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农业生物技术学报 2016年 24卷 11期 刊出日期:2016-09-26
研究论文与报告
高通量测序技术下连作植烟土壤细菌群落与土壤环境因子的耦合分析
Coupling Analysis Based on High Throughput Sequencing Technology of Soil Bacterial Community and Soil Environmental Factors in Continuous Cropping Tobacco Soil
王佩雯 朱金峰 陈征 许自成 武劲草 常安然
2016, 24(11): 1754-1763 | Full text
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摘要
为了揭示连作条件下植烟土壤细菌群落结构及其与土壤环境间的响应关系,本研究采用了Illumina平台Hiseq2500高通量测序技术,对不同施肥处理(常规施肥, 蚯蚓粪肥, 微生物菌肥以及蚯蚓粪和微生物菌肥混合)的漯河烟区连作植烟土壤细菌进行16S rRNA V4区测序,结合冗余分析(redundancy analysis, RDA)研究土壤细菌微生物的群落结构组成、多样性以及与土壤环境间的相关关系。结果表明,测序质控后共获得25 203个操作分类单元(operational taxonomic units, OTUs),计1 600 239条读数。分层聚类图显示,不同施肥处理的连作植烟土壤细菌群落有较大差异,但这种差异不体现在结构多样性上。多样性指数分析表明,连作植烟土壤细菌群落易受环境变化的影响,体现出一定的时间差异性;烤烟成熟期土壤丰度指数明显升高,微生物菌肥和蚯蚓粪肥处理下土壤细菌群落丰度变化较大。主成分分析表明,不同土壤环境因子间有很强的相关关系,可以将原有的11个土壤环境因子按照强正相关关系划分为4类;RDA结果表明,土壤pH既影响土壤细菌群落的多样性,又影响土壤细菌群落的丰度;而有机质主要对土壤细菌群落丰度有积极影响。研究结果为在微生物水平上研究连作植烟障碍的形成机理提供了依据。
小麦WDHN1基因的克隆、表达及功能分析
Cloning, Expression and Functional Analysis of WDHN1 Gene from Wheat (Triticum aestivum)
刘浩 杜娅 李核 王晓宇 于正阳 朱维宁 张大鹏 张林生
2016, 24(11): 1676-1687 | Full text
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摘要
YSK2型脱水素(dehydrins, DHNs)是植物中存在最多的DHNs形式,参与植物响应各种非生物逆境胁迫。为了研究YSK2型DHN的功能,从小麦(Triticum aestivum)中克隆了WDHN1基因(GenBank No. KR709259),该基因编码区序列总长491 bp,含两个外显子和一个内含子,编码133个氨基酸;存在4个保守区域,即1个Y片段、1个S片段和2个K片段,与节节麦(Aegilops tauschii) DHN (EMT30992)亲缘关系最近。通过PCR扩增得到WDHN1启动子序列,该启动子存在2个脱落酸应答元件(abscisic acid (ABA) response element, ABRE)和3个MBS(MYB binding site)生物胁迫响应元件。通过qRT-PCR分析其非生物胁迫下的表达模式,结果表明,在低温、NaCl、ABA和PEG 6000胁迫下,小麦WDHN1基因表达均表现为先上升后下降的趋势,分别于6、60、12和48 h时表达量最高。组织特异性表达分析表明,WDHN1基因在小麦开花后22 d 的胚芽中表达量最高,具有明显的组织特异性。将WDHN1基因片段连接于原核表达载体pET28a中,转化大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3),用异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG) 诱导表达,获得20 kD的WDHN1蛋白。对重组大肠杆菌 WDHN1-pET28a-BL21(DE3)及其总蛋白进行非生物胁迫,结果表明,WDHN1蛋白还可以阻止蛋白聚合引起的蛋白变性,提高非生物胁迫下大肠杆菌的耐受性及乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase, LDH)的稳定性。研究结果为进一步利用该基因进行小麦抗性改良提供了理论依据。
