绿色革命中“理想株型”概念的提出为玉米(Zea mays)株型设计育种提供了新思路。过长过宽的叶片由于披垂会导致产量下降,而卷叶能使叶片保持直立而不披垂,增大群体的受光面积,有效提高光合效率。本研究以玉米经典自然突变体cr1 (Crinkly Leaves 1)(表现为叶片褶皱, 植株矮小)为材料,对该突变体进行细胞学分析、图位克隆、基因编辑和表达分析。结果表明,该突变体叶片的平铺细胞发生形变且排列不规则,目标基因ZmCYP90D1定位在3号染色体短臂末端0.9 Mb的区间内。对区间内29个编码基因进行功能分析和外显子测序后,发现在cr1中ZmCYP90D1的第3个外显子缺失。进一步基因组测序发现,在cr1中第3个外显子末端的剪接位点处插入了1.2 kb的转座子,导致ZmCYP90D1的mRNA被错误剪接,丢失第3个外显子。ZmCYP90D1 (Zm00001d039453)基因编码细胞色素单加氧酶,参与油菜素内酯的生物合成,定位在内质网。基因编辑产生的5个纯合敲除系都表现出叶片褶皱,植株矮小的表型。对其中2个敲除系ko1和ko2进行分析,确认ZmCYP90D1即是cr1的目标基因。RNA-seq结果表明,差异表达基因多富集在细胞分裂和分化、细胞壁的形成和修饰、激素调节的响应、脂肪酸合成代谢等生物学过程。本研究为深入解析油菜素内酯合成途径调控玉米叶片发育的分子机制提供理论基础。

谷子(Setaria italica)高产育种的关键目标包括优化植株高度、增加单穗重量及提升单穗籽粒重量。为探究谷子株高、单穗穗重和单穗粒重的遗传规律,本研究以'矮宁黄'为母本,'晋谷21'为父本进行杂交,构建重组自交系(recombinant inbred line, RIL)群体,2019~2021年在山西省不同生态条件下的7个环境种植,利用R软件包SEA v2.0对RIL群体的株高、单穗穗重和单穗粒重等性状进行主基因+多基因混合遗传模型分析。结果表明,株高、单穗穗重和单穗粒重三者显著相关,其中单穗穗重与单穗粒重的相关系数为0.98 (P≤0.001)。株高的最优模型为多基因模型PG-AI,多基因遗传率为97.56%;单穗穗重的最优模型为多基因模型PG-A,多基因遗传率为84.04%,以加性效应为主,多基因加性效应值为-2.95,表现为负向遗传效应;单穗粒重的最优模型为MX2-ED-A,受2对具有显性上位性的主基因及加性多基因共同调控,其中主基因遗传率为62.53%,多基因遗传率为50.52%,第2对主基因的加性效应占主导,加性上位性互作效应值为-11.50,表明存在负向的遗传影响。谷子株高与单穗穗重的最优遗传模型相似,均表现出多基因遗传特征,具有较高的遗传率,且受环境因素的影响相对较小;相比之下,单穗粒重的遗传受到主基因与多基因混合遗传模式的控制。本研究对谷子株高、单穗穗重和穗粒重等关键性状的遗传改良和基因定位提供理论参考。

GH3 (Gretchen Hagen 3)基因的表达对植物的生长发育和生物胁迫响应起到重要的作用。本研究以马铃薯(Solanum tuberosum)品种'青薯9号'为材料,对其GH3家族成员进行鉴定及生物信息学分析,同时分析其在不同马铃薯组织中以及水杨酸(salicylic acid, SA)、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)、赤霉素(gibberellin A3, GA3)和晚疫病菌(Phytophthora infestans)胁迫处理下的表达模式。启动子顺式作用元件分析表明,StGH3家族成员含有大量与激素有关的作用元件,推测其具有潜在的响应生物胁迫和非生物胁迫的功能。组织特异性分析表明,StGH3.4和StGH3.5基因在根中高表达,StGH3.8基因在茎中高表达,StGH3.10和StGH3.16基因在叶片中高表达。在SA、MeJA、GA3和晚疫病菌胁迫处理下,StGH3家族成员均受到调控,且表现出不同的表达模式。StGH3.1、StGH3.5和StGH3.8基因在晚疫病菌处理下的响应更为强烈。本研究为StGH3功能的深入研究提供了参考依据。

