC1载体转基因籽仁编辑效率分别为2.2%和1.3%,转基因籽仁含油量为56.88%、57.49%。花生内源启动子AhA3U6和AhB9U6替换pBGK041-GmU6载体中原有启动子GmU6后,其在花生转基因发根和转基因籽仁中均检测到突变,提高了编辑效率,花生籽仁含油量提高了约4%。该体系的建立可为花生基因编辑的开展提供技术支持,为高油品种选育提供新型种质资源。

淋巴细胞活化基因3 (lymphocyte activation gene 3, LAG3)作为重要的免疫调节分子,是连接免疫抑制与神经调控的潜在枢纽分子,其功能研究对揭示应激诱导的免疫-神经失衡机制具有重要意义。本研究对牛(Bos taurus) LAG3蛋白的理化性质、结构域及修饰位点等进行预测,结合基因克隆技术从牛外周血淋巴细胞cDNA中扩增LAG3胞外区编码序列,构建pET-28a-LAG3原核表达载体并转化大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)诱导重组蛋白表达。以镍柱亲和层析纯化的包涵体形式重组蛋白(经复性)为免疫原,免疫BALB/c小鼠(Mus musculus)获得多克隆抗体。采用间接ELISA检测抗体效价,Western blot分析抗体特异性。结果显示,牛LAG3基因编码序列长1 551 bp,编码516个氨基酸,分子式为C₂₅₅₉H₃₉₇₄N₇₂₈O₇₁₂S₁₁,相对分子质量56.68 kD,属亲水、非脂溶性、不稳定碱性蛋白,含1个信号肽、1个跨膜区、48个潜在磷酸化位点、3个N-糖基化位点及19个抗原表位。原核表达的重组蛋白分子量约45 kD,纯化后浓度达1.03 mg/mL。制备的多克隆抗体可与牛外周血淋巴细胞总蛋白结合,显示出大小为45 kD的单一条带,抗体效价最高达1∶1 048 576。本研究解析了牛LAG3蛋白的结构特征,成功制备了高效价、高特异性的鼠抗牛LAG3多克隆抗体,为深入研究LAG3在牛应激应答中的表达规律、亚细胞定位及免疫调控机制提供了关键工具。

甜瓜(Cucumis melo)为一年蔓生草本植物,是山西太谷区重要的农产品之一,近年来受病毒病的影响严重。为明确甜瓜病毒病的病原,并建立快速检测技术,本研究对采自山西太谷区表现出斑点、花叶、皱缩和坏死等病状的病样,采用RT-PCR方法结合生物信息学进行综合分析。结果表明,该地区甜瓜样品被黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)、黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus, CGMMV)、瓜类蚜传黄化病毒(Cucurbit aphid-borne yellows virus, CABYV)以及西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus, WMV) 4种病毒侵染,且复合侵染现象较为普遍。对上述病毒的外壳蛋白(coat protein, CP)序列进行同源性比较和系统发育进化分析,结果表明,本研究扩增获得的CABYV分离物Fenghuang、CMV分离物Fengyun、CGMMV分离物Longquan和WMV分离物Zhouquan与GenBank数据库中已报道的同类病毒序列相似性分别达到99.5%、98.0%、99.6%和97.0%以上,各分离物与其对应的同种病毒分离物的亲缘关系较为紧密。针对本地区甜瓜病毒病复合侵染的现象,通过优化反应条件,建立了可同时检测CMV、CGMMV、CABYV和WMV的多重RT-PCR检测体系,可以对4种病毒复合侵染的材料进行多重RT-PCR扩增,分别得到1 106、690、521和400 bp共4条特异性条带。本研究建立的多重RT-PCR检测体系能够实现田间甜瓜病毒病的快速鉴别,为甜瓜病毒病害的监测与防控提供了的技术支撑。