高精料日粮饲喂诱导泌乳奶牛发生乳脂抑制的机制
The Mechanism of High Concentrate Diet Fed Induced Milk Fat Depression in Lactating Dairy Cows (Bos taurus)
曹洋 李林 谢正露 艾阳 张源淑
2016, 24(11): 1718-1725 | Full text
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摘要
高精料饲喂导致奶牛乳脂率降低的相关机制目前还不清楚。本研究通过探究高精料饲喂对肝脏内乳脂前体代谢的影响,揭示奶牛(Bos taurus)发生乳脂抑制的相关机制,将10头泌乳期(25±5) d荷斯坦奶牛随机分为2组,分别饲喂精粗比4∶6 (对照组)和6∶4(实验组)日粮。饲喂20周后实施肝脏血管瘘手术,护理4周,进行如下实验:1)统计奶牛产奶量,每周测定乳成分;2)采集空腹进出肝脏血液,检测甘油三酯(triglyceride, TAG)和游离脂肪酸(free fatty acid, FFA)的含量;3) 活体穿刺取肝脏组织,qRT-PCR检测肝脏中脂代谢相关基因的表达。结果表明,高精料饲喂6~18周可提高产奶量,18周后乳脂率显著降低 (P<0.05)。高精料组奶牛肝脏TAG和FFA的净输出含量显著(P<0.05)或极显著降低(P<0.01);肝脏中参与脂肪酸合成代谢的固醇调节元件结合蛋白-1c基因(sterol regulating element binding protein-1 c, SREBP-1c)、乙酰辅酶A羧化酶基因(acetyl-coa carboxylase, ACC)和脂肪酸合成酶基因(fatty acid synthetase, FAS)表达显著 (P<0.05)或极显著(P<0.01)下调;参与脂肪酸分解代谢的过氧化物酶体增殖物激活受体α基因(peroxisome proliferators-activated receptor α, PPARα)和肉毒碱棕榈酰转移酶-1基因(carnitine palmitoyl transterase-1, CPT-1)表达显著上调(P<0.05)。高精料饲喂导致奶牛肝脏脂肪酸合成代谢减弱而分解代谢增强,肝脏内乳脂前体物发生重分配,乳脂前体物输出减少,影响了乳脂合成。本研究揭示了高精料饲喂导致奶牛乳脂率降低的机制,为改善奶牛乳脂率提供了理论基础。
水稻干尖线虫Hsp90基因克隆及在不同逆境、侵染早期和取食过程的表达差异
Characterization of the Hsp90 Gene in the White Tip Nematode(Aphelenchoides besseyi) and Its Expression in Response to Environmental Stresses, Early Infection and Feeding
冯辉 陈曦 束兆林 姚克兵 魏利辉
2016, 24(11): 1741-1753 | Full text
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摘要
热激蛋白90(heat shock protein 90, Hsp90)调控生物体的细胞代谢、生长发育和逆境适应等一系列生物过程。本研究通过cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)分离获得了一个水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi)Hsp90 基因,命名为Ab-hsp90。Ab-hsp90全长cDNA序列含有69 bp的5′非翻译区、编码712个氨基酸2 139 bp 的开放阅读框以及137 bp的3′非翻译区UTR。Ab-hsp90 DNA序列包含9 个外显子和8个内含子。Ab-hsp90蛋白序列与其他植物寄生线虫Hsp90s高度相似,最大似然树显示与植物寄生线虫位于同一进化分支;结构上具有5个保守的Hps90蛋白家族序列标签和特异MEEVD基系,表明Ab-hsp90为胞质型Hsp90。qRT-PCR显示,Ab-hsp90在水稻干尖线虫各个龄期均表达,在卵和成虫表达水平最高。当线虫暴露于干燥、低渗透胁迫以及短时间阿维菌素溶液中时Ab-hsp90均上调表达;Ab-hsp90还受到短时低温(4 ℃)诱导,在高温(40 ℃)环境持续高水平表达。在侵染抗感不同的水稻(Oryza sativa)植株时,Ab-hsp90的表达水平具有差异性:在线虫接种抗性水稻72 h内,Ab-hsp90一直高度表达,而在接种感病水稻上Ab-hsp90表达水平显著升高随后下降。取食灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的线虫Ab-hsp90在9 d内始终高度表达,而胡萝卜(Daucus carota)愈伤组织培养的线虫6 d内Ab-hsp90表达上调但此后逐渐下调。这些数据表明,Ab-hsp90可能参与水稻干尖线虫的抗逆适应、早期侵染以及取食行为。本研究有助于拓展植物寄生线虫Hsp90蛋白的功能,为进一步研究线虫与植物互作机制提供了有益借鉴。