果蔬在采收和采后处理期间极易受到机械损伤,伤口处产生茉莉酸(jasmonic acid, JA)等多种植物激素,但JA是否参与马铃薯(Solanum tuberosum)损伤胁迫尚未见报道。本研究在前期损伤马铃薯块茎转录组分析的基础上,筛选与JA合成与传导相关的基因,分析这些基因的表达量和相关酶活性,测定伤口处JA含量。结果显示,损伤显著上调了块茎伤口处JA合成相关基因的表达,这些基因包括脂氧合酶(lipoxygenases, LOX)家族成员StLOX1.5、StLOX2、StLOX3.1和StLOX6,丙二烯氧化合酶(allene oxide synthase, AOS)家族成员StAOS1、StAOS2和StAOS3,丙二烯环化酶(allene oxide cyclase, AOC)家族成员StAOC,以及12-氧-二烯酸还原酶(12-oxo-phytodienoic acid reductase, OPR)家族成员StOPR1、StOPR2和StOPR3。损伤还显著提高了LOX和AOS活性,块茎伤口处的JA水平显著增加。此外,损伤显著上调了JA信号传导关键基因茉莉酸ZIM域(JAZ)家族成员StJAZ1、StJAZ2、StJAZ3、StJAZ4和StJAZ7的表达水平。综上,损伤会激活马铃薯块茎伤口处JA的产生和传导。本研究为马铃薯损伤胁迫响应机制的研究提供了理论基础。

漆酶(laccase, LAC)是一种糖蛋白氧化酶,影响木质素的合成,调节植物体内酚类物质含量,并参与植物对病虫害的防御机制。为获得抗灰霉病能力强且符合转基因安全的番茄(Solanum lycopersicum)新种质,本研究基于实验室前期构建的载体pGM626-Act1,设计并成功构建了1个由果实特异性E8启动子调控FLP基因的基因删除系统,同时构建了Act1启动子驱动杜仲漆酶1 (Eucommia ulmoides laccase 1, EuLAC1)基因的植物表达载体pGM626-Act1-EuLAC1。采用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的转化技术,对番茄品种'Micro-Tom'进行遗传转化,最终成功获得了5株过表达EuLAC1的阳性番茄转基因植株。抗性分析结果表明,接种灰霉菌(Botrytis cinerea)后,过表达EuLAC1基因的番茄植株在发病时间方面与野生型及转空载体的番茄植株相比呈现出明显延迟。此外,过表达EuLAC1基因的番茄植株病斑直径显著小于对照组(野生型和转空载体的番茄植株)(P<0.05),表明EuLAC1基因的过表达能够明显增强番茄植株对灰霉病的抗性。过表达EuLAC1基因还可提高番茄植株中保护性酶的活性以及病程相关蛋白(pathogenesis related protein, PR)基因的表达水平。对转基因番茄果实中外源基因的删除分析发现,在40个番茄果实中有22个未检测到外源基因,外源基因删除效率为55%。本研究为开发满足转基因安全要求的抗病番茄新种质提供了一种新的技术手段。

