内标准基因(endogenous reference gene)是指具有物种专一性、不显示等位基因变化、拷贝数恒定的保守DNA序列，对基因定量分析时具有重要意义。本研究选取了5个水稻内标准基因：根部表达的水稻基因(rice root-specific, GOS9)、磷脂酶D基因(phospholipase D, PLD)、蔗糖磷酸合成酶基因(sucrose phosphate synthase, SPS)、水稻淀粉分支酶基因(rice starch branching enzyme, RBE4)、泛素蛋白基因(ubiquitin 5, UBQ5)和2个外源基因：苏云金芽孢杆菌Cry1Ab杀虫晶体蛋白基因Cry1Ab和cry1Ab/cry1Ac融合杀虫晶体蛋白基因(Cry1Ac/Cry1Ab)，分别以转基因水稻(Oryza sativa L.)克螟稻2号和TT51-1为模板，比较各自的外源基因(Cry1Ab=KMD2和Cry1Ac/Cry1Ab=TT51-1)与5个内源基因的PCR产物量，筛选出和外源基因PCR产物量最接近的内标准基因为RBE4。在此基础上，数字PCR不依赖于已知浓度的标准曲线来定值，可以避免标准样品的标准曲线和样品目的基因的扩增曲线在扩增效率上的不一致等因素所带来的误差，定值结果更加准确、可靠，采用数字PCR分析外源基因拷贝数与内标准基因RBE4拷贝数的比值，荧光定量PCR方法分析内标准基因RBE4和外源基因的定量检测稳定性、灵敏度等。结果表明，外源基因拷贝数与内标准基因RBE4拷贝数的比值在转基因水稻克螟稻2号和TT51-1上都较接近于1∶1，分别为115.9%和105.3%。RBE4的荧光定量PCR体系重复性、定量检测稳定性和灵敏度好，符合作为转基因水稻基体标准物质定量分析的内标准基因的要求，RBE4定量体系在TT51-1和克螟稻2号的最小检出限(LOD)分别为5~11 copies/μL和3~12 copies/μL，最小定量限(LOQ)分别为11~22 和12~24 copies/μL。RBE4是转基因水稻标准物质研制和产品定量检测的适宜内标准基因。研究结果为转基因作物标准物质研制和定量检测的内标准基因选取提供一定的参考。

Rop(Rho-related GTPase of plant)是植物中存在的一种特殊的小G蛋白。其与GTP(guanosine triphosphate)结合形成激活态，与GDP(guanosine diphosphate)结合形成失活态，并通过其激活态和失活态的转换启动和终止植物多种信号过程。Rop不同结合形式的转换受到一系列调控因子的调控。本研究以一个辣椒(Capsicum annuum L.) Rop蛋白(CaRop1)的组成型激活态CA-CaRop1为诱饵，利用ProQuestTM酵母双杂交体系，从辣椒幼苗猎物文库中分离获得一种Rop GTPase激活蛋白(Rop GTPase activating proteins, RopGAP)基因，将其命名为CaRopGAP3。生物信息学分析表明，CaRopGAP3全长1 597 bp，包含一个1 437 bp的开放阅读框，编码478个氨基酸，其氨基酸序列不仅含有3个保守的GAP结构域， 其N端还含有CRIB(Cdc42/Rac-interactive binding motif)结构域，属于植物特有的一类RopGAP亚家族。酵母双杂交验证显示CaRopGAP3只能与组成型激活态(CA)的CA-CaRop1互作而不能与显性失活态(DN)的DN-CaRop1互作，且含CRIB结构域的N端对他们之间的互作没有明显的调控作用。亚细胞定位分析显示，CaRopGAP3主要分布于细胞膜上，且含CRIB结构的N端在其膜定位中起重要调节作用。荧光定量PCR分析显示，CaRopGAP3基因在辣椒幼叶中的表达量最高，约为幼根的17倍、成熟根和花器官的8倍。CaRopGAP3基因的这种结构及组织表达特点可能与其参与的特定信号路径密切相关。本研究为进一步解析辣椒CaRop1介导的信号调控机制提供基础数据。