基于竹屑降解的腐生真菌筛选、酶活测定与基因表达分析
Screening, Lignocellulose Enzyme Activities and Gene Expression Analysis of Saprophytic Fungi for Decomposing Bamboo Sawdust
任安静 吴林飞 李永春 谭振宇 姚泽秀 徐秋芳 时浩杰
2016, 24(11): 1664-1675 | Full text
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摘要
为筛选应用于毛竹(Phyllostachys edulis)伐桩微生物促腐的高效降解菌株,采用发酵纯培养方法并结合形态学观察和核糖体转录间隔区(nuclear ribosomal internal transcribed spacer, ITS)序列分析,发掘鉴定了3株能引起较高竹屑质量损失率的腐生真菌;并通过降解真实底物和Real-time PCR方法,测定了其降解竹屑过程中纤维素和木质素酶活性及其对应的功能基因表达变化。结果表明,3株真菌分别为绿木霉(Trichoderma virens)、棘孢木霉(Trichoderma asperellum)和总状毛霉(Mucor racemosus),降解竹屑20 d引起质量损失率分别为20.56%、17.66%和13.11%。上述菌株分泌的漆酶(laccase, Lac)活性与竹屑质量损失率呈显著正相关,分泌的内切葡聚糖酶(endoglucanase, EG)与外切葡聚糖酶(cellobiohydrolase, CBH)之间存在协同作用,且纤维素酶基因cbhⅠ表达量与对应的CBH酶活性呈显著正相关。酶活性测定和功能基因表达变化表明,3株真菌降解竹屑的能力从高到低依次为绿木霉,棘孢木霉和总状毛霉,漆酶在竹屑降解过程中发挥了重要作用。本实验从竹林土壤中筛选获得高效降解菌株并测定了其对竹屑的降解率,为应用于毛竹伐桩的微生物促腐以及竹纤维材料的生物降解提供了依据。
流感病毒血凝素茎干部通用疫苗的构建及免疫原性研究
Construction and Immunogenicity of Universal Influenza Vaccine Based on Hemagglutinin Stem Region
马礼照 刘焕 李桂梅 黄娟 单虎
2016, 24(11): 1764-1770 | Full text
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摘要
为了构建基于血凝素(hemagglutinin , HA)茎干部的流感通用疫苗并研究其免疫原性,本研究以A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)流感病毒为模板,扩增HA茎干部区域主要蛋白HA2(HA的344~566 aa)和完整茎干部HA-stem(缺失53 aa~276 aa的HA),与真核表达载体pCAGGS连接获得重组质粒。将重组质粒瞬时转染至HEK-293T细胞,利用RT-PCR及间接免疫荧光实验检测其表达情况。将6~8周龄健康雌性BALB/c小鼠(Mus musculus)分为4组,即2个重组质粒组及pCAGGS质粒对照组和磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline, PBS)对照组,分别于0和30 d免疫2次,在免疫当天(第0天)及免疫后第60天采集小鼠眼眶血,测定其HI抗体、细胞中和抗体和IFN-γ水平。结果表明,成功构建了重组质粒pCAGGS-HA2和pCAGGS-HA-stem,且重组质粒转染HEK-293T细胞后均能检测到目的蛋白及其mRNA。免疫后第60天pCAGGS-HA2和pCAGGS-HA-stem免疫组对A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)病毒的HI抗体效价均为5 log2,中和抗体效价分别为1∶27和1∶24。对异源病毒A/Chicken/Hebei/4/2008(H9N2)病毒的HI抗体效价分别为3 log2和6 log2,中和抗体效价分别为1∶24和1∶22。pCAGGS-HA2和pCAGGS-HA-stem组INF-γ含量分别为(2362.40±98.24) ng/L和(2497.06±120.44) ng/L。pCAGGS-HA2及pCAGGS-HA-stem诱导产生的抗体及INF-γ水平与免疫前及对照组相比差异显著(P<0.05)。结果表明,pCAGGS-HA2和pCAGGS-HA-stem能够诱导对异源病毒的交叉反应,有望作为候选的流感通用疫苗。