MYB转录因子在桃(Prunus persica)果实花青苷积累过程中起着重要作用。深入研究MYB转录因子有助于理解桃次生代谢网络调控机制,为遗传改良和培育富含花青苷的新品种提供理论依据。为了探究PpMYB113在桃花和果实花青苷积累过程中的作用,本研究以红肉桃为材料,通过克隆获得PpMYB113基因(GenBank No. XM_007216468.2),对其进行生物信息学及表达模式分析,并通过在烟草(Nicotiana benthamiana)叶片和桃果肉瞬时转化对其功能进行研究。结果显示,PpMYB113基因开放阅读框为720 bp,编码239个氨基酸。进化树分析结果表明,PpMYB113蛋白与拟南芥(Arabidopsis thaliana) S6亚家族的MYBs转录因子亲缘关系最近。利用半定量RT-PCR及RT-qPCR对PpMYB113在桃花瓣、枝条、叶片、树皮、果皮和果肉中的表达进行分析,结果显示,PpMYB113在花瓣、果皮和果肉中高表达,而在枝条、叶片和树皮中不表达。利用瞬时转化体系在烟草和白色果肉桃中过表达PpMYB113,结果显示,过表达的烟草叶片和白色果肉出现红色表型,且花青苷积累增加。过表达烟草叶片和白色果肉区域,PpMYB113表达量显著高于对照组,且显著上调花色素苷合成酶(anthocyanidin synthase, ANS)和UDP-葡萄糖：类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶(UDP glucose: flavonoid-3-O-glucosyltransferase, UFGT)基因的表达。以上结果表明,PpMYB113在桃花青苷积累中起正向促进作用。本研究为进一步揭示MYB转录因子在红肉桃花青苷积累的分子调控机制提供帮助。

锌指同源域(zinc finger-homeodomain, ZF-HD)蛋白是植物特有的一类转录因子,主要包括锌指结构域 (zinc finger, ZF)和同源结构域 (homeodomain, HD)。ZF-HD家族可通过与DNA结合调节靶基因的表达模式,从而影响植物的生长发育过程。本研究以葡萄(Vitis vinifera)品种'左优红'叶片为材料,克隆得到VvZF-HD11基因(GenBank No. PP735488),其编码区为969 bp,编码322个氨基酸。该基因编码的蛋白保守结构域为N端的ZF (72~127 aa)和位于C端的HD (202~258 aa)。氨基酸序列比对和系统发育树分析表明,VvZF-HD11与野生烟草(Nicotiana tabacum) NaZF-HD9同源性最高,亲缘关系最近。进一步通过qPCR分析了VvZF-HD11在多种非生物胁迫下的表达特性,结果显示,VvZF-HD11基因受多种逆境胁迫因子和信号分子的诱导表达。其中,低温和水杨酸(salicylic acid, SA)处理下VvZF-HD11基因表达量在3 h最高,高温和H₂O₂处理后表达量在6 h变化最显著,盐胁迫和H₂S、脱落酸(abscisic acid, ABA)处理后表达量12 h最高,干旱胁迫处理后9 h达到峰值。将VvZF-HD11瞬时转化葡萄叶片,经45 ℃高温处理4 h,发现过表达VvZF-HD11提高了葡萄叶片抵御高温的能力。检测生理指标和高温胁迫相关基因的表达量发现,VvZF-HD11能够通过提高葡萄叶片的抗氧化酶活性,减轻细胞膜氧化损伤,促进高温胁迫相关基因的表达,提高葡萄的抗高温能力。综合以上结果推测,VvZF-HD11可能参与调控葡萄响应逆境胁迫的过程。本研究为葡萄耐高温品种的遗传改良提供了理论基础。

MYB转录因子是植物中家族成员最多的基因家族之一,其中R2R3MYB在花青素合成过程发挥重要功能。为了从基因组水平鉴定银杏(Ginkgo biloba) R2R3MYB家族成员,同时分析其在花青素合成中的功能,本研究利用同源比对获得银杏R2R3MYB家族成员的序列信息,通过生物信息分析软件进行保守结构域分析、进化树构建和保守基序分析;利用qPCR检测基因相对表达量;通过本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶片转化进行基因功能研究。在银杏基因组中鉴定到78个R2R3MYB家族成员,在进化树上分为7个分支;筛选出1个与拟南芥(Arabidopsis thaliana) AtMYB75同源的基因Gb_34086,其表达受光照诱导上调;Gb_34086蛋白定位在细胞核且具有转录激活活性;过表达Gb_34086基因的本氏烟草叶片可增强花青素的积累。本研究初步证明Gb_34086在花青素合成中发挥正调节作用,为进一步研究Gb_34086作用的分子机理和提高银杏花青素产量提供了依据。