为了建立一个简捷有效的抗血清的制备方法，本研究选用猪Ⅱ型圆环病毒核衣壳蛋白基因，使用水流动力学基因免疫的方法制备高效价抗血清的可行性。应用无内提取试剂盒制备猪Ⅱ型圆环病毒核衣壳蛋白基因真核表达载体pcDNA-Cap的无内毒素质粒。将该质粒使用水流动力学尾静脉注射法对小鼠(Mus musculus)进行基因免疫，重复免疫5次后采血收集血清；以原核表达获得的N末端去除了核定位序列的猪圆环病毒核衣壳蛋白表达产物作为抗原蛋白，以制备的小鼠血清作为一抗进行酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blot检测。结果显示，应用水流动力学尾静脉注射法获得抗血清稀释5 000倍通过Western blot至少能够检测到10 ng的抗原蛋白，ELISA分析表明，其效价可达到1∶1 000 000，说明获得的抗血清具有很好的效价水平。这一研究为猪Ⅱ型圆环病毒相关研究用抗体的制备提供了一个简洁有效的方法，也为猪Ⅱ型圆环病毒的防治方法的建立提供了一个值得尝试的策略。

大麻素Ⅰ型受体(CNR1)是介导内源性大麻素发挥作用的关键分子，在食欲和能量代谢调控中发挥着重要作用。为了更深入研究CNR1的基因功能,本实验旨在构建和筛选有效沉默CNR1基因的干扰表达载体，并筛选出稳定转染干扰质粒的阳性细胞系。设计合成3对CNR1基因的特异性发夹小干扰RNA(siRNA)干扰引物，将其连接入干扰载体pYr-1.1，构建可沉默CNR1基因的siRNA表达载体CNR1-1、CNR1-2和CNR1-3。并采用LipofectamineTM (Lip)2000 介导质粒转染L6细胞，绿色荧光蛋白的表达和流式细胞仪监测转染效率，通过实时荧光定量分析siRNA表达载体的干扰效果。并进一步用G418进行了稳定转染细胞筛选。结果显示，CNR1基因的siRNA表达载体构建正确，瞬时转染L6细胞的转染效率分别为10.45%(P<0.01)、8.57%(P<0.01)和8.71%(P<0.01)；干扰效率为39%(P<0.05)、64%(P<0.01)及68%(P<0.01)。稳定筛选的最佳G418浓度为800 μg/mL，稳定筛选后干扰效率分别为43%(P<0.05)、78%(P<0.01)及91%(P<0.01)。干扰效率较高的CNR1-3表达载体和稳定转染CNR1-3的细胞系为构建筛选成功的siRNA表达载体和阳性细胞系。本研究提供了一种有效沉默CNR1基因表达的方法，同时稳定沉默的阳性L6细胞系成功筛选为进一步研究大麻素Ⅰ型受体的基因功能提供了基础资料。

BIO ORGANS（BIO）是百脉根中调控花器官形态和器官大小的基因，为研究其调控机理，利用根癌农杆菌介导法把BIO及其突变的截断基因bio定向导入烟草中，共获得18株转BIO基因烟草植株以及21株转其突变基因bio烟草植株。转BIO及转bio植株表型具有一定的相似性：与野生型相比，转基因植株的生长周期显著缩短；接近一半的叶片出现缺刻或呈现一个叶片向两个叶片分裂的趋势；花冠颜色变浅，花器官大小、数目、形态等都表现出了一定的变化。不同的是：与野生型相比，转BIO植株明显矮化，器官变小，而转bio植株株高变高，器官变大。通过表型分析显示，BIO基因参与了植株形态建成的多个方面，包括植株的高度、叶片以及花器官的形态等，同时推测bio基因缺失的一段序列可能对调控器官大小起着重要的作用。对BIO及bio测序后进行序列比对，结果显示其基因序列及蛋白序列与豆科植物大豆、蒺藜苜蓿中的部分序列相似性均达到90%以上，进一步表明在豆科植物中可能存在一个调控花器官形态和器官大小的保守位点。该研究为下一步探索BIO基因的调控机理以及与其它基因的互作关系提供了实验依据。