山麻鸭不同部位肠道形态和肠道微生物区系特点及受日粮鱼油的影响
Morphology and Microbiota of Different Section of Intestines and Their Influences Induced by Dietary Fish Oil in Shan Partridge Ducks (Anas platyrhynchos)
杜雪 徐小钦 田勇 沈建良 卢立志 牛冬
2016, 24(11): 1652-1663 | Full text
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摘要
本研究旨在通过16S rDNA V3–V4区测序了解山麻鸭(Anas platyrhynchos) 5个不同肠道部位(十二指肠, 空肠, 回肠, 盲肠和直肠)形态及微生物区系特点,并分析日粮添加鱼油对该特征的影响。实验鸭随机分为2组,分别饲喂基础日粮和基础日粮+2%鱼油,实验周期为28 d。分别通过组织染色和16S rDNA V3–V4区测序技术检测山麻鸭肠道形态和肠道微生物区系。回肠中的绒毛高度/隐窝深度(VH/CD)最大,直肠其次。直肠杯状细胞数目(GCC)最多,而其他肠道部位差异不显著。十二指肠所获OTUs(operational taxonomic units)数目最少,而回肠最多,日粮添加鱼油整体上减少了各肠段OTUs数目。α多样性分析表明十二指肠中微生物丰度最低,而鱼油显著降低直肠微生物多样性。通过对乳杆菌属、梭菌纲、巨单胞菌属和弯曲菌目的进一步LefSe(linear discriminant analysis coupled with effect size)分析发现,在所有肠道部位中,回肠除肠道形态最佳外,相关微生物数量最多,因此是山麻鸭进行消化吸收的主要部位。日粮添加2%鱼油整体上对肠道形态造成了不利影响,并降低了肠道微生物多样性。本文为全面了解山麻鸭不通肠道部位组织形态及微生物组成提供了可靠依据,并为研究鱼油在山麻鸭生产中的添加效果提供了肠道的研究基础。
山羊FGF10基因的克隆及其表达分析
Cloning and Expression Analysis of Capra hircus FGF10 Gene
李倩 林亚秋 朱江江 林森 张小玉 王永
2016, 24(11): 1726-1733 | Full text
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摘要
成纤维细胞生长因子10(fibroblast growth factor 10, FGF10)是一种极其重要的生长因子,能促进小鼠(Mus musculus)和人(Homo sapiens)前体脂肪细胞的分化。为了获得山羊(Capra hircus)FGF10基因序列,研究其组织表达特性,确定其在肌内前体脂肪细胞分化过程中的表达模式,并分析FGF10 mRNA表达水平与肌内脂肪沉积的关系,本研究以简州大耳羊(C. hircus)为实验动物,采用反转录聚合酶链式反应 (RT-PCR)技术克隆FGF10基因,采用II型胶原酶消化获得山羊原代肌内前体脂肪细胞,利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测FGF10在成年山羊不同组织中的表达差异及其在肌内前体脂肪细胞分化过程中的表达水平,并将基因表达水平与肌内脂肪(intramuscular fat, IMF)含量进行关联分析。结果显示,克隆得到山羊FGF10基因(GenBank登录号: KT899958)序列1 252 bp,其中开放阅读框642 bp,编码213个氨基酸,与绵羊(Ovis aries)和牛(Bos taurus)的该基因同源性达100%,具有跨膜结构域和信号肽结构。FGF10在山羊肺脏中表达水平最高,显著高于其他组织(P<0.05),在脾脏和脂肪中也存在较高水平的表达。FGF10 mRNA在成年羊背最长肌中表达量显著高于羔羊与育成羊(P<0.05),相关性分析结果显示,FGF10 mRNA 表达量与山羊背最长肌IMF含量呈显著正相关(P<0.05)。FGF10 mRNA在肌内前体脂肪细胞中表达水平最低,在诱导分化后2 d达到最高。本研究结果为进一步阐明FGF10基因在山羊肌内脂肪沉积中的分子机制提供了理论依据。