薰衣草(Lavandula angustifolia)作为世界重要的香料经济作物,其花穗中萃取的精油蕴含了丰富的芳香化合物。这些化合物主要依赖于植物体内质体中的甲基赤藓糖醇-4-磷酸(methylerythritol 4-phosphate, MEP)途径进行代谢合成。在MEP途径中,1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase, DXS)和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase, DXR)作为前2步关键限速酶,对于整个代谢过程的顺利进行具有决定性的影响。为了验证MYC1在挥发性萜类化合物合成方面的功能,本研究从杂薰衣草(Lavandula × intermedia)中克隆LiMYC1 (myelocytomatosis 1)基因,通过构建pCAMBIA3301和pTRV2植物表达载体,利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的遗传转化方法获得过表达和基因沉默植株。对转基因植株中LiMYC1、LiDXS和LiDXR基因的表达量进行检测,并对叶片中挥发性萜类化合物进行定性定量分析。结果显示,在LiMYC1基因过表达株系中,LiDXS和LiDXR基因的表达量显著上升,同时芳樟醇(linalool)和石竹烯(caryophyllene)的含量也出现不同程度的增加。相反,在LiMYC1基因沉默株系中,LiDXS和LiDXR基因的表达量明显降低,石竹烯的含量随之减少,但芳樟醇的含量却出现异常升高。以上结果表明,LiMYC1基因对萜类化合物合成的MEP途径起正调控作用,影响关键酶LiDXS和LiDXR的表达,且对石竹烯和芳樟醇的生物合成具有一定的调控作用。本研究对于解析薰衣草香气形成的分子机制,以及优化薰衣草的经济价值具有重要的指导意义。

海藻糖-6-磷酸合酶(trehalose-6-phosphate synthase, TPS),是海藻糖生物合成的关键限速酶,在植物非生物胁迫应答过程中起重要作用。为探究TPS在木麻黄(Casuarina equisetifolia)生长发育及逆境应答中的功能,本研究分析了木麻黄CeTPS家族成员的理化特征、染色体定位、系统发育树、保守基序、基因结构、顺式调控元件及共线性关系,并分析其在木麻黄不同组织、及干旱、盐胁迫、脱落酸(abscisic acid, ABA)处理下的表达水平。结果显示,7个木麻黄CeTPS基因随机锚定在4条染色体上,编码氨基酸长度为826~998 aa,均为亲水蛋白。进化发育树显示木麻黄CeTPS分为2个亚族,与双子叶植物亲缘关系较近,存在基因复制事件。CeTPS基因启动子上大量分布激素响应、生长发育及胁迫应答相关的顺式元件。CeTPS基因具有组织特异性表达,并受干旱、盐胁迫及ABA处理呈现差异化表达,特别是CeTPS4在木麻黄胁迫应答过程中起重要作用。研究结果为深入研究木麻黄CeTPS基因在非生物胁迫中的功能提供理论依据。

