pEGFP-loxP-Lox2272载体的构建及牛胎儿转基因阳性细胞筛选程序的优化
王帅1 ,赵学明2 ,朱化彬2 ,杜卫华2 ,郝海生2 ,王栋2 ,刘岩3 ,秦彤2 ,王宗礼4
1. 甘肃农业大学动物科技学院；中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
Construction of a Vector pEGFP-loxp-Lox2272 and Optimization of Procedure for Selecting Transgenic Bovine Fetal Fibroblasts
摘要 通过插入型打靶和重组酶介导的盒式交换反应相结合的两步法技术路线将绿色荧光蛋白基因定点整合到牛胎儿成纤维细胞的Y染色体上，并利用体细胞核移植技术生产转基因公牛，在这种转基因公牛生产的精液中，绿色荧光蛋白特异性的富集在Y精子中，利用这种精液生产性控精液能够大幅提高生产效率。本研究通过特殊的引物设计和高保真酶PCR扩增相结合的方法完成了对pEGFP-N3载体的改造，成功的构建了pEGFP-loxp-lox2272载体，同时为载体的改造提供了一种有效的方法。利用pEGFP-loxp-lox2272载体对牛胎儿成纤维细胞进行的转染，利用不同浓度的G418筛选G418抗性细胞克隆点，在G418浓度为600μg/mL的全培养基中筛选到了一些细胞克隆点，利用克隆环将这些细胞克隆点挑取至48孔细胞培养板进行扩大培养，其中的一个细胞克隆点成功的扩大培养至六孔细胞培养板中的一孔。本试验的结果为牛Y染色体基因打靶阳性细胞的筛选工作提供了重要的技术参考。
关键词 ：
绿色荧光蛋白 ,
阳性细胞筛选 ,
基因打靶 ,
盒式交换反应
Abstract ：Green fluorescent protein (GFP) is an ideal marker for cell sorting. Integrating green fluorescent Protein (GFP) into bovine Y chromosome is the key for sorting X and Y sperm by GFP. In this study, one loxp site and one Lox2272 site were inserted into the vector pEGPP-N3 through special designed primers amplified by high-fidelity enzyme and the vector pEGFP-loxp-Lox2272 was constructed. The bovine fetal fibroblasts were transfected with linearized pEGFP-loxp-Lox2272 by LipofectamineTM (Lip) 2000. The results revealed that the best transfected effect was mediaed by 3 μL Lip 2000 and the best concentration of G418 for screening transgenic cell clones was 600 μg/mL. This study provided a useful method for constructing vectors and important reference for screening bovine gene-targeted cell clones.
Key words ：
Green fluorescent protein
Gene targeting
Selecting transgenic clone cells
Recombinase-mediated cassette exchange
收稿日期: 2011-01-28
通讯作者:
王宗礼
引用本文:
王帅1 ,赵学明2 ,朱化彬2 ,杜卫华2 ,郝海生2 ,王栋2 ,刘岩3 ,秦彤2 ,王宗礼4 . pEGFP-loxP-Lox2272载体的构建及牛胎儿转基因阳性细胞筛选程序的优化[J]. , 2011, 19(4): 711-718.
链接本文:
http://journal05.magtech.org.cn/Jwk_ny/CN/ 或 http://journal05.magtech.org.cn/Jwk_ny/CN/Y2011/V19/I4/711
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