菠菜转录组SSR位点分析及其分子标记的开发
Analysis of the SSR Loci and Development of Molecular Markers in Spinacia oleracea Transcriptome
潜宗伟 陈海丽 崔彦玲
2016, 24(11): 1688-1697 | Full text
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摘要
简单重复序列(simple sequence repeat, SSR)分子标记具有多态性高、重复性好、共显性等特点,已广泛用于蔬菜作物遗传育种研究中。本研究利用MISA软件对菠菜(Spinacia oleracea)转录组SSR位点信息进行分析,开发适用于菠菜的SSR分子标记,并对不同菠菜材料的遗传多样性进行分析。结果显示,在获得的44 796条基因簇(Unigene)中检测出2 045个SSR位点,检测出2 045个SSR位点,分布在1 940条Unigene上,发生频率为4.33%,平均距离为19.81 kb。菠菜SSR中以单、三、四核苷酸重复为主,分别占总SSR的19%、65%和7%,重复长度主要为18~24 bp,占菠菜总SSR的93.55%,以重复次数6次和7次为主,分别占菠菜总SSR的31.42%和31.05%。菠菜转录组中单核苷酸重复类型为A/T,二核苷酸重复主要为GA/TC和AG/CT,三核苷酸重复主要以CAA/TTG、GTT/AAC、GAA/TTC、TGT/ACA和GAT/ATC为主。本研究共设计了2 199对SSR特异位点引物,随机挑选218对引物对9个不同类型的菠菜材料进行扩增检测,其中38对表现出多态性。利用UPGMA做图进行聚类分析,9份菠菜材料聚为3类。本研究通过对菠菜转录组SSR位点信息分析及其分子标记的开发,获得了多态性较为丰富的SSR位点,为菠菜遗传多样性的分析、遗传图谱的构建及分子标记辅助育种提供了基础资料。
杨树SAMT基因超表达载体的构建及遗传转化
Construction of Salicylic Acid Methyltransferase Gene Over-expression Vectors and Genetic Transformation in Poplar (Populus alba × P. glandulosa)
董慧霞 理永霞 吕全 贾秀贞 张星耀
2016, 24(11): 1709-1717 | Full text
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摘要
一年生草本植物受到病原菌侵染时,体内的水杨酸甲基转移酶基因(salicylic acid methyltransferase, SAMT)能将植物侵染部位产生的水杨酸(salicylic acid, SA)转化为水杨酸甲酯(methyl salicylate, MeSA),在SA信号转导和植物系统获得抗性(systemic acquired resistance, SAR)中起着重要作用。而多年生木本植物中SAMT基因的功能还有待进一步验证。本研究根据毛果杨(Populus trichocarpa)SAMT基因序列,设计了84K杨SAMT引物,利用Gateway克隆技术,在BP反应酶作用下,使带attB接头的SAMT基因全长开放阅读框与入门载体pDONRTM222进行BP重组反应,将目的基因转入入门载体;转化大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞DH5α后提取的质粒用MLUⅠ进行酶切,然后在LR酶作用下与超表达载体pMDC32进行LR重组反应,将SAMT转入表达载体,成功构建了SAMT的超表达载体。通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的遗传转化,获得了SAMT超表达的84K杨转基因植株。为今后研究该基因在杨树抗溃疡病中的功能以及杨树在获得SAR和其他方面的作用提供了基础资料,同时也为研究该基因在其他多年生木本植物中的功能提供参考。
砀山酥梨肉桂酸4-羟化酶基因的克隆及表达分析
Cloning and Expression Analysis of Cinnamate 4-hydroxylase Gene from Pyrus bretschneideri cv. Danshan Su
程俊 程曦 盛玲玲 方志 张金云 金青 蔡永萍 林毅
2016, 24(11): 1698-1708 | Full text
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摘要