蛇足石杉(Huperzia serrata)为石松科植物,其含有的石杉碱甲(huperzine A, Hup A)是一种高选择性的乙酰胆碱酯酶抑制剂,用于阿尔海默茨病(Alzheimer's disease, AD)的治疗和症状改善。DOF (DNA binding with one zine finger)家族是一类植物特有的转录因子,广泛参与植物的生长发育和非生物胁迫反应。本研究基于蛇足石杉三代全长转录组数据,鉴定HsDOF基因家族,分析其蛋白的理化性质、保守结构域、亚细胞定位、二级与三级结构、调控网络,利用RNA-seq数据分析HsDOF家族基因在不同组织及高温、干旱胁迫下的表达模式。结果显示,共鉴定出19个HsDOF基因;其编码蛋白质的氨基酸数目在213~574之间,分子量约为23.89~60.50 kD,等电点为5.15~9.93;亚细胞定位预测结果显示,全部HsDOF定位于细胞核;二级结构显示主要为α-螺旋和无规则卷曲,19个HsDOF蛋白中所用的三级结构模型有7种。系统发育分析显示,拟南芥(Arabidopsis thaliana)和蛇足石杉DOF可分为9个亚组,HsDOF分布于其中的2个亚组。表达模式分析显示,HsDOFs基因在不同的组织中呈现差异表达;在高温胁迫下,6个HsDOF基因在1个或多个时间点上调或下调2倍以上;在干旱胁迫下,有6个HsDOFs基因在1个或多个时间点上调或下调2倍以上,其中3个上调;2个下调。本研究为深入探究HsDOF基因家族的生物学功能和分子育种提供了理论依据。

跨膜蛋白18 (transmembrane protein 18, TMEM18)是影响动物生长发育的重要候选基因,编码具有重要生物学功能的跨膜蛋白。为了探究TMEM18基因在绵羊(Ovis aries)组织中的表达模式和饲料转化率的关系,寻找可用于育种的分子遗传标记。本研究以845只系谱清晰、饲料效率性状记录完整的湖羊群体作为研究对象,通过qRT-PCR技术检测了TMEM18基因在湖羊10个组织中的表达水平,采用Sanger测序技术扫描了该基因的SNPs,并与饲料转化率进行了关联分析。结果显示,TMEM18基因在心脏中的表达量显著高于其他组织(P<0.05),在十二指肠、瘤胃、肺脏和肝脏等组织中具有较高的表达量。在绵羊TMEM18基因的第3内含子中检测到TMEM18 g.517832 T>C突变位点。多重比较结果显示,该突变位点与湖羊FCR100~120、FCR140~160、FCR80~120、FCR140~180、FCR100~160、FCR80~160、FCR100~180和FCR80~180显著关联(P<0.05)。其中,CC基因型个体的FCR140~160、FCR100~160、FCR80~160、FCR100~180和FCR80~180显著高于TT基因型和TC基因型的个体(P<0.05)。以上结果表明,TMEM18 g.517832 T>C位点可以作为候选分子标记用于提高绵羊的饲料转化率。本研究为湖羊节粮型品种选育提供基因材料。

Madin-Darby犬(Canis lupus familiaris)肾(Madin-Darby canine kidney, MDCK)细胞作为流感疫苗生产的基质细胞,具有标准化、高产量的优点,但是其贴壁生长阻碍了生产规模的扩大,其成瘤性阻碍了MDCK基质疫苗的推广。本研究通过单克隆筛选和悬浮驯化成功获得1株MDCK无成瘤性悬浮细胞株XF06。以XF06和成瘤性悬浮细胞株XF04进行裸鼠(Mus musculous)荷瘤实验,将1×10⁷个细胞皮下注射到无胸腺裸鼠的背部,每组10只;以人(Homo sapiens)宫颈癌细胞系(Hela)(有成瘤性)作为阳性对照,以人胚肺成纤维细胞(MRC5)(无成瘤性)作为阴性对照。结果显示,筛选的细胞株XF06在裸鼠体内未形成肿瘤。利用数据非依赖性采集(data-independent acquisition, DIA)蛋白组学技术比较XF04和XF06的蛋白表达差异,筛选细胞成瘤相关基因,并进行基因和蛋白表达水平的验证。结果显示,4个蛋白(含杆状病毒IAP重复序列蛋白5 (baculoviral IAP repeat containing 5, BIRC5)、肌动蛋白结合蛋白1 (fascin actin-bundling protein 1, FSCN1)、胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白1 (insulin like growth factor 2 mRNA binding protein 1, IGF2BP1)、肿瘤坏死因子α诱导蛋白 2 (TNF alpha induced protein 2, TNFAIP2))在无成瘤性的XF06细胞中的基因和蛋白表达水平均显著降低(P<0.05),可能参与MDCK细胞成瘤的调控。本研究为利用基因编辑技术抑制细胞成瘤的靶基因筛选提供参考依据。