生长激素是影响动物生长发育的最重要内分泌激素，为了探讨外源生长激素对尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)生长、骨骼肌纤维增生以及肥大的影响，本实验对同一批次尼罗罗非鱼幼鱼进行为期7周的外源重组人生长激素(hGH)肌肉注射，并设置了磷酸盐缓冲液(PBS)注射对照组，每周注射1次，测量体重、体长等表型生长指标，同时，隔两周采集背部肌肉，利用石蜡切片技术分析骨骼肌背侧第一肌节中肌纤维数目与面积的变化。结果显示：(1)注射后第1周起，实验组鱼的体重、体长即高于对照组，但差异不显著(P＞0.05)；第5周起，实验组鱼体重显著高于对照组鱼(P＜0.05)，第7周起，实验组鱼体长极显著高于对照组鱼(P＜0.01)。(2)注射后第1周起，实验组鱼肌纤维数目、总面积均高于对照组鱼，差异不显著(P＞0.05)；第5周起，实验组鱼肌纤维的外源性增生和肥大现象极显著(P＜0.01)。研究结果表明，外源生长激素对尼罗罗非鱼的表型生长、骨骼肌肌纤维的增生与肥大均有显著促进作用，肌肉生长中以肥大生长更为明显。

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)感染一直是影响猕猴(Macaca mulatta)健康的重要病菌。为了研究自发性肺炎链球菌感染猕猴肺脏及气管内分泌性免疫球蛋白A(sIgA) 蛋白及mRNA的表达与分布情况，本实验采用免疫组织化学技术和组织原位杂交技术进行检测。结果表明，感染组sIgA蛋白产物在肺泡隔内的表达量高于健康组且差异极显著(P<0.01)，肺脏血管壁内表达量高于健康组且差异显著(P<0.05)，气管上皮层及固有层内OD值高于健康组差异显著(P<0.05)，上皮层中阳性表达面积高于健康组差异显著(P<0.05)。sIgA mRNA在肺泡隔、肺脏血管内及血管壁的阳性表达量远高于与健康组，且差异均极显著(P<0.01)，气管上皮层及气管肌肉层中OD值高于健康组且差异极显著(P<0.01)，固有层中OD值高于健康组且差异显著(P<0.05)；sIgA mRNA在气管上皮层中的表达面积与健康组相比差异显著(P<0.05)。结果证实肺炎链球菌感染猕猴肺脏与气管中有大量的sIgA参与了免疫与调控的过程。研究结果为该疾病的定向治疗及免疫途径的确立提供新思路。

为了探索鸡白介素-2(IL-2)对鸡新城疫病毒(NDV)F蛋白免疫效果的增强作用，本研究通过重叠延伸PCR技术(SOE-PCR)利用连接子(G2SG3S)将鸡IL-2基因和鸡NDV F基因串连，克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)，构建了表达质粒pcDNA-IL-2-F。通过脂质体介导DNA瞬时转染法，将重组质粒pcDNA-IL-2-F和pcDNA-F分别转染鸡胚成纤维细胞，Western blot验证表明，pcDNA-IL-2-F和pcDNA-F均能瞬时表达F蛋白，表达蛋白分别为76.0和59.6 kD，表达蛋白的大小与预期一致并具有抗原性。将表达质粒免疫SPF鸡(Gallus domedticus)，6 d后开始用ELISA方法检测NDV的特异抗体，免疫20 d后，用F48E9进行攻毒。结果显示，免疫pcDNA-IL-2-F的鸡群产生的抗体水平(P<0.05)高于混合免疫pcDNA-IL-2和pcDNA-F，高于免疫pcDNA-F的鸡群，但比免疫Lasota组的抗体水平要低。攻毒试验说明免疫pcDNA-IL-2-F组比免疫其他质粒组保护率高，这说明串连表达的免疫效果要好于二者的联合使用，为病毒病疫苗的研制提供了思路。

蔗糖磷酸合成酶(SPS, EC 2.4.1.14)是植物糖分积累的关键酶基因，在甘蔗中其家族成员SPSⅢ在成熟蔗茎中表达量高，是禾本科作物的特异成员。本研究应用酵母在甘蔗中单杂交系统，筛选SPSⅢ5'侧翼－1 410 ~ －1 181 bp的光响应元件ATCT-motif和分生组织特异性元件CAT-box的调控序列，获得了54个含有cDNA片段的文库质粒，测序分析显示，14个cDNA序列为非重复性。NCBI的Blast同源性结果显示，除E1-3、E9-1和E0-3外，其余克隆都与甘蔗(Saccharum spp.)近缘物种的蛋白有很高的同源性，达到90%以上。通过SMART和SBASE，对推演的氨基酸序列进行蛋白质功能结构域预测与分析，显示编号为E0-3、E2-3、F2-1、F4-2和G8-2的5个克隆对应的氨基酸序列具有转录因子特征结构域。研究结果为分离调控SPSⅢ基因表达的转录因子提供了候选基因。