木质素是梨(Pyrus)石细胞的重要成分之一,木质素合成代谢对石细胞形成发育有着重要影响。肉桂酸4-羟化酶(cinnamate 4-hydroxylase, C4H, EC 1.14.13.11)是细胞色素单加氧酶超家族中CYP73A亚家族的一员,同时为木质素合成代谢中的一个关键酶。本研究从砀山酥梨(Pyrus bretschneideri cv. Danshan Su)果实中克隆出一条肉桂酸4-羟化酶基因的全长cDNA序列,命名为PbC4H,GenBank登录号为:KF663548。PbC4H全长1 764 bp,具有1 515 bp的ORF,编码504个氨基酸。PbC4H与多个物种C4H基因编码的氨基酸序列具有较高的同源性,说明其在进化过程中较为保守。结构域分析表明,PbC4H具有跨膜结构域和典型的细胞色素P450结构域特征。qRT-PCR分析发现在梨果实发育的不同时期,PbC4H基因表达量呈现先增加后下降的趋势,其中在花后55 d达到最高。构建了PbC4H原核表达载体pET-32a-PbC4H,在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21菌株中诱导表达出PbC4H融合蛋白。亚细胞定位表明PbC4H蛋白定位于细胞膜上。本研究结果为利用分子生物学技术调控梨木质素的合成和石细胞的发育提供了基础资料
piggyBac转座酶的瞬时表达对莱茵衣藻体内piggyBac转座子的作用
Transposition of PiggyBac (PB) Element is Attributed to Transient Expression of PB Transposase in Chlamydomonas reinhardtii
齐淑圆 Majid ESHAGHI Deying SUN 何靖 杨小杭 刘建华
2016, 24(11): 1643-1651 | Full text
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摘要
piggyBac转座系统作为一种遗传修饰的工具,在很多生物体如哺乳动物、昆虫、酵母中已经得到了广泛应用。然而,目前piggyBac转座系统在绿藻—莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardti)中是否有活性很少有人研究。本研究构建含有一个拷贝或多个拷贝并且能够稳定表达piggyBac转座元件的莱茵衣藻藻株。然后在含有转座元件的藻株中瞬时表达普通的piggyBac转座酶和密码子优化后的piggyBac转座酶,通过限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)分析piggyBac转座元件的转座现象。转座酶转入莱茵衣藻细胞内一周和两周之后与转入之前的RFLP图谱对比,有很明显的差异。转入转座酶一周后的TR1藻株原有的1.5 kb大小的片段消失,同时出现了3条新的片段:2.8、4.2和6.5 kb。两周之后,这3条片段又发生了变化,表明转座现象存在并且持续发生。转入密码子优化后转座酶一周后的TR3藻株中,1.5、3和4 kb大小的片段没有发生改变,但是6.5 kb大小的片段消失了,与此同时新出现了一个2.8 kb大小的片段。两周之后,TR3的限制性片段多态性图谱并没有发生变化。为了检测转座酶是否成功转入细胞中,我们在新的接头序列两侧进行侧翼PCR,同时对PCR产物进行序列比对分析,结果显示,piggyBac转座子偶尔会在非常规性位点5'-TTT-3' 和 5'-ACGCAG-3'处发生剪切,而常规性剪切位点发生在5'-TTAA-3'处。研究结果表明,piggyBac转座酶对莱茵衣藻体内piggyBac转座子具有转座作用,piggyBac转座系统可以用于莱茵衣藻的遗传学修饰。
南方型紫花苜蓿苗期叶片盐胁迫差异蛋白分析
Differentially Expressed Proteins Analysis of Seedling Leaf of Southern Type Alfalfa ( Medicago sativa 'Millenium' ) Under Salt Stress
裴翠明 张振亚 马进
2016, 24(11): 1629-1642 | Full text
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摘要