烟草赤星病是危害烟草产业的主要真菌病害,生物防治是目前防治植物病害的重要手段。而合成菌群因其在农业生产中表现出的良好的促生抗逆等功能一直是生物防治领域的研究热点。本研究以陕西陕南烟区烟草赤星病重病烟田健康烟草植株(Nicotiana tabacum)的根际土壤为材料,采用稀释分离、平板对峙法和菌丝生长速率法分离筛选对烟草赤星病菌(Alternaria alternate)具有显著拮抗作用的菌株;通过测定细菌产吲哚乙酸(indole acetic acid, IAA)能力和促生盆栽实验筛选促生菌株;通过测定烟草叶片苯丙氨酸解氨酶(phenylalaninammo-nialyase, PAL)、多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)和过氧化物酶(peroxidase, POD)防御反应酶活筛选诱抗菌株,将筛选出的菌株进行形态学、生理生化特征测定和分子生物学方法鉴定,最终使用Box-Benhnken响应面法优化菌群配比,从而构建多功能生防菌群。筛选出的拮抗菌株Xh628A (GenBank No. PQ269269)和促生菌株X5616A (GenBank No. PQ269268)经鉴定均为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis),诱抗菌株Xh649A (GenBank No. PQ269267)经鉴定为皮特不动杆菌(Acinetobacter pittii);优化后菌群的最佳添加比例确定为Xh628A:Xh649A:X5616A=5.0:1.0:4.5,经验证该菌群的平均菌丝抑制率为77.24%,并相比单一菌株其促生和诱抗能力均有提升。本研究为后续开发高效、稳定和环境友好型多功能生物农药提供基础资料,并为多功能生物菌群的构建和配比优化提供科学方法。

鸭沙门菌(Salmonella anatum)是引起鸭沙门菌病的主要病原微生物。rfaH是编码抗转录终止因子RfaH的基因,在细菌转录、感染等生物学特性中具有重要作用。为了研究rfaH基因对鸭沙门菌生长、运动、生物被膜和感染细胞等生物学特性的影响,本研究通过Red同源重组技术,利用鸭沙门菌分离株SA01构建了rfaH基因缺失株ΔrfaH和回补株CΔrfaH。测序结果表明,SA01的rfbH基因缺失株ΔrfaH和回补株CΔrfaH构建成功。rfbH基因缺失后,SA01生长速率不变,但O抗原合成受损,细菌运动能力显著降低,生物被膜形成能力增强,对鸡胚成纤维细胞DF-1细胞的黏附和侵袭能力增强,在小鼠单核巨噬细胞RAW264.7中的增殖能力减弱。研究结果表明,rfbH基因参与沙门菌的运动、生物被膜形成和感染细胞等生物学过程。本研究初步阐明了SA01的rfaH基因的生物学功能,为开发基于鸭沙门菌的递呈载体疫苗提供了理论依据。

棉花(Gossypium spp.)是重要的经济作物,棉花产业在我国乡村振兴、经济发展和民生保障等多方面发挥着重要作用。建国至今,我国棉花的基础研究、农业生产和产业发展均发生了显著变化和巨大进步。其中棉花新品种的选育和利用在棉花产业链发展中占据重要地位。现代分子生物学的快速发展显著推动了棉花生物育种技术的创新,促进了棉花从传统育种到分子育种的迭代升级。同时,棉籽、棉酚等高价值棉产品的创新性研究和研发有力促进了棉花创新价值开发和综合利用的提升。总体来看,我国棉花的基础研究和全产业链一体化发展取得了显著进步,提升了我国棉花的品质和市场竞争力。在科技创新驱动下,我国棉花育种产业将加大结构调整优化和产业升级,实现更高质量的发展。