抗菌肽在哺乳动物先天免疫系统中发挥着非常关键的作用。猪β-防御素1(pBD-1)和β-防御素2(pBD-2)是猪体内两种重要的抗菌肽。本研究采用化学方法合成pBD-1和pBD-2，通过改良的微量肉汤稀释法研究了pBD-1和pBD-2对8种革兰氏阴性菌和3种革兰氏阳性菌的抗菌活性，并利用透射电镜初步探究了pBD-1和pBD-2可能的杀菌机制；本研究还进一步探讨了pBD-1和pBD-2的体外抗氧化活性。抗菌试验结果表明，pBD-1对Escherichia coli EPEC O78:K80和Bacillus subtilis ATCC 6633具有较好的抑菌活性，最小抑菌浓度(MIC)均为32 μg/mL，最小杀菌浓度(MBC)分别为32 μg/mL和128 μg/mL；pBD-2仅对Pseudomonas.aeruginosa CMCC 10104有较好的抗菌活性，MIC为8 μg/mL， MBC为32 μg/mL，对其他细菌抗菌活性较弱；透射电镜观察结果表明，pBD-1和pBD-2能够作用于菌体细胞膜杀灭细菌；抗氧化活性实验结果表明，pBD-1和pBD-2在0~256 μg/mL范围内，具有清除自由基的功能和还原力，且呈现浓度依赖效应。研究结果揭示，pBD-1和pBD-2对特定细菌发挥抗菌作用的同时，还具有一定的抗氧化活性，为进一步阐明pBD-1和pBD-2的生物学功能及其开发和应用提供了基础资料。

干旱应答元件结合蛋白(DREB)转录因子调控植物抗逆相关功能基因的表达，对提高植物抗逆境胁迫具有重要作用。本研究采用盆栽法在小麦(Tritium aestivum)拔节至抽穗期进行不同水分胁迫条件下，分析了野生型和转基因小麦回交株系转录因子基因W16的表达特点，并对其抗旱性的生理生化指标进行了测定。半定量RT-PCR结果表明：野生型在无干旱胁迫时，W16有微弱表达，随胁迫增强，表达上调，当表达量达到峰值后(12 h)，随胁迫的加剧，表达量迅速下降，呈现“上升-峰值-下降”特点，而整个干旱胁迫过程中转基因植株W16在Ubiquitin启动子作用下表达恒定且表达水平较高；抗旱性生理生化机制分析表明：不同水分胁迫条件下，转基因株系的叶绿素含量、脯氨酸含量、可溶性蛋白含量、水分利用效率的变化均高于受体对照，尤其在重度干旱(SD)胁迫下的差异更显著。产量结果显示，在各水分条件下转基因株系产量都高于受体对照，其抗旱指数属于较强抗旱等级。研究结果说明了转基因小麦回交株系中W16的超表达，改良了转基因小麦抗旱性的生理生化特性，提高了转基因小麦的抗旱性能。为抗旱转基因小麦品种选育提供理论和方法参考。

海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthase, TPS)是海藻糖合成途径中的一个关键酶。目前，TPS基因的研究多数集中于细菌和真菌等，而对植物的研究较少。本实验通过对茶树(Camellia sinensis (L.) O. Kuntze)全器官转录组文库序列比对，获得一条与其他物种同源性较高的编码TPS基因的EST序列，通过RACE扩增后获得茶树TPS基因cDNA全长序列，命名为CsTPS(GenBank登录号 JQ742017 )。该基因cDNA全长3 125 bp，包含一个2 799 bp的开放阅读框，编码932个氨基酸。多序列比对分析结果表明，CsTPS基因编码的蛋白具有明显的TPS和TPP两个结构域。系统进化分析表明，其编码的氨基酸序列与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana tabacum)和番茄(Solanum lycopersicum)等植物的TPS同源性较高，且CsTPS与拟南芥TPS1(AtTPS1)的同源性高于TPS2(AtTPS2)和TPS3(AtTPS3)。qPCR分析显示，CsTPS基因在茶树不同组织器官中呈现差异性表达。低温诱导促使老叶和嫩叶中的CsTPS基因上调程度明显大于根系，表明CsTPS基因可能参与了茶树抗寒机制。