以南方型紫花苜蓿(Medicago sativa 'Millennium') 30 d苗龄的实生苗为实验材料,分析正常培养和 250 mmol/L NaCl 处理 72 h后叶片中的蛋白表达变化,以期从蛋白质水平上揭示南方型紫花苜蓿适应盐胁迫的分子机制。采用同位素相对标记与绝对定量技术(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)结合双向液相色谱与串联质谱(2-dimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry, 2D-LC-MS /MS)定量蛋白质组技术鉴定南方型紫花苜蓿叶片响应盐胁迫的差异表达蛋白,对所获得差异蛋白进行生物信息学分析,筛选出可能的耐盐潜在靶标蛋白。结果表明,共鉴定3 712个定量蛋白,417个表达量有显著差异的蛋白质(变化倍数≥1.2, P≤0.05),其中包含291个表达上调的蛋白,126个表达下调的蛋白。按照基因本体(Gene Ontology, GO)分类体系,对差异蛋白归类分析,揭示其亚细胞定位和分子功能。京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路显著性富集于代谢途径、次生代谢产物生物合成、吞噬体、脂肪酸代谢和光合作用等(P<0.05, 错误发现率(false discovery rate, FDR)<0.05)。成功鉴定的差异蛋白分别涉及到光合作用(7%)、信号传递(3%)、防御(2%)、碳水化合物代谢(11%)、氨基酸代谢(7%)、脂类代谢(5%)、其它代谢(7%)、蛋白质合成、加工与降解(18%)、细胞结构、分裂和细胞骨架(3%)、抗氧化物(6%)、能量产生与转运(7%)、膜和胞内运输(7%)及未知功能蛋白类(16%)。差异表达蛋白中与抗氧化物、能量产生与转运、防御和信号传递及代谢等相关的蛋白表达量总体上调,而与蛋白质合成、加工与降解和光合途径相关蛋白表达量总体下调。研究发现,细胞色素P450、PSⅡ放氧增强蛋白、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C、果糖-1,6-二磷酸醛缩酶、甘露糖-6-磷酸还原酶、海藻糖-6-磷酸合酶、天冬氨酸转氨酶、E3泛素连接酶和H+-ATP酶C亚基蛋白等可能是紫花苜蓿耐盐潜在靶标蛋白。采用iTRAQ结合2D-LC-MS/MS技术,能有效地筛选出南方型紫花苜蓿叶片响应盐胁迫差异表达蛋白,这些差异表达蛋白可能在紫花苜蓿耐盐调控过程中发挥重要作用,该研究为深入认识紫花苜蓿盐胁迫的应答分子调控机制提供理论依据。
miR-122靶向调控鸡BZW2基因的表达
miR-122 Targets to Regulate BZW2 Gene Expression in Chicken(Gallus gallus)
李艳艳 王星果 郁建锋 邵芳 张燕萍 顾志良
2016, 24(11): 1734-1740 | Full text
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摘要
miR-122(MicroRNA-122)是在肝脏中高表达的miRNA,在肝脏的生长发育和脂类代谢等过程发挥重要作用,BZW2 (basic leucine zipper and W2 domains 2)主要参与蛋白质合成代谢,本研究目的是确定BZW2是否为miR-122调控的靶基因。通过生物信息学预测miR-122的靶基因,并分析BZW2的3-UTR区域与miR-122种子区的配对情况,再用双荧光素酶报告系统和突变实验证明miR-122作用于BZW2的3'UTR。用荧光定量PCR检测转染miRNA-122mimic的鸡(Gallus gallus)肝癌细胞系(leghorn hepatocellar, LMH)细胞和转染LNA-antimiR-122的鸡原代肝细胞中BZW2的表达。鸡BZW2的3'-UTR区域与miR-122种子区互补配对,荧光素酶报告基因和突变实验分析表明,miR-122能够通过与BZW2 3'-UTR区结合抑制基因的表达;将miR-122在LMH细胞中过表达后,发现BZW2 mRNA表达水平显著下降;利用LNA-antimiR-122抑制鸡肝脏原代细胞中的miR-122后,BZW2 mRNA表达水平呈显著性上升。结果证明BZW2是miR-122的靶基因,其在mRNA水平上受到miR-122的负性调控,本研究为揭示miR-122在鸡肝脏中的广泛的功能提供了理论依据。
研究评述与展望
基因差异表达技术cDNA-SCoT在植物上的研究应用
Research and Application of cDNA-SCoT on Plants: A Technology About Gene Differential Expression
丘立杭 陈荣发 黄杏 吴建明 李杨瑞 李强 罗含敏
2016, 24(11): 1771-1780 | Full text