紫锥菊(Echinacea purpurea)是全世界范围广泛使用的一种极具经济价值的药用植物,具有增强免疫力、抗菌消炎等功效。菊苣酸是紫锥菊最主要的活性成分,也是评价药材质量的关键指标。菊苣酸的积累不仅受自身遗传因素的调控,光照、温度、微生物等环境因素对其合成和积累也有显著影响。本文主要阐述了紫锥菊及其活性成分的功效,并进一步讨论了主要活性成分菊苣酸的合成途径,从遗传特性和多种环境因子出发综述了对菊苣酸合成调控的机制,最后对合理提高紫锥菊活性成分积累的现状和应用前景进行展望。本文能够为紫锥菊资源的合理开发指明新的方向,也对提升药用植物品质与临床疗效有重要的意义。

车前草花叶病毒(Plantago asiatica mosaic virus, PlAMV)和百合斑驳病毒(Lily mottle virus, LMoV)是目前对我国百合(Lilium spp.)产业危害最严重的2种病毒。为建立上述2种病毒的快速高效检测体系,本研究首先提取百合感病植株总RNA,经逆转录获得cDNA,后以cDNA为模板开展双重同步检测体系优化,并对其特异性和灵敏度等进行检测。结果表明,建立的双重同步检测体系对PlAMV和LMoV的特异性扩增片段大小分别为910和521 bp,对其他常见病毒均无扩增,表明所建立方法特异性强;PlAMV和LMoV的最低检出限分别为967.5 fg和59.0 pg,相比于单基因RT-PCR检测的最低检出限(PlAMV 19.35 fg, LMoV 11.8 pg),灵敏度分别降低了50倍和5倍;扩增产物测序片段与不同来源的19个PlAMV分离物和21个LMoV分离物开展BLAST序列分析显示,PlAMV的相似性为86.71%~99.40%,LMoV的相似性为94.75%~99.49%。利用双重同步检测体系对19个田间样品进行检测应用,结果显示,19个样品中有3个样品同时携带PlAMV和LMoV,2个样品携带PlAMV,4个样品携带LMoV,其余10个样品未检出,该结果与基因芯片法检测结果一致。综上所述,本研究所建立的检测体系可同时高效检测PlAMV和LMoV2种病毒,结果可靠,应用前景广阔。

过氧化物酶体增殖剂受体α (peroxisome proliferator activated receptor α, PPARα)作为一个重要的转录调控因子,参与动物脂肪酸氧化、脂蛋白组装和转运、脂质在肝脏中分解代谢等脂类代谢过程,从蛋白质水平上研究PPARα在鸡(Gallus gallus)的脂质代谢中的作用具有重要意义。为了获得PPARα的有效抗体,本研究以大肠杆菌(Escherichia coli)表达鸡PPARα重组蛋白免疫Sprague-Dawley (SD)大鼠(Rattus norvegicus)制备其抗血清,通过Western blot及ELISA检测抗体的效价。结果显示,PPARα重组蛋白在15 ℃和0.06 mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside, IPTG)诱导条件下可在大肠杆菌中实现可溶性表达,Ni²⁺亲和层析获得重组蛋白的纯度约为89%,ELISA检测结果表明,所制备的PPARα抗体的效价约为1:512 000,抗体的Western blot检出灵敏度约为100~200 pg,并能有效地检出鸡肝脏的内源性PPARα。本研究为进一步解析鸡PPARα转录因子对脂质代谢等相关基因的调控功能提供了可靠抗体。