棕色棉具有典型的自然棕色纤维，在纺织及加工过程中无需漂染，是真正的“生态”、“环保”棉。克隆并了解棉花纤维棕色素合成相关基因对于揭示棉花纤维色素发育的分子机理具有重要的意义。本研究选取亚洲棉(Gossypium arboreum)棕色纤维慈溪紫棉和白棉余姚中棉纤维发育不同阶段RNA，采用Gene Fishing技术，获得1条仅在亚洲棉棕色棉纤维中特异表达的约500 bp的PCR扩增产物，根据测序结果和生物信息学分析发现，该基因在核苷酸序列上与拟南芥(Arabidopsis thaliana)种皮棕色素合成TT12基因存在76%的序列同源性。随后利用RT-PCR的方法克隆了该基因，命名为GaTT12a(GenBank登录号：JX013908)，该基因编码490个氨基酸残基，分子量约52.7 kD，属于MATE超基因家族中的一个成员。利用荧光定量PCR分析了GaTT12a基因在发育不同阶段纤维、种皮的表达特征，结果表明，GaTT12a基因在棕色纤维、白色棉种皮和棕色棉种皮中均优势表达，在白色棉纤维中几乎不表达，说明该基因参与纤维棕色素的形成，结果暗示棉花种皮棕色素和纤维棕色素可能分享相似的合成代谢途径。研究结果为进一步了解GaTT12a基因参与棕色棉纤维色素形成、棕色棉纤维色素与种皮棕色素合成之间的关系提供了基础研究资料。

Wnt3a是经典Wnt通路上游的一个重要分泌蛋白，Wnt3a蛋白的活化可促进多种细胞的增殖和分裂。为了揭示Wnt3a在猪胰腺干细胞(PSC)增殖及分化中的调控机理，采用RT-PCR从pGKS2P(+)- Wnt3a质粒中扩增出Wnt3a全长片段，将测序正确的Wnt3a连接到带有水母绿色荧光蛋白(AcGFP1)报告基因的真核表达载体pIRES2-AcGFP1中，构建重组质粒。经EcoRⅠ/ BamHⅠ酶切鉴定后，用脂质体转染至猪PSC。用抗生素G418筛选3周后获得稳转pIRES2-AcGFP1-Wnt3a的细胞株。荧光显微镜下观察到几乎所有细胞表达绿色荧光蛋白。RT-PCR和Western blot的结果显示，稳转Wnt3a组的猪PSC中Wnt3a mRNA及蛋白表达水平比对照组明显升高。这些结果表明，稳定表达Wnt3a的猪胰腺干细胞株成功建立，为进一步研究Wnt3a在猪PSC增殖及分化中的作用机理提供了基础资料。

寻找一种适合牛胚胎干细胞生长的饲养层对成功培育牛胚胎干细胞有重要意义。本研究采用不同浓度国产丝裂霉素处理的SIM小鼠(Mus musculus)成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐鸟苯苷亚系(STO细胞)作为饲养层培养牛胚胎干细胞，为牛胚胎干细胞培养体系的建立提供实验依据。用10、15、20、30和40 μg/mL国产丝裂霉素分别处理1.5、3.0和4.0 h的STO细胞；形态学观察不同代次STO细胞生长状态，并对生长在以STO细胞为饲养层的牛胚胎干细胞进行碱性磷酸酶染色(AKP)、阶段特异性胚胎细胞表面抗原-4(OCT-4)和阶段特异性胚胎抗原-1(SSEA-1)免疫组化检测、体外分化形成拟胚体等实验。结果显示，当丝裂霉素的浓度为15 μg/mL处理3.0 h可有效的抑制细胞分裂；STO细胞在5~10代作为饲养层细胞形态最好且获得的牛胚胎干细胞AKP染色及OCT-4和SSEA-1抗原表达均成阳性，分别在体外分化培养形成了拟胚体。结果证明使用国产丝裂霉素能有效地处理STO细胞且在以STO细胞作为饲养层培养的牛胚胎干细胞能保持未分化状态，可以作为常规饲养层培养牛胚胎干细胞。