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摘要
目标起始密码子多态性(start codon targeted polymorphism, SCoT)分子标记是一种源于起始密码子ATG翻译起始位点保守区域来设计其侧翼单引物的标记技术。自从首次应用SCoT标记进行甘蔗(Saccharum officinarum)基因差异表达分析以来,该技术已被广泛应用于花生(Arachis hypogaea)、玉米(Zea mays)、铁皮石斛(Dendrobium officinale)、芒果(Mangifera indica)、西瓜(Citrullus lanatus)等植物的研究。本文介绍了cDNA-SCoT技术的原理、引物设计方法及特征,着重总结cDNA-SCoT技术体系筛选及其在抗病、抗寒、抗旱、遗传进化等方面的应用研究,以期为科研工作者在选择差异表达分析技术提供参考。
母源P小体在小鼠卵母细胞成熟过程中的功能
The Function of Maternal P-bodies During the Maturation of Mouse (Mus musculus) Oocyte
余博 雷安民
2016, 24(11): 1781-1789 | Full text
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摘要
P小体是一种存在于真核细胞质的蛋白颗粒,由多种酶组成并参与mRNA调控。应激颗粒是P小体的一种类似颗粒,是一种在应激情况下形成并由蛋白和RNAs组成的致密集合体,应激颗粒能够暂时性存储mRNA。这两种颗粒在基因转录后调控起重要作用。卵母细胞的成熟是一个持续时间长且复杂的过程。小鼠(Mus musculus)卵母细胞的成熟过程存在转录静默的现象,即小鼠卵母细胞从GV期到二细胞期不进行任何转录活动。然而,小鼠卵母细胞成熟过程需要大量蛋白的参与。在这一成熟过程中,新合成的蛋白只来源于母源mRNA为模板翻译形成的产物。因此,小鼠卵母细胞对母源mRNA的精确调控在小鼠卵母细胞成熟进程中显得尤为重要。母源mRNA被认为存储于一种类似P小体的信使核苷酸蛋白复合物颗粒里面,本文将这种蛋白复合体称之为母源P小体。本综述对P小体及其功能进行概述,在此基础上着重讨论小鼠卵母细胞内母源P小体在小鼠卵母细胞成熟过程中对母源mRNA的调控作用,提出了母源P小体在小鼠卵母细胞成熟调控中发挥作用的可能机制,并提出卵母细胞是一个新颖的研究mRNA转录后调控的模型。
研究资源与技术改进
成脂调控网络(ARN)数据库的分析和预测功能
Analysis and Forecast Function of the Adipogenesis Regulation Network (ARN) Database
黄艳 王力 昝林森
2016, 24(11): 1790-1800 | Full text
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摘要
脂肪组织中脂类的过量积累会导致肥胖,进而引发心血管疾病、二型糖尿病和其他疾病。成脂是指干细胞分化为能够积聚脂滴的脂肪细胞的过程,受到一个复杂且高度协调的基因表达网络的调节,为促进成脂调控中关键基因和通路的发现,探索脂肪生成的分子调控机理,在之前的研究中,本实验室通过对成脂相关文献进行文本挖掘构建出一个包含3万多条成脂相关数据和信息的成脂调控网络(Adipogenesis Regulation Network, ARN)数据库(http://210.27.80.93/arn/)。为了进一步充分发掘ARN数据库促进成脂相关研究的潜在价值,本研究通过“开放的”和“闭合的”两种构建假说的原理,设计出能够用于分析成脂分化相关试验数据或构建科学假说的在线分析工具-ARN-analysis。另外,通过对成脂调控网络中各节点(基因和小分子RNA)的互作关系数、差异表达记录数和互作关系预测数进行统计分析,计算得到体现各节点重要性的节点影响值(impact factor, IF)。最后,通过对成脂调控网络中各节点的互作关系进行统计分析和作图,探索了成脂调控网络的拓扑结构。结果显示,ARN数据库的分析工具能够有效分析“节点相关”、“表达相关”及“用户录入”3类数据,帮助科研人员分析试验数据或构建科学假说。节点的IF值能够帮助科研人员快速识别重要的节点或假说,对调控网络拓扑结构的分析能加深对成脂调控机理的认识。本研究对成脂专业数据库的分析和预测功能的探索,为专业研究人员分析数据和构建假说提供了新的途径,探索了运用过去积累的大量科研数据促进未来的科研实践的可能性。
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