热休克蛋白(DnaK)是生物在受不利因素影响下产生的具有高度保守性的应激蛋白,具有载体和佐剂双重作用,然而目前对滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae, MS) DnaK蛋白研究较少。本研究为制备MS DnaK蛋白的单克隆抗体(monoclonal antibody, MAb)并对其抗原表位进行初步鉴定,构建重组质粒进行重组蛋白表达,并纯化出滑液囊支原体重组蛋白DnaK (rMSDnaK 蛋白),以rMSDnaK蛋白免疫BALB/c小鼠(Mus musculus)。选择抗体水平高的小鼠,分离其脾脏,将脾细胞与骨髓瘤细胞融合,通过有限稀释法和间接ELISA法筛选出状态良好的阳性杂交瘤细胞,将其注射至昆明鼠腹腔后收集并纯化腹水。经SDS-PAGE鉴定,rMSDnaK成功表达。采用间接ELISA法筛选出1株可分泌抗DnaK抗体且稳定性良好的杂交瘤细胞株,命名为6G6。对MAb 6G6亚型进行鉴定,结果为IgG3亚类。纯化后的MAb经间接ELISA法测定效价为1:102 400。Western blot结果显示,MAb 6G6仅与rMSDnaK蛋白发生反应。间接免疫荧光结果显示,MAb 6G6仅与MS发生荧光反应。Western blot结果证明,制备的截短体MS DnaKΔ3-3能够与rMSDnaK蛋白反应,证明单克隆抗体识别的抗原表位区域是C端506~596位氨基酸。本研究成功制备出抗MS DnaK单克隆抗体并对其进行抗原表位鉴定,为后续建立检测MS的双抗夹心ELISA法提供生物材料。

猪流感(swine influenza, SI)是由猪流感病毒(Swine influenza virus, SIV)引起的一种猪(Sus scrofa)急性传染病。近年来,我国主要流行H1N1、H1N2以及H3N2 3种SIV亚型。本研究制备H1和H3亚型SIV的病毒样颗粒(virus-like particles, VLP),并深入鉴定其形态结构及生物学活性。合成编码H1或H3亚型SIV囊膜蛋白—血凝素(hemagglutinin, HA)的基因并连接至表达载体,获得重组质粒并转染至HEK-293T细胞进行表达。同时,合成编码源自超嗜热菌(Aquifex aeolicus)的2,4-二羟基蝶啶合酶(lumazine synthase, LS)的基因,在序列N端引入信号肽及链球菌(Streptococcus)蛋白G (streptococcal protein G, pG)中的免疫球蛋白结合域序列构建pG-LS重组质粒,并通过大肠杆菌(Escherichia coli)和HEK-293T细胞表达系统分别进行表达。将2种蛋白络合后利用透射电镜观察重组蛋白形态以及能否形成VLP;利用动态光散射法测定络合蛋白的平均粒径;利用SDS-PAGE、Western blot和血凝试验对络合蛋白进行生物学活性分析。SDS-PAGE结果表明重组蛋白H1-Fc和H3-Fc均得到正确表达;同时,Western blot及SDS-PAGE分析结果显示原核和真核表达均可得到pG-LS纳米颗粒,且真核表达纯度更高,并用于后续pG-LS-HA病毒样颗粒的构建。将2种蛋白络合后的电镜结果表明,两种病毒样颗粒均呈球形,其直径约为80 nm。对该颗粒的进一步免疫学鉴定及粒径测量结果均证实了病毒样颗粒的成功构建。同时,血凝实验结果表明,仅HA-Fc蛋白存在时未出现血凝,而由该蛋白制备的病毒样颗粒亲和力相比单体蛋白呈指数级增长,可高效凝集不同物种来源的红细胞。本研究成功构建了pG-LS纳米颗粒以及由2种蛋白络合而成的pG-LS-HA病毒样颗粒,可实现简单、高效的HA蛋白表面展示;2种pG-LS-HA均具有稳定的性状及生物学活性,具备大规模投产的应用潜力。本研究制备的H1和H3亚型HA均可有效被展示并组成VLP,为将来使用多亚型流感病毒HA蛋白共展示策略来研制新型多价VLP疫苗提供新